高中生物“基因工程”基础检测【填空版】

基因工程

第1节 重组DNA技术的基本工具

一、基因工程：

概念：是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源 目的基因  与  载体DNA   进行组合形成重组DNA，然后导入  受体细胞  ，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。

操作对象：   基因   ；       操作水平：   分子水平   ；   原理：  基因重组   ；

操作过程： 剪切  → 拼接→  导入→表达；

意义：   定向改造生物性状    ；克服远缘杂交不亲和障碍

二、重组DNA技术的基本工具

1、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”

1）来源：主要是从 原核生物  中分离纯化来的

2）作用：能够识别双链DNA分子的  特定核苷酸序列   ，并且使每一条链中特定部位的  磷酸二酯键  断开（具有专一性）

3）作用位点：  磷酸二酯键   。

4）作用结果：产生 黏性末端    或    平末端  （注意：不同的限制酶可能切割形成  相同黏性末端）

2、DNA连接酶——“分子缝合针”

1）作用：将切下来的  DNA片段  拼接成新的DNA分子，恢复两个脱氧核苷酸之间的  磷酸二酯键  。

2）种类：E.coli DNA连接酶（只连接_黏性末端__）和T4 DNA连接酶（缝合_黏性末端__和  平末端  ）

3）比较与DNA相关的几种酶

3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

1）作用：将  外源基因   送入  受体细胞  ，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

2）载体的种类：  质粒    （最常用）、  噬菌体  或动物病毒

3）载体需具备的条件：

①  稳定  存在并能 自我复制  或整合到受体DNA上（能使目的基因稳定存在且数量可扩增）。

②有  一个至多个  限制酶切割位点（供外源DNA片段（基因）插入其中）

③具有特殊的 标记基因  （目的：便于重组DNA分子  的筛选）；  

④对受体细胞 无害  、易分离

三、DNA的粗提取与鉴定

1、提取DNA的原理： 

①DNA 不溶于  酒精（体积分数为95%），但某些蛋白质  溶于  酒精；

②DNA在不同浓度的NaCl溶液中 溶解度  不同，DNA能溶于  2mol/L 的NaCl溶液。

2、鉴定DNA的原理：在一定温度下（沸水浴），DNA遇  二苯胺   试剂会呈现  蓝  色。

3、试剂作用：酒精：  析出DNA   ；2mol/L 的NaCl溶液：     溶解DNA   ；

第2节 基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序（主要包括四个步骤）：

目的基因的  筛选与获取 →   基因表达载体的构建→ 将 目的基因导入  受体细胞→ 目的基因的 检测与鉴定

一、目的基因的筛选与获取

1、目的基因

1）概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变  受体细胞性状  的或获得预期表达产物的基因。

2）实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是  Bt抗虫蛋白基因  。

2、筛选合适的目的基因

1）明确目的基因的方法：

①较为有效的方法：从相关的已知  结构   和  功能   清晰的基因中进行筛选。

②技术手段：   测序技术、序列数据库、序列比对工具

2）获取目的基因的方法：①通过构建  基因文库  来获取目的基因；②人工合成目的基因

③利用  PCR  特异性地快速扩增目的基因

3、利用PCR获取和扩增目的基因

1）PCR的含义（中文名: 聚合酶链式反应）：它是一项根据 DNA半保留复制 的原理，在体外提供参与  DNA复制  的各种组分与反应条件，对目的基因的  核苷酸序列  进行大量复制的技术。

2）基本条件：   DNA模板 （提供DNA复制的模板）、  2种引物   （为DNA聚合酶提供了游离的3'端）、

四种脱氧核苷酸   （合成子链DNA的原料）、   Taq DNA聚合酶   （催化合成DNA子链）。

3）PCR反应过程：  变性   →   复性   →   延伸  

①变性：

当温度上升到__90℃_以上时， 氢键断裂，双链DNA解聚为两条  单链DNA  。

②复性：

当温度下降到   50℃  时，两种引物通过  碱基互补配对（原则）与两条单链DNA结合。

③延伸：

当温度上升到  72℃  左右时，溶液中的4种___脱氧核苷酸___在耐高温的__ DNA聚合酶_的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

4）PCR的结果：每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。（即成 指数  形式扩增（约为 2ⁿ，其中n为扩增循环的次数）

5）PCR产物的鉴定：常采用  琼脂糖凝胶电泳  来鉴定PCR的产物。

拓展：PCR技术与DNA复制过程比较

二、基因表达载体的构建

1、操作目的：

使目的基因在受体细胞中  稳定遗传    ，并且可以遗传给下一代；

使目的基因能够在受体细胞中   表达 和 发挥  作用。

2、基因表达载体的组成及其作用：

一个基因表达载体的组成，除了  启动子 、 终止子 外，还必须有 标记基因  、复制原点等(如图所示)。

三、将目的基因导入受体细胞

1、将目的基因导入受体细胞的方法 ：

①导入植物细胞：花粉管通道法、 农杆菌转化法   ；   ②导入动物细胞：  显微注射法   ；      

③导入微生物细胞：    Ca2+处理法 （使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态）。

2、农杆菌转化法

该过程经过  两次拼接、 两次导入：

①第一次拼接：将 目的基因  拼接到Ti质粒的 T-DNA上

②第二次拼接：农杆菌将插入 目的基因的T-DNA 拼接到受体细胞染色体的  DNA上  上（非人工操作）

③第一次导入：将含目的基因的  Ti质粒 重新导入农杆菌④第二次导入：农杆菌将含    目的基因的T-DNA   导入

受体细胞（非人工操作）

四、目的基因的检测与鉴定

1、目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其   遗传特性   。

2、分子水平的检测：

(1)导入水平：   ①检测目的：检测受体细胞的  染色体的DNA  上是否插入了  目的基因   。

②技术手段： PCR  等技术。

(2)转录水平：   ①检测目的：检测目的基因是否转录出了  mRNA  。

②技术手段：  PCR 等技术。

(3)翻译水平：   ①检测目的：检测目的基因是否   翻译成蛋白质   。

②技术手段：   抗原-抗体杂交检测   技术。

3、个体水平的鉴定

(1)鉴定目的：检测个体是否具有  相应性状   。

(2)鉴定方法：   抗虫鉴定  （如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫）、  抗病鉴定  、活性鉴定等。

（注意：基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象）

探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定

1、实验原理

（1）PCR在体外进行DNA片段的扩增原理：

PCR利用了__DNA的热变性原理___和___DNA半保留复制__的原理。

（2）DNA片段电泳鉴定的原理：

①DNA分子具有 可解离的基团，在一定的 pH  下，这些基团可以带上 正电荷  或 负电荷  ，在_电场_的作用下，这些__带电分子__会向着与它所带电荷_相反_的电极移动，这个过程就是 电泳。

②在凝胶中DNA分子的迁移速率与__凝胶的浓度__、_DNA分子的大小_和 构象等有关。凝胶中的DNA分子通过 染色，可以在波长为  300nm  的紫外灯下被检测出来。

2、实验步骤

（1）DNA片段扩增的具体过程：

①移液→ ② 离心（将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部）→③  反应  

（2）PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程：

①制备凝胶：  融化（一般配制质量体积比  0.8%～1.2%  的琼脂糖溶液）→   倒模  （并插入合适大小的梳子，以形成加样孔）→   凝固  （待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内）

②进行电泳：  加液  （电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜）→  加样  （扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，缓慢注入凝胶的加样孔内）→   电泳   

③观察鉴定：（取出凝胶置于  紫外灯下观察和照相）

第3节 基因工程的应用

基因工程的应用包括有在  农牧业  、医药卫生、（工业、环境、能源）和  食品工业  等方面的应用。

一、基因工程在农牧业方面的应用

1．在农牧业方面的应用有：

用于生产 转基因抗虫植物（如转基因棉花、玉米、大豆和马铃薯）；

转基因抗病   植物（如：转基因番木瓜和烟草等）；

转基因抗除草剂  植物（如：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等）；

改良植物的品质（如：提高营养价值与观赏价值）；

提高  动物的生长速率   （如：生长速率可提高42%-115%的转基因鲤鱼）；

改善畜产品的品质（如：大降低牛奶中  乳糖 的含量，解决乳糖不耐受问题）；

2．在医药卫生方面的应用有：

(1)技术方法

①对微生物或动植物的细胞进行基因改造  ，使它们能够生产药物。

②利用乳腺生物反应器生产药物：将  药用蛋白基因  基因与乳腺中特异表达的基因的  启动子  等调控元件重组在一起，通过显微注射 方法导入哺乳动物的受精卵中，培育出的转基因动物通过分泌 乳汁  来 生产所需要的药物。

③培育移植器官：在器官供体的基因组中导入某种调节因子抑制  抗原决定  基因的表达或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆 技术，培育出不会引起免疫排斥  反应的转基因克隆器官。

(2)实例：重组人干扰素、促红细胞生成素、抗凝血酶、血清白蛋白等。

（注意：与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器的优点是从转基因动物一出生就可以收集产物，不用考虑动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显著的优势在于从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。）

3．在食品工业方面的应用有：

1）阿斯巴甜是一种普遍使用的甜味剂，主要由  天冬氨酸和  苯丙氨酸形成，这两种氨基酸就可以通过基因工程实现大规模生产。

2）科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过  工业发酵  批量生产凝乳酶。

3）通过构建  基因工程菌   ，然后用发酵技术大量生产食品工业用酶。相比从天然产物中提取的酶,用基因工程技术获得的工业用酶的纯度更高，而且它的生产成本显著降低，生产效率较高。

拓展：乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别

第四节蛋白质工程的原理和应用

一、蛋白质工程崛起的缘由

1、基因工程的实质及不足：

实质：将一种生物的  基因 转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的 蛋白质  ，进而表现出 新性状 。

不足：基因工程在原则上只能产生自然界中  已存在 的蛋白质

2、天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合  特定物种 生存的需要，却不一定完全符合 人类生产和生活 的需要。

二、蛋白质工程的概念分析

（1）基础：蛋白质分子的 结构规律  及其与 生物功能  的关系。

（2）手段：通过 改造 或  合成基因 ，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。

（3）操作对象： 基因  。（注意：不是直接改造蛋白质）

（4）目的：获得满足人类的生产和生活需求的  蛋白质  。

三、蛋白质工程的基本原理

1、目标：根据人们对蛋白质 功能 的特定需求，对蛋白质的  结构  行设计改造。

2、实质：改造或合成  基因   ，来定向改造现有蛋白质，或制造新的蛋白质。

3、基本思路（中心法则的逆推，与天然蛋白质合成的过程相反）：

四、蛋白质工程的基本应用

1、医药工业方面

（1）研发速效胰岛素类似物

天然蛋白质易形成二聚体或六聚体 → 预期功能：  抑制胰岛素的聚合作用→设计结构：改变B链第20～29位氨基酸组成 → 推测序列：B28位脯氨酸替换为__天冬氨酸__或将它与B29位的_赖氨酸_交换位置→改造形成新胰岛素基因 → 转录形成mRNA → 翻译形成多肽链 → 折叠形成___蛋白质（预期结构）___ → 行使功能：有效  抑制   胰岛素的聚合。

（2）延长干扰素体外保存时间

天然干扰素不易保存→预期功能： 延长  保存时间 → 设计结构：氨基酸替换 → 推测序列：一个半胱氨酸变成__丝氨酸___ → 改造形成新干扰素基因 → 转录形成mRNA → 翻译形成多肽链 → 折叠形成_蛋白质（预期结构）_ → 行使功能：在  -70℃ 下可以保存半年。

（3）降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应

通过__改造基因__，将小鼠抗体上结合__抗原_的区域（即可变区）“嫁接”到人的__抗体__（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会_减低_很多。

2、其他工业方面

蛋白质工程被广泛用于__改进酶___或开发新的工业用酶。如枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。迄今为止，利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。

3、农业方面

（1）_改造__某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加粮食的产量。

（2）利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的  结构  ，使它防治病虫害的效果   增强   。

蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的_高级结构__，而这种___高级结构____往往十分复杂。要设计出更加符合__人类需求_的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。

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