分析软件:limma 核心原理拆解(包含edgeR区别)

实验室主页：https://bioinf.wehi.edu.au/limma/源码：https://bioconductor.org/packages/limma/

limma 和 edgeR在count 数据整理、低表达过滤和 TMM 标准化工具部分是一致的，不一致的是后面的统计分析部分：

预处理部分：

DGEList()：组织 count 和样本信息；filterByExpr()：根据实验设计过滤低表达基因；calcNormFactors()：计算 TMM 标准化因子；

统计部分：

edgeR：glmQLFit() → glmQLFTest()limma：voom() → lmFit() → eBayes()

limma-voom 流程代码：

library(edgeR)library(limma)y <- DGEList(counts = counts)keep <- filterByExpr(y, design)y <- y[keep, , keep.lib.sizes = FALSE]y <- calcNormFactors(y, method = "TMM")————————————————————————————————————————————v <- voom(  y,  design,  plot = TRUE)fit <- lmFit(v, design)fit <- contrasts.fit(fit, contrast)fit <- eBayes(fit)

edgeR流程代码：

library(edgeR)y <- DGEList(counts = counts)keep <- filterByExpr(y, design)y <- y[keep, , keep.lib.sizes = FALSE]y <- calcNormFactors(y, method = "TMM")——————————————————————————————————————————————fit <- glmQLFit(  y,  design,  robust = TRUE)qlf <- glmQLFTest(  fit,  contrast = contrast)

更适合 edgeR 的情况

• 样本数较少；
• 希望直接使用 count 分布模型；
• 需要较谨慎的 QL 检验；
• count 很低的基因比较多；
• 希望使用 glmTreat() 检验最小 fold change；
• 分析对象天然是 count。

更适合 limma-voom 的情况

• 样本量较大；
• 实验设计复杂；
• 需要非常灵活的 contrast；
• 需要重复测量或相关样本扩展；
• 希望使用 limma 完整的线性模型生态；
• 需要观测级或样本级质量权重。

v <- voom(  y,  design,  plot = TRUE)

• 不稳定的观测获得较小权重；
• 稳定的观测获得较大权重。

fit <- lmFit(v, design)

对表达矩阵中的每一个基因，根据 design指定的实验结构，使用 v中的 logCPM 和精度权重拟合加权线性模型。

这一步主要完成的是：

• 拟合每个基因的线性模型；
• 估计模型系数；
• 计算拟合值和残差；
• 估计每个基因的原始残差方差。

fit <- contrasts.fit(fit, contrast)

fit <- eBayes(fit)

• logFC (Log2 Fold Change)：对数变化倍数。表示实验组相对于对照组，基因表达量的变化幅度。
• AveExpr (Average Expression)：平均表达量。该基因在所有样本中的平均表达水平（通常经过 log2 转换）。数值越大，说明该基因表达越丰富。
• t (t-statistic)：t 统计量。这是 limma 进行假设检验时计算出的统计值。绝对值越大，说明两组之间的差异越显著。
• P.Value (P-value)：原始 P 值。表示观察到的差异是由随机误差引起的概率。数值越小，差异越显著。
• adj.P.Val (Adjusted P-value)：校正后的 P 值（通常是 FDR，即错误发现率）。由于同时检测成千上万个基因，必须校正以防止假阳性。这是判断基因是否显著差异的最重要指标。
• B (B-statistic / LOR)：B 统计量（对数优势比）。
• B > 0：表示该基因更有可能是差异表达基因。
• B < 0：表示该基因更有可能不是差异表达基因。

end

• 如果在学习的过程中有不理解不明白的地方，欢迎在评论区留言。

• 做这期内容是想帮助对分子生物学这门课感兴趣的朋友，希望通过我的讲解大家能更好的理解这些知识点，所以我这里没有知识点汇总和重难点标注，还请见谅。

• 如果有一些专业名词不太清楚，可以去翻一下前几次课程中的内容，我会在每一次课程中逐渐增加难度，如果之前没提到过，这篇文章中全文不会去提那个专业名词，好好学习，打好基础，让专业的知识简单化，简单的知识轻量化。

• 如果有讲错的地方也请大家多多指点（用疑问句不要用反问句提问），这里没有老师，都是学生，我们互相学习互相成长。

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