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专题 24 基因工程
考 点 链 接
考点1 重组DNA技术的基本工具
1．切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶，这类酶主要是从原核生物中分
离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部
位的磷酸二酯键断开，产生黏性末端或平末端两种形式的末端。
2．DNA连接酶分为两类，一类是E.coli DNA连接酶，另一类是T4DNA连接酶。后者既可以
“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接
平末端的效率相对较低。
3．质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核 DNA之外，并具
有自我复制能力的环状双链DNA分子。
4．在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造
的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于
重组DNA分子的筛选。
5．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在
大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
6．载体必须具备的条件：①能在受体细胞中保存下来并能自我复制；②具有 1个或多个限
制酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有标记基因。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离 DNA与蛋白质。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。在一定温度下，
DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
考点2 基因工程的基本操作程序
1．培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、
将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
2．PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参
与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
3．PCR技术可以分为变性、复性和延伸三步。
4．PCR反应过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂
糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
5．基因表达载体要包括以下四个基本的结构：目的基因、启动子、终止子、标记基因。
6．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同
时，使目的基因能够表达和发挥作用。
7．启动子位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。
8．标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选
出来。（或供重组DNA的鉴定和选择）。9．花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的 DNA溶液直
接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将 DNA溶液滴加在花柱切
面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的
方法还有农杆菌转化法。
10．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
11．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，
而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，
能将Ti质粒上的T－DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细
胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中，
通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
12．检查转基因抗虫棉是否培育成功，首先是分子水平的检测，包括通过 PCR等技术
检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基
因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测 Bt基因是否翻译成Bt抗
虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂
棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
13．在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
14．将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的
受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。在基因工程操作中，常用原核生物
作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细
胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达
载体导入其中。
考点3 基因工程的应用
1．科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过
显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳
期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
2．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。
3．目前，科学家正尝试利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体
的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，
然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
考点4 蛋白质工程的原理和应用
1．蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或
合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2．基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化
过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产
和生活的需要。
3．蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应
有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所
需要的蛋白质。真 题 回 顾
1．（2023·江苏·统考高考真题）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是
（ ）
A．洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D．粗提取的DNA溶于2mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
2．（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复
（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受
阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述
错误的是（ ）
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行
C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
3．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因
（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶
酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是
（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中
能形成菌落
4．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因
（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质
的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得
的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙
所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
5．（2023·广东·统考高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离
→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
6．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连
接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、
连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接
7．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用
重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增
程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转
化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F
和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可
以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是
。
8．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源
于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用
胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来
源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA
的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短
时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每
隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标
记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从点到 点。
(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导
型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以
下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基
因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；
③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④
口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线：
→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t）是途径Ⅱ细胞周
1
期时长（t）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t 时间后换用BrdU饲喂，
2 2
再过t 时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源
2
于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。
9．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室
合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1
与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。回答下列问题。
(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需
要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的
。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是
。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/
Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导
入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的
方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，
依据是 。
(5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是 （答出2点即可）。
10．（2023·浙江·统考高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食
物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖
氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基
中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变
体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核
移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的
基因），可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与
BEF膜发生 ，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核
后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了
重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，
直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以
为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛
乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对
总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用
特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而
不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
11．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分
解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的
基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因
直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已
知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，
则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧
啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，
需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在
UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA基因进行切除。
C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可
以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。（ii）切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该
如图 。
12．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了
检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还
需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若
仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由
此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相
同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是
否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达
的。
13．（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该
病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所
示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不
需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中
PEG对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对
和 生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
14．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的
使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组
乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回
答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导
入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是
。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提
取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
15．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基
因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程
包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得
高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体
是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进
行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植
体。
(2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行
去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体
的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密
度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过
量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散
固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于
。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再
生植株。
(5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具
有特异性DNA序列b；M、M 为序列a的特异性引物，N、N 为序列b的特异性引物。完善
1 2 1 2
实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方
法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预
期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
16．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟
南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型
DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与
其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，
则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备
。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可
以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位
点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因
与表型的关系。
①农杆菌转化T 代植株并自交，将T 代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性
0 1
个体即表示其基因组中插入了 。
②T 代阳性植株自交所得的T 代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约
1 2
%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T 代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体
2
杂交”）所得的T 代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养
3
基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增
野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行
突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。新 题 尝 鲜
1．（2023春·高二课时练习）从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插
入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（ ）
A．②，BamHⅠ B．①，EcoRⅠ
C．①，EcoRⅠ和HindⅢ D．②，EcoRⅠ和HindⅢ
2．（2023春·高二课时练习）下列关于基因工程各种工具的叙述，错误的是（
）
A．E .coliDNA连接酶只能“缝合”黏性末端
B．限制酶主要来自原核生物，限制酶一般不切割自身DNA
C．载体上必须有2个以上限制性内切核酸酶的切割位点
D．限制酶断开磷酸二酯键，T4DNA连接酶能恢复磷酸二酯键
3．（2023秋·河南·高三校联考开学考试）水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要
施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥
厂”,让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述
错误的是（ ）
A．PCR 技术可用于固氮基因的获取和检测
B．实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选
C．为了提高 PCR 扩增固氮基因的特异性，可适当增加引物长度并降低复性温度
D．PCR 实验中使用的微量离心管和枪头等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
4．（2023秋·重庆万州·高三重庆市万州第二高级中学校考阶段练习）图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是（ ）
A．若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切
C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2+转化法
D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
5．（2023春·高二课时练习）科学家运用基因工程技术，将人血清白蛋白基因导入山羊
的受精卵中，培育出羊乳腺生物反应器，使羊乳汁中含有血清白蛋白。以下相关叙述正确
的是（ ）
A．该转基因羊中的血清白蛋白基因只存在于乳腺细胞中
B．可用显微注射技术将含有目的基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中
C．血清白蛋白基因需要与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件进行重组
D．利用乳腺生物反应器生产药物不受性别和生殖期的限制
6．（2023春·河南许昌·高二校考期中）蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强
的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等，还可被制成人造韧带等。科学家研究出集中
生产蜘蛛丝的方法—一培育转基因蜘蛛羊作为乳腺生物反 应器。下列有关乳腺生物反应器
的说法，错误的是（ ）
A．将蜘蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等结合在一起构建成表达载
体
B．将含有丝蛋白基因的表达载体导入动物乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器
C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛
D．转基因动物产生的生殖细胞中可能含有药用蛋白基因
7．（2023春·高二课时练习）下列有关生物工程的叙述，不正确的有（ ）
①基因工程的核心步骤是构建基因表达载体
②蛋白质工程可通过直接改造蛋白质的结构从而改变其功能
③克隆羊的培育涉及细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
④PCR技术需要酶打开DNA双链
⑤利用核移植技术可以培育试管婴儿
⑥牛胚胎发育的历程是：受精卵→桑椹胚→囊胚→原肠胚→幼体
⑦利用动物细胞培养技术和细胞融合技术可以制备单克隆抗体
③利用植物茎尖培养脱毒苗时，需要对离体的茎尖、培养基等进行灭菌
A．一项 B．两项 C．三项 D．四项
8．（2023春·高二课时练习）天然胰岛素制剂容易发生聚合，会在一定程度上延缓药效。
科学家通过蛋白质工程将胰岛素B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨
酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素。下列说法错误的是（）
A．设计速效胰岛素首先要从避免胰岛素形成聚合体这一预期功能开始
B．该过程通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改造
C．速效胰岛素在受体细胞中合成时遵循中心法则
D．该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，可直接生产有生物活性的胰岛素
9．（2023秋·福建龙岩·高三上杭一中校考阶段练习）为使水稻获得抗除草剂性状，科
研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。
注：GUS基因表达产物经染色能从无色变成蓝色
(1)将草甘膦抗性基因作为 ，与Ti质粒用相同的 和DNA连接酶处理构建基
因表达载体。
(2)用 处理农杆菌后获得感受态细胞，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添
加 的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
(3)取某品种水稻的幼胚，先进行 处理，然后接种到培养基中，水稻幼胚细胞发生
形成愈伤组织。用含基因表达载体的农杆菌侵染该愈伤组织。
(4)PCR扩增时需要根据草甘膦抗性基因序列设计 种引物，引物是
。
(5)利用PCR技术，可以鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有草甘膦抗性基因。草甘膦抗性基
因的部分序列如下：
5’---ATGGCT………AGGAAC---3’
3’---TACCGA………TCCTTG---5’
根据上述序列应选择引物 （填字母）进行PCR。
A．引物：5’-TACCGA-3’ B．引物：5’-GTTCCT-3’
C．引物：5’-AUGGCU-3’ D．引物：5’-ATGGCT-3’
(6)除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外，还可以利用GUS基因表达产物的鉴定进行
图中的筛选2，以确定目的基因是否 。两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的
过程，获得转基因水稻。
10．（2023秋·浙江·高三校联考开学考试）研究者改造与肠道共生的大肠杆菌，口服该
工程菌后激活机体特异性免疫，实现肿瘤的预防和治疗。部分肠道细菌能够分泌外膜囊泡
（OMV），OMV能穿越肠道上皮屏障活化肠黏膜内丰富的免疫细胞（如图1）。细菌溶素A
（ClyA）是外膜囊泡上含量较高的特异蛋白。(1)构建表达载体：研究者利用含图2所示元件的表达载体转化大肠杆菌制备工程菌，ClyA
基因的作用是表达ClyA，使 定位至OMV表面；Fc表达产物能够与树突状细胞表面的
特异性受体结合，提高树突状细胞 OMV的能力。
(2)工程菌的制备与培养：为了便于将表达载体导入大肠杆菌，可用CaCl 处理，以提高细
2
菌 （结构）的通透性。然后将已改造的工程菌置于LB 培养基中培养，并不断进
行搅拌。
(3)检测：可用核酸分子杂交技术，或先对融合基因进行 ，然后再进行凝胶电泳加以
鉴定。琼脂糖凝胶的孔隙可起到 的作用，一般来说，DNA分子量越小，配制琼脂糖凝
胶的浓度越 。凝胶浸没于电泳缓冲液中，电泳缓冲液的作用是 。DNA本身是无
色的，可以用 将DNA染色。如果最终在凝胶上出现多个条带，推测可能的原因有
。（写出两点）
(4)使用：患者应将工程菌与 一同口服，在肠道繁殖并表达后，使人体产生对 的
特异性免疫反应。
