文档内容
专题突破 10 综合 PCR 的基因工程问题
阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不
课标要求
同的PCR技术有着不同的应用。
2023·江苏·T22 2023·山东·T25 2022·江苏·T24
2022·山东·T25
考情分析 几种不同PCR的应用
2021·全国甲·T38 2021·山东·T25 2020·北京·T12
2020·江苏·T33
类型一 利用PCR技术获取目的基因
基本模型
获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异
性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的
原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大
量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔
化学奖。
典例突破
1．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用 PCR技术特异性地拷贝“X
基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图 1所示。
下列叙述错误的是( )
A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子类型二 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
基本模型
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标
记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实
际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的
巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
典例突破
2．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟
设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR
鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中
扩增出了400 bp片段，原因是____________________。
类型三 利用PCR技术引导基因定点突变
基本模型
重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成
了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基
因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
典例突破
3．水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水
蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第 47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)
替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物
2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链DNA)。
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引
物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将
引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_______________________________
______________________________________________________________________________。
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的 DNA片段拼接起来。有人想利用该技
术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M 、M ，基因N的引物N 、N 。在设计
1 2 1 2
这 4 种 引 物 时 ， 特 别 要 注 意 的 问 题 是
__________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。
类型四 利用PCR技术扩增未知基因序列
基本模型
利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。
典例突破
4．(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出
已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种______________酶，它通过识别特定的________________切割
特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________；
PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化
________________________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
PCR引物
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
类型五 利用PCR技术快速检测病原体
基本模型
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发
展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能
够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。
典例突破
5．(2024·烟台高三一模)人类猴痘由 Yaba猴病毒(双链DNA病毒)引起，实时荧光定量
PCR(qPCR)可用于Yaba 猴病毒的快速检测。进行qPCR 时，在反应体系加入 Taq man探
针，Taq man探针两端连有荧光基团(R)和抑制荧光发出的淬灭基团(Q)，完整的Taq man探
针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光(如图所示)，随循环次数的增加，荧光信
号强度增加。
(1)采用 qPCR 检测Yaba 猴病毒需在一定的__________溶液中才能进行，反应体系中还需
提供DNA模板、原料、__________、Taq man探针、Taq DNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR过
程 中 ， Taq DNA 聚 合 酶 的 两 个 作 用 是
____________________________________________________
______________________________________________________________________________。
(2)qPCR检测病毒的核酸一般具有特异性强和灵敏度高的特点，这与反应体系中加入的
__________和__________有关。但有时也可能会出现“假阴性”的结果。可能的原因有
_______________________________________________________________________________
___________________________________________________________________(答出两点)。
(3)在PCR反应体系中一般都要加入Mg2＋，原因是____________________________。为了探
究Mg2＋对PCR扩增效果的影响，科研人员在PCR反应体系中加入不同浓度的Mg2＋进行了实验。结果如图所示，据此可得出的结论有
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________。
