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以温州模拟题为例,如何解答选择性必修3基因工程有关的试题?
（1）LfcinB 易导致原核宿主裂解死亡，因此往往需要带负电的蛋白(APBSP)与 LfcinB 相连接形成融合蛋白，以防止这一现象的发生，原因是 ▲ 。
答案：中和 LfcinB的正电荷，抑制其对原核宿主的杀伤作用（或提高分子量，增加产物的稳定性）
解析：通过构建融合基因表达融合蛋白，再裂解提纯目标蛋白，原因有多方面。该答案来自于试题题干的理解，属于利用基因工程技术制备LfcinB，以期获得更高效率的生产应用的原理。通过融合基因策略，可在提升目标蛋白表达量与稳定性的同时简化下游工艺，该技术已成为生物制药和基础研究的标准化手段。
（2）APBSP-LfcinB 基因片段的合成和扩增。利用 PCR技术获取 APBSP-LicinB 融合基因（获取过程如图1）并扩增，PCR 时，引物可以 ▲ (A.为Taq DNA 聚合酶提供结合位点 B.决定扩增产物大小 C.决定反应的特异性 D.决定变性时间)。以融合基因表达获得的融合蛋白，为方便除去 APBSP 蛋白而仅获得 LfinB，需在融合蛋白连接处引入甲酸裂解位点(对应的 mRNA 序列为 5'-GACCCA-3')。因此在 PCR 扩增 APBSP 基因时，需在 ▲ (填“引物1”或“引物 2”)的 5"端引入甲酸裂解位点的对应序列，其在引物中对应的序列为 5' ▲ 3'。
答案：ABC 引物2 TGGGTC
解析：PCR反应中引物的作用有：引物的3‘端为Taq DNA 聚合酶提供结合位点，是基因转录的起点，即引物为Taq DNA 聚合酶提供结合位点；引物决定扩增片段的起点和终点，即决定扩增产物大小；扩增哪个DNA片段需要由引物来决定，即决定反应的特异性。
除去 APBSP 蛋白而仅获得 LfinB，考虑的应该是融合之前两基因的连接处，即引物2。连接处甲酸裂解位点对应的 mRNA 序列为 5'-GACCCA-3'，模板链的碱基序列应该是5'-TGGGTC-3'，编码链与模板链碱基配对，引物2和编码链碱基配对，因此，引物2的碱基序列与模板链相同，即5'-TGGGTC-3'。该答案主要还是考查基因的表达碱基之间的配对，链之间的方向性。
（3）重组载体的构建与克隆。所用表达载体(图2)可将M 和N之间的片段整合到酵母菌的染色体上，其中 M 是甲醇诱导型启动子、Q是终止子。将酶切的质粒与融合基因连接构建重组质粒，并导入大肠杆菌。将大肠杆菌接种至含▲ 的LB培养基中培养和筛选。
答案：氨苄青霉素
解析：重组质粒导入大肠杆菌的筛选还是需要通过标记基因氨苄青霉素抗性基因。也有学生问，氨苄青霉素抗性基因不在启动子和终止子内，怎么会填写这个答案呢？原因在于氨苄青霉素抗性基因的启动子和终止子往往是自带的，高中生物学教材中没有提及到这方面知识。可以参考相关阅读：
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（4）重组质粒导入酵母菌。利用图中的限制酶 ▲ 处理重组质粒，使其线性化，线性化处理的目的可能是 ▲ 。在低温条件下，将线性化重组质粒与一种毕赤酵母(甲醇营养型酵母菌，且是组氨酸缺失突变体)混合，在50%聚乙二醇溶液中进行短暂的 ▲ 处理，实现对毕赤酵母的转化。然后将其接种于不含 ▲ 的培养基，筛选出导入重组质粒的毕赤酵母。
答案：Sacl 有利于导入酵母菌并整合在酵母菌染色体上 热刺激 组氨酸
解析：使环状的重组质粒成为线性化，需要酶切，由图可知，应该使用Sacl，线性化处理的目的可以用农杆菌转化来理解，线性化的DNA相当于T-DNA，即有利于导入酵母菌并整合在酵母菌染色体上。
在50%聚乙二醇溶液中进行短暂的热刺激处理，可以使外源基因转入受体细胞。50%聚乙二醇（PEG）通过改变细胞膜通透性，促进线性DNA进入酵母细胞。短时热刺激（如42℃）通过膜流动性增加，进一步促进DNA摄入。
将其接种于不含组氨酸的培养基，原因是受体毕赤酵母是组氨酸合成突变体，能合成组氨酸了说明已经导入组氨酸合成酶基因，即导入了重组质粒，从而筛选出导入重组质粒的毕赤酵母。
（5）融合蛋白的诱导表达。将所选菌株在液体培养基中连续培养若干天，每隔 24 小时在培养基中加入甲醇，其目的是 ▲ 。
答案：诱导融合基因表达，同时为毕赤酵母提供碳源和能量（或营养物质）
解析：由题意可知，因为M 是甲醇诱导型启动子，甲醇诱导型启动子是甲醇营养型酵母表达系统中用于调控外源基因表达的核心元件，其活性严格依赖于甲醇的诱导。同时，试题中提到酵母菌是甲醇营养型，利用发酵工程知识可以得出培养基加甲醇为毕赤酵母提供碳源和能量。
（6）LfcinB 的分离纯化和检测。将含有融合蛋白的上清液收集至离心管中，加入等体积的甲酸处理一定时间，收集固形物并用适量溶液溶解后，用 ▲ 方法对产物进行分离纯化，再进行检测与鉴定。
答案：电泳/萃取/亲和层析/层析/离子交换等
解析：试题中出现了在融合蛋白的连接处引入甲酸裂解位点，其核心原理依赖于甲酸（HCOOH）的酸性环境诱导特定化学键的水解断裂。甲酸的酸性作用：甲酸作为强有机酸（pKa≈3.75），可通过降低反应体系的pH值，促使酸敏感位点的化学键（如Asp-Pro序列中的肽键）发生水解。
根据高中生物学教材，发酵工程的表达产物分离纯化根据不同产物有多种方法，如得到酒精需要用真空发酵，得到乳酸用吸附发酵，得到蛋白质用萃取等方法。另外，DNA和蛋白质的纯化还可以用电泳技术。因此，试题中的表达产物是蛋白质，分离和检测可以用电泳技术，也可以用萃取的方法或亲和层析法。
选择性必修《疑难知识解惑》第269页
