实验新手必读(二):PCR设计宝典、软件应用、操作细节…..

当然首推的经典之法就是让Premier5携手oligo，共同设计PCR引物。

1\以小鼠的IL-17为例，进入NCBI界面,选择Nucleotide后，输入IL-17，点击search。

然后选择人类IL-17的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，选定目的序列。

2、打开Primer Premier5软件，点击菜单栏File|New|DNA Sequence，在出现的对话框里黏贴目的序列，并在paste对话框里选择As Is，点击OK。

3、点击Primer，弹出菜单后点击search按钮。

在弹出的Search Criteria中，选择PCR primers，Pairs 参数，并选择所需

PCR产物长度，点击OK。

在弹出的search progress菜单中，点击OK。

4、在搜索出的结果列表里选择Rating值高，bug较少的引物#1，在Primer Premier中选择S（正义链）/A（反义链），点击edit primer，将所得引物改成为Rating值为100，无bug的引物，即无发夹（Hairpin）、无二聚体（Dimer）、无错配（False Priming）和交叉配对（Cross Dimer）的引物。

5.点击菜单栏中Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer，即可得到设计的引物。

Anti –sense Primer: 5′  GGTGGTCCATCTTTCCCT  3′

6.接下来，就要用Oligo软件验证评估Premier5软件所设计的引物，打开Oligo界面如下：

单击菜单栏里File∣New Sequence可打开以下窗口，并将设计好的上游引物黏贴在空白框里。

7.点击菜单栏里Accept/Discard中的Accept，则会出现Tm、△G和Frq三个窗口, △G值反应了序列与模板的结合强度，最好引物的△G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对较低。

8、点击菜单栏里的Select中的Upper Primer将当前引物设置为上游引物。同时点击菜单栏里的Edit中的“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列。

9、最后，在菜单栏中Analyze完成引物△G值、Tm值、引物二聚体和发夹结构的分析后，可将引物序列送至公司进行合成即可。

然而，此法虽好，但是下载软件总归是件麻烦事儿！有木有更简单粗暴的设计引物的方法呢？答案是YES！有！这3款简单实用的在线PCR引物设计软件可以说是懒癌晚期患者的福音。

3款简单实用PCR引物设计软件

No.1 NCBI的Primer-Blast

1、打开以下网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 进入Primer-Blast界面，开始引物的设计。

2、验证引物好坏

3、外显子内含子（Exon/intron）

如果设计的引物是跨内含子和外显子的交界处，可在此处设置成为Primer must span an exon-exon junction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。

4、特异性（Specificity check）

在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。其中，数据库中的RefSeq mRNA和Genome (reference assemblies from selected organisms)是经过专家注释的数据，可得出更准确的结果。

5、最后建议用oligo6或primer5验证引物自身的特性：发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体，△G的绝对值。

No.2 Primer3 Plus

点击Run latest Version of Primer3Plus进入了设计引物的主页面。

2、在General Settings中，依照引物设计原则，设置产物长度（<=400bp，最好100-150bp）、GC％（最好为45%－55%）、引物长度（最好为22-24bp）、TM值（58-60℃，最好60℃）。

3、点击右上放绿色按钮，可获得若干对引物，并按照5’到3’的顺序，包含了引物和产物的一些基本参数。此时，应尽量选择G、C结尾的引物进行合成。

4、设计好引物后，仍需用NCBI blast 引物验证，点击http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi可出现以下界面。

5、点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项，在下面框中，按照5’－3’顺序，分别输入上游引物和下游引物，上下游引物之间间隔20个以上n。

6、选择物种数据库，如Human，Mouse或者Others（如果是非人和非小鼠物种）。

7、选择Somewhat similar sequences(blastn)

8、点击Algorithm parameters, 在Expect threshold 输入1000，在Word Size（读长）输入7，便可按照7个一组核苷酸序列放到GeneBank中进行比对。 

9、点击BLAST进行比对得出结果。颜色代表得分，选择引物的原则是：列表中大部分是目的基因，说明引物特异性高；但是可能物种不同，说明该基因在不同物种中保守。

No.3 Primerbank

1、点击该网址：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/，进入搜索界面。搜索类型这里，可以根据GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六个选项进行搜索。

2、以小鼠的beta-actin为例。首先到NCBI上找出β-actin的gene ID，如图，选择gene,输入beta-actin，并点击Results by taxon中的Mus musculus，可得到以下结果。

小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461，而actb则是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。

3、将Gene ID:11461输入到primerbank点击submit，可得到以下结果。

4、往下拉动滚动条，还可看到经过验证的引物，点击Validation Results，即可看到溶解曲线、电泳结果等信息。

1、最好使用一次性进口tip头，以避免液体残留；同时，tip头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。

2、加样时，tip头要伸入PCR反应管的液面下一点，然后将液体缓缓打入液面下，至恰好打出一个小气泡为至；加样过程最好在冰块上操作；移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性，而导致加样量的不准确。 

3、配制反应体系时，若反应物为冻结制品，需在融解后上下颠倒轻轻均匀混合；加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均；按照液体体积由大到小的顺序将反应物加入到PCR管中；引物和模板和体系所加的比例要合适，模板过量反而会抑制体系的反应。

4、 操作多份样品时，可先制备反应混合液，即将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好后分装，这样即可避免污染，又可增加反应的精确度。 

5、避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心；PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

可是有时即便小伙伴们将上述实验细节处理的妥妥当当的，依然等不来奇迹发生的时候，各种非特异性条带、拖带等糟心的实验结果纷纷出来给大家心中添堵。在此，小鱼归纳了几类PCR常见的问题，并将其相应的解决方法分享给大家。

Q1：PCR产物出现假阳性（即空白对照出现目的扩增产物）

Answer：

1）引物设计不合适：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可扩增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可导致假阳性。此时需重新设计引物。

2）为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂及器材应高压消毒，所有离心管及加样枪头等均应一次性使用；必要时，加样前反应管和试剂均用紫外线照射，以破坏存在的核酸；

Q2：PCR产物中出现假阴性或无扩增产物（即阳性对照中有条带，而样品则无条带）

Answer:

1）条带放置时间过久,核酸被降解，最好在48h内进行电泳检测。

2）DNA模板纯度低，如含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂，此时可对DNA进行再次纯化或重新用优质试剂盒提取DNA; DNA浓度太低时，可以加大模板量；对具有二级结构DNA使用较好的聚合酶；提取DNA时，避免吸入酚类试剂。

3）对设计不合理的引物进行重新设计合成；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融而降解失效；检测引物OD值并进行电泳检测以确保两条引物浓度一致。

4）酶失活时，可更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

5）PCR反应条件：提高变性/退火温度；适当增加循环次数。如果反应系统中污染了蛋白酶及核算酶，则在未加Taq酶以前，将反应体系95℃ 加热 5~10 分钟。

6）Mg2+浓度过低可影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，而Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，因而可适当提高Mg2+浓度。

Q3：非特异性条带扩增或者条带出现拖尾现象

Answer：

1）当引物特异性差或引物形成二聚体时，可重新设计引物或者使用巣式PCR。

2）若模板或引物浓度过高，可适当降低模板或引物浓度，如质粒DNA<50ng，基因组DNA<200ng。

3）酶量过多，则适当减少酶量；酶质量差，可调换另一来源的酶。

4）Mg2+浓度偏高，则降低镁离子浓度。

5）退火温度偏低，适当提高退火温度或使用二阶段温度法（94℃变性，65℃左右退火与延伸）

6）循环次数过多，不仅会降低扩增效率，且会使错误掺入率增加，因此需要减少循环次数。

7）电泳体系有问题：凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；凝胶没有凝固好；琼脂糖质量差。

Answer:

四种策略：1）巣式PCR（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性。

2）递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2，直到退火温度低于Tm 5 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。

3）热启动PCR：抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪到达变性温度。如在冰上配制PCR反应液以抑制Taq酶活性，后将其置于预热的PCR仪中。

最后，小鱼把这首魔性的PCR之歌送给大家，与君共勉！