inDecay ：CRSIPR 编辑产物预测

好久没更新了。今天趁着一个做了三年的工作基本收尾，赶紧和大家分享一下我们的新工具——inDecay，一个用来预测 CRISPR/Cas 基因编辑产物的模型。

🎯 太长不看版

同一个位点，CRISPR/Cas 的无模板编辑会引入很多种不同的突变。产生哪种突变，其实和细胞类型、甚至细胞的状态都很有关系。已有工具因为没考虑不同细胞里 DNA 修复通路的差异，在小鼠胚胎上常常预测不准。

我们的新工具 inDecay：

• 特征设计更高效：在多种细胞、多个指标上都超过了已有工具。
• 模型足够轻：只要 30–50 个样本‼️，就能把一种细胞学到的修复偏好，迁移到另一种细胞上。这让编辑产物预测第一次能用在样本稀缺的场景，比如小鼠胚胎、大动物胚胎。
• 一套大规模小鼠编辑数据：共 52 个位点、超过 1,878 个胚胎、总计 11,787 条产物。
• 基于这套数据，我们训练了适用于小鼠胚胎 2–4 细胞期的预测模型，并揭示了小鼠胚胎独特的修复偏好。
• 还有猪、牛、山羊、绵羊四种大动物的胚胎编辑数据：即使只用 12 个靶点的小数据，也能带来明显的偏好迁移。

🧑‍💻 代码仓库：https://github.com/StatBiomed/inDecay 

🌐 网页预测工具：https://indecay.online/

Precision CRISPR Outcome Prediction 概览图 *NotebookLM 生成

预测编辑产物，不是早就做烂了吗？

CRISPR/Cas 的预测，脱靶率、编辑活性，相关的 AI 工具早就卷上天际了，还能玩出什么新花样？

这次 inDecay 不只是预测一个数，而是预测一整张图谱。给定一条靶点序列，它能预测出这个位点所有可能的编辑产物，以及每一种增删（indel）出现的概率。

什么意思？就是说，同样一条靶点序列和 gRNA，每次编辑切出来的增删都不太一样，带点随机性——有点像抽盲盒、抽卡。

CRISPR/Cas 编辑产物到底有多复杂

下面这张图，是一次无模板编辑（template-free CRISPR/Cas editing）产生的增删分布（indel distribution）。

indel distribution 示意图

* 增删分布（indel distribution），文中也叫它"产物分布""修复画像"。

图里展示了五种不同的突变（一种突变对应一种 allele）。产物之所以这么多样，是因为删除（deletion）和插入（insertion）各自都有随机性：删除的长度和起始位置在变，插入的长度和碱基组合也在变，两两组合，产物数量一下就爆了。

只算最常见的 1–38 bp 删除和 1–2 bp 插入，一个靶点大约就能产生 300–400 种不同产物。更长片段的删除，出现频率和位置我们这里暂时不考虑。

决定产物的两大因素：靶点上下文 + 修复通路偏好

产物这么复杂，我们从哪儿下手？

好在，虽然有随机性，编辑产物主要还是由两件事决定：靶点的序列上下文，以及细胞对不同 DNA 修复通路的偏好。

下图是四条主要的 DNA 修复通路，它们各自产生什么突变，其实是有规律可循的。其中 HDR 需要模板，SSA 倾向于产生大片段删除——这两类都不在我们无模板编辑的系统里。所以真正要理解的，是 MMEJ 和 c-NHEJ这两条。而每条通路具体怎么反应，就得看靶点序列的上下文了。

（配图：四条 DNA 修复通路示意图）

有些产物和上下文关系特别强。比如微同源末端连接（Microhomology-Mediated End Joining，MMEJ）：切口两端如果有同源序列，修复时会错误修剪，就产生了对应的删除（见上图 MMEJ 部分）。所以只要我们把两端匹配的序列检测出来，再按它们的距离、匹配程度做成特征，一大类删除产物就能预测得很好了。

c-NHEJ则更多产生短插入和点突变。几项大规模编辑实验（Massively Parallel Assay of Self-Targeting Sequences）揭示了一些上下文规律：

• 首先，删除和插入事件的比例也受上下文序列影响。Max Shen 等人的 Nature2018（David Liu、David Gifford、Richard Sherwood 共同通讯），以及背靠背发表的 Felicity Allen、Leopold Parts 等人 2019 Nature Biotechnology，都提到了下图 c 里的序列特征（0 是切口位置）：靶点越接近这类序列，插入突变的占比越高。
• 其次，插入进去的碱基，往往是切口附近序列的拷贝——也就是"近邻拷贝"现象。

Fig 2 from Shen, M.W., Nature 2018. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0686-x

搞清楚这些规律，我们就能设计出合理的特征了。

inDecay 的两层设计：先验特征工程 + 轻量化模型

一位专门做小鼠胚胎编辑的老师告诉我们：现有的预测软件在小鼠胚胎上经常预测不准。这大概和胚胎二细胞期修复通路的基因表达有关。后面的合作，还有 inDecay 的诞生，都是从这句话开始的。

现有模型（inDelphi、ForeCasT）都是在大规模平行实验数据上训练的。这些数据确实揭示了不少通用的上下文规律，但它们同时也"混进了"实验所用细胞类型的通路偏好——而小鼠胚胎自身的偏好，和这些已有细胞都不一样。怎么既用上通用规律，又剥掉细胞特异性，就成了整个课题的关键。

dss-frequency 图

在 Lindel 数据上做初期分析时，我们发现：删除事件的概率，和它的起始位置（start site，紫色）强烈负相关；而在删除长度上（deletion length，蓝色），却出现了双峰。后来我们按有没有微同源序列，把事件分成两类——有 MH 的走 MMEJ 通路，没 MH 的走 c-NHEJ 通路——趋势立刻就清楚了：没有 MH 时，删得越长概率越低；一旦有 MH，对应长度的概率会被拉高，双峰就是这么来的。

于是，基于修复机制的先验知识，加上数据的初步统计，我们提炼出了三个核心特征。后来又陆续补上了邻近碱基等特征。而增删（indel）建模的核心，就是这两条衰退（decay）规律——inDecay 这个名字也是这么来的（indel prediction by frequency Decay）。

inDecay 特征示意图

有了这些高度浓缩的特征，还差最后一块：细胞通路偏好的建模。可惜的是，我们目前只能在拿到编辑数据之后，统计每种细胞的通路偏好（见正文 Fig S2），还没法光凭细胞的某些特质就提前算出来，只能事后建模（post-hoc）。

模型表现，通常由两件事共同决定：特征的表达能力和模型的参数量。我们的思路是：把特征做到极致，让模型不用再花参数去"提取信息"，省下来的参数就能专门用来学细胞的通路偏好。这样一来，只用很少的参数，就能抓住不同细胞的特异性——也为后面小鼠胚胎这种稀缺数据的拟合打好了底子。（说白了就是：数据少，变量就得少，方程才有解。）

模型的大思路就是这样。更细的部分等文章正式出来再展开。感兴趣的同学可以先看预印本 🙇‍♂️.

• 代码仓库：https://github.com/StatBiomed/inDecay

• 想直接试试？网页工具：https://indecay.online/
• 预印本 ：查看原文👇 或访问 https://www.semanticscholar.org/paper/Accurate-prediction-of-CRISPR-editing-outcomes-in-Zheng-Yu/1d6959eb20ab5c252e679feccbfbc987685d086a

实际应用：用 Sanger 数据建模小鼠和大动物胚胎编辑

轻量化模型最大的好处，就是好迁移。在各个大数据集上预训练之后，我们发现，只要大约 30–50 个样本（靶点），就能把关键指标提升到合理水平。

这里要特别感谢合作者提供的大量胚胎编辑数据。其中最有价值的一步，是我们打通了用 Sanger 一代测序数据反推增删分布的流程。此前的数据几乎都来自 NGS 二代测序，需要专门的实验平台，全世界只有少数实验室能产出。但 Sanger 测序，恰恰是很多实验室最日常的手段——不少实验室其实攒了很多年的 Sanger 数据。用我们的处理流程，每个实验室都能给自己的细胞系或动物模型，搭一个专属的编辑预测模型 🤩。

为了更好地服务小鼠基因编辑品系的构建，合作者收集了 52 个基因组位点、1,878 个胚胎、11,787 条突变的数据。小鼠胚胎还得靠人工操作来获取和引导突变，这背后是好几位技术员和硕博接力，付出了大量人力物力。没有这些珍贵的数据，算法本身也谈不上什么价值。在共同一作 Louisa 的努力下，我们把胚胎数据处理好，并在上面调出了最优的小鼠模型（Louisa 的耐心和细致 💪）。

最后的结果：inDecay 在小鼠数据上能预测出 80% 的主要事件，在总体分布、移码突变概率等关键指标上，都大幅领先已有工具。这其实也不奇怪——现有模型的训练数据和小鼠胚胎差得太远，而 inDecay 只要能从小样本里学到鼠胚的通路偏好，就能在各项指标上超过同行 。

小鼠模型效果对比图

数据处理的血与泪

小鼠和大动物的胚胎编辑数据太珍贵，每一条 Sanger 数据都得仔细分析。而这类数据不像 NGS，没有那么多现成工具能直接调用。

第一个坎就是：Sanger 的 ab1 数据不是纯文本，而是信号的叠加。如果一个位点有多个等位突变，信号就是混在一起的，得先把它拆开。这一步 Louisa 做了大量分析和比较，摸清了 DecodR 和 Synthego 各自的优劣，最终定下用 DecodR。我前期写的一堆分析代码，也被她重构得更干净、更好复用。Respect！

当然，也少不了各位合作者和老师们的悉心指导 🙏。

快来试试

最后再给工具打个广告 👉 https://indecay.online/

把靶点序列输进去，填上切口位置（PAM 前三位）和最接近的细胞类型，就能预测出所有可能的产物和它们的概率了。

结果还能一键下载，打开就能看到对应的序列和概率。

预测结果下载界面