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第 18 讲 基因工程
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01 基因工程 1
01 基因工程
1．（不定项）聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增DNA片段的技术。某DNA片段的PCR反应程序
如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．预变性可促进模板DNA边解旋边复制
B．退火是让解旋状态模板DNA恢复双螺旋
C．延伸结束后，新片段中的引物将被切除
D．终延伸可使目的基因的扩增更加充分
【答案】ABC
【分析】PCR过程为①变性，当温度超过90℃时，氢键断裂，双链DNA解聚为单链；②复性，当温度降
低到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸，温度上升到72℃左右时，
溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【详解】A、预变性的目的是破坏DNA中可能存在的较难破坏的复杂二级结构，使DNA充分变性，A错误；
B、退火是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，B错误；
C、延伸结束后，新片段中不会切除引物，C错误；
D、终延伸过程是为了让引物完全延伸并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充
分，D正确。故选ABC。
2．R型细菌生长至一定阶段会分泌感受态因子，诱导感受态特异蛋白质的表达；使细胞表面的DNA结合
蛋白及核酸酶裸露，具有与DNA结合的活性。S型细菌中控制荚膜形成的S基因吸附在R型细菌上即可整
合到R型细菌的基因组中，完成转化。据此解释格里菲思实验中只有少数R型细菌发生转化的原因，错误
的是（ ）
A．S基因只有从加热杀死的S型细菌中释放出来才能促成R型细菌的转化
B．只有少数的S基因可吸附在R型细菌上，完成部分R型细菌的转化
C．蛋白质和DNA对高温的耐受力不同是导致蛋白质不是转化因子的原因
D．R型细菌的转化与S基因的数量、R型细菌的状态有关
【答案】A
【详解】A、S基因从获得S型细菌中释放出来也能促成R型细菌的转化，A错误；
B、因为R型细菌只有进入感受态才相对比较容易接受外源基因，而即使进入了感受态，也会受到外源基
因大小等各种因素的影响，从而只有少数的S基因可吸附在R型细菌上，完成部分R型细菌的转化，B正
确；
C、蛋白质空间结构不稳定容易受到高温等因素的影响而变性，DNA空间结构为双螺旋结构较稳定；蛋白
质和DNA对高温的耐受力不同是导致蛋白质不是转化因子的原因，C正确；
D、转化效率受外源基因大小、数量、细菌密度及生长状况等因素的影响，故R型细菌的转化与S基因的
数量、R型细菌的状态有关，D正确。故选A。
3．（2023·广东韶关一模）下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（ ）
A．该工程和基因工程的根本区别在于操作对象的差异
B．该工程与细胞中天然蛋白质的合成都遵循中心法则
C．通过该工程改造后，获得的性状可以遗传给后代
D．通过该工程可改造现有蛋白质或制造新蛋白质
【答案】A
【详解】A、蛋白质工程和基因工程的操作对象均为基因，根本区别在于蛋白质工程能生产出自然界不存
在的蛋白质，A错误；
B、蛋白质工程在对蛋白质进行分子设计后，合成相应的基因，合成基因的表达离不开转录和翻译过程，因此蛋白质工程遵循的原理包括中心法则，而细胞中天然蛋白质的合成也遵循中心法则，B正确；
C、由于蛋白质工程是直接对基因进行修饰或合成基因，改造后的性状可以遗传给后代，C正确；
D、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，
对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，D正确。故选A。
4．（不定项）（2023·河北唐县二模）关于胚胎工程及其应用，下列叙述错误的是（ ）
A．入卵后的精子激活卵细胞完成减数分裂Ⅱ，排出第一极体
B．胚胎移植时需将得到的胚胎移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内
C．做性别鉴定时应选择内细胞团细胞进行DNA分析
D．基因表达载体导入乳腺上皮细胞后可通过分泌乳汁来生产所需要的药物
【答案】ACD
【详解】A、精子入卵后被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ（减数第二次分裂），排出第二极体后，形成雌原
核，A错误；
B、在胚胎工程中，胚胎移植是最后一道工序，胚胎移植时需将得到的胚胎移植到同种的、生理状态相同
的雌性动物体内，B正确；
C、做性别鉴定时应选择滋养层细胞，而非内细胞团细胞，C错误；
D、需要将基因表达载体通过显微注射等方法导入哺乳动物受精卵中，最终通过分泌乳汁来生产所需要的
药物，D错误。故选ACD。
5．（2023·重庆高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基
因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误
的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T 连接酶
4【答案】B
【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇
TGCGCAGT-3＇，A正确；
B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成
的，B错误；
C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的
序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；
D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；TDNA连接酶既可连接平末端，又
4
可连接黏性末端，D正确。故选B。
6．在DNA分子杂交的过程中，两种生物DNA单链的互补碱基会结合在一起，形成杂合双链区；在没有
互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，如图所示。下列关于DNA分子杂交及应用的叙述，错误
的是（ ）
A．在DNA分子杂交之前，可在94℃的条件下使DNA变性解聚为单链
B．两个远缘物种生物的DNA分子之间进行杂交，形成的杂合双链区较少
C．杂合双链区一条链的序列是5'-GCATCT-3'，另一条链的序列是3'-CGUAGA-5'
D．通过设计两种DNA引物分别与DNA的两条链结合，经PCR技术可大量扩增目的基因
【答案】C
【详解】A、 当温度超过90 ℃时，DNA分子发生变性，双链 DNA 解聚为单链，PCR时，一般热变性温
度设置在94℃，A正确；
B、在分子杂交时，形成杂合双链区的部位越多，DNA碱基序列的一致性越高，说明在生物进化过程中，
DNA碱基序列发生的变化越小，因此亲缘关系越近。所以两个远缘物种生物的DNA分子之间进行杂交，
形成的杂合双链区较少，B正确；
C、DNA分子杂交后，杂合双链区一条链的序列是5'-GCATCT-3'，另一条链的序列是3'-CGTAGA-5'，C错
误；
D、要扩增出目的基因，需要根据DNA的两条链分别设计引物，所以设计两种DNA引物分别与DNA的两条链结合，经PCR技术可大量扩增目的基因，D正确。故选C。
7．科研人员构建了可表达H-M3融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图所示，其中
M3为水母体内的绿色荧光蛋白基因。下列有关叙述，正确的是（ ）
A．构建重组质粒须使用T4DNA连接酶
B．导入受体细胞内的“融合基因”需要两个启动子和两个终止子
C．构建H-M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达以及表达量
D．为确定H基因定向连接到质粒中，可选择引物组合有8种
【答案】C
【详解】A、E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA连接酶还可以连接平末
端，构建重组质粒可使用T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶，A错误；
B、导入受体细胞内的“融合基因”需要一个启动子和一个终止子，保证转录的正常进行，B错误；
C、构建H-M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达及表达量，若发现有绿色荧光则说明可正常
表达，绿光越深，说明表达量越高，C正确；
D、为确定H基因定向连接到质粒中，可选择引物组合（应位于启动子和终止子之间）有6种，即F3-
R2、F3-R1、F2-R2、F2-R1、F1-R2、F1-R1，D错误。故选C。
8．M细胞由小鼠胚胎干细胞定向诱导分化而来，将其移植到糖尿病模型小鼠（胰岛细胞被特定药物破坏
的小鼠）体内，测定小鼠的血糖浓度如图所示。用胰岛素基因片段制成探针，对小鼠胚胎干细胞和M细胞
进行检测，并将结果记录在表中。下列叙述正确的是（ ）
用探针检测细胞的DNA 用探针检测细胞的RNA胚胎干细胞 M细胞 胚胎干细胞 M细胞
+ ① ② ③
注：“+”表示能检测到，“-”表示不能检测到
A．可用胃蛋白酶处理小鼠的早期囊胚以获得胚胎干细胞
B．图中结果表明M细胞已具备胰岛β细胞的功能
C．表中①②③处的结果分别为“+、-、-”
D．实验需用到动物细胞培养、胚胎移植、核酸分子杂交等技术
【答案】B
【详解】A、可用胰蛋白酶处理小鼠的早期囊胚以获得胚胎干细胞，A错误；
B、分析题图可知：移植组的血糖浓度能够恢复到正常小鼠的血糖浓度，说明此时小鼠体内存在了降低血
糖的机制，而根据动物体内唯一降低血糖浓度的激素为胰岛素，可知M细胞内已经具有了胰岛B细胞，故
图中结果表明M细胞已具备胰岛β细胞的功能，B正确；
C、细胞分化过程中遗传物质不变，细胞分化的实质是基因的选择性表达，由B项可知M细胞具备胰岛β
细胞的功能，故表中①②③处的结果分别为“+、-、+”，C错误；
D、实验需用到动物细胞培养、细胞移植、核酸分子杂交等技术，D错误。故选B。
9．（不定项）（2024·吉林长春一模）下图是利用基因工程技术培育新品种水稻的部分流程，序号代表操
作过程。下列相关叙述正确的是（ ）
A．利用PCR技术扩增目的基因需依次经过变性、延伸、复性阶段
B．为防止目的基因自身环化，过程①最好使用两种限制酶
C．过程③的目的是构建基因表达载体，需用DNA连接酶处理
D．重组Ti质粒上的T-DNA能将目的基因整合到宿主细胞染色体上
【答案】BCD
【详解】A、利用PCR技术扩增目的基因需依次经过高温变性、低温复性、中温延伸阶段，A错误。
B、构建重组质粒时用两种限制性核酸内切酶酶切，可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化，B正确；
C、过程③构建基因的表达载体，需用DNA连接酶将目的基因和载体相连，C正确；
D、农杆菌中Ti质粒上的T-DNA能转移到植物细胞，并将目的基因整合到宿主细胞染色体的DNA上，所
以农杆菌中的Ti质粒可作为基因工程的载体，D正确。故选BCD。
10．（2023·浙江台州一模）反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程
如下图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B．设计的引物中GC碱基含量越高，退火的温度越低
C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子
D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温DNA聚合酶及逆转录酶
【答案】A
【分析】1、PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列。反
向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引
物外侧合成DNA。
2、如图所示，DNA分子被限制酶切割，然后环化并加入已知序列合成的引物，再通过PCR扩增得到中间
是未知序列两侧是已知序列的DNA分子。
【详解】A、DNA子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选
择引物1和引物4进行PCR扩增，A正确；
B、GC碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，退火的温度越高，B错误；
C、PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，C错误；
D、整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温DNA聚合酶，不需要逆转录酶，D错误。故选A。
11．（2023·河南信阳一模）三化螟为单食钻蛀性害虫，会造成水稻大面积减产。科研人员偶然得到了一株
天然三化螟抗性纯合品系（X品系）水稻，并通过杂交实验和基因定位方法对三化螟抗性基因（A/a）进行了一系列实验。他们先将野生型水稻与X 品系水稻杂交，F 全为抗三化螟，F 自交后代的表型及比例为抗
1 1
性：非抗性=3：1。为进一步探究三化螟抗性基因（A/a）基因的位置，又将上述F 个体连续自交后获得的
1
个体Y进行基因检测，三化螟抗性基因在水稻某染色体上的DNA检测结果如下图所示，图中字母表示相
应染色体上的区段。
（注：黑色代表的DNA 一部分来自野生型和一部分来自 X 品系）
下列有关分析不正确的是（ ）
A．三化螟抗性基因为显性基因，A/a 的遗传遵循基因的分离定律
B．除了根据表型筛选出三化螟抗性水稻外，还可通过PCR技术检测
C．筛选得到的三化螟抗性水稻大面积种植后会一直对三化螟具有抗性
D．图中具有抗性的都有X 品系的cg区段，三化螟抗性的基因最可能位于图中cg区段
【答案】C
【详解】A、依题意有，X品系（有抗性）与野生型（无抗性）水稻杂交，F 全部为抗性，F 自交后代的
1 1
表型及比例为抗性：非抗性=3:1，说明抗性基因为显性基因，F 基因型为Aa，A/a的遗传遵循基因的分离
1
定律，A正确；
B、检测三化螟抗性基因是否存在于某株水稻体内，除了根据表型判断外，还可以提取水稻染色体基因组，
通过PCR技术将已知的抗性基因扩增后进行检测，B正确；
C、筛选得到的三化螟抗性水稻大面积种植后，刚开始对三化螟有抗性，但当三化螟中少数发生基因突变
的个体能在抗性水稻上产卵繁殖（获得针对抗性水稻的抗性），经过抗性水稻筛选后，三化螟中突变基因
频率上升，即三化螟的对水稻的抗性增强，导致具有抗性基因的水稻抗三化螟能力减弱或丧失，进而导致
其抗性失效，C错误；
D、由图中的位点可以看出具有抗性和不具有抗性的区别，且有抗性的都有X品系的cg区段，所以三化螟
抗性基因最可能位于cg区段，因为Y所有抗性个体都具有来源于X品系的cg区段，而非抗性个体都不具有来源于野生型的cg区段，D正确。故选C。
12．研究发现，胰岛素进入血液循环后容易被降解，糖尿病患者需要反复注射胰岛素才能达到治疗效果。
科研人员借助蛋白质工程定向设计改变了胰岛素中的某些氨基酸，提高了胰岛素在患者体内的稳定性，延
长了其作用时间。下列有关叙述错误的是（ ）
A．蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行设计和改造蛋白质
B．氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内稳定性的原因之一
C．改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发
D．蛋白质工程难度很大与蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构有关
【答案】C
【详解】A、蛋白质工程的基本流程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列
→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终要利用基因工程上来解决蛋白质的合成，
因此蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行设计和改造蛋白质，A正确；
B、氨基酸序列差异，导致胰岛素的空间结构有所改变，影响了它的功能，B正确；
C、胰岛素属于蛋白质，改造胰岛素应首先从设计预期的蛋白质结构出发，C错误；
D、多数蛋白质除具有一级结构(即氨基酸顺序)外，还具有复杂的高级结构，即空间结构，而很多蛋白质的
空间结构是人们目前还不清楚的，因此实施蛋白质工程的难度很大，D正确。故选C。
13．海南作为中国唯一的热带岛屿省份，其种业发展在气候、资源、科技等方面均有明显优势。在海南，
从常见的杂交水稻、高产玉米，到转基因抗虫棉花、耐热菊花，诸多优质新品种在这里被评议审定、种植
推广。下列有关叙述错误的是（ ）
A．转基因产品需要经过一系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市
B．我国对转基因技术的方针是研究上要大胆、推广上要慎重、管理上要严格
C．我国制定的有关法规最大程度保证了转基因技术和已上市转基因产品的安全性
D．对植物的基因改造是基因工程中研究最广泛和取得实际应用成果最多的领域
【答案】D
【详解】A、转基因作为一项技术本身是中性的，由这项技术研发出来的产品需要经过一系列的安全性评
价，符合相应标准后才能上市，A正确；
B、针对转基因技术的应用，各个国家都制定了符合本国利益的法规和政策。我国对转基因技术的方针是
一贯的、明确的，就是研究上要大胆，坚持自主创新;推广上要慎重，做到确保安全;管理上要严格，坚持
依法监管，B正确；
C、国家有关部门制定实施了《农业转基因生物安全评价管理办法》《农业转基因生物进口安全管理办法》，这些法规的制定既维护了消费者对转基因产品的知情权和选择权，又最大程度地保证了转基因技术
和已经上市的转基因产品的安全性，C正确；
D、对微生物的基因改造是基因工程中研究最广泛和取得实际应用成果最多的领域，D错误。故选D。
14．（2024·广西南宁一模）粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）可以增加白细胞的数量。某科研团
队将人的GM-CSF基因导入大肠杆菌可大量生产GM-CSF，并用于临床上化放疗之后的肿瘤治疗。下列相
关叙述中，正确的是（ ）
A．可通过PCR的方法获取人的GM-CSF基因
B．构建GM-CSF表达载体需要限制酶和DNA聚合酶
C．基因表达载体上的复制原点可调控GM-CSF基因的表达
D．可通过显微注射的方法将GM-CSF基因导入大肠杆菌
【答案】A
【详解】A、PCR是一项体外扩增DNA分子的技术，可用于目的基因的获取及扩增，故可通过PCR的方
法获取GM-CSF基因，A正确；
B、构建GM-CSF基因表达载体是基因工程的核心，该过程需要限制酶和DNA连接酶，B错误；
C、基因表达载体上的复制原点可以启动复制过程，启动子和终止子可以调控GM-CSF基因的表达，C错
误；
D、大肠杆菌属于原核生物，将目的基因导入原核生物的方法是钙离子处理法（感受态细胞法），将目的
基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，D错误。故选A。
15．（2023·河北三模）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠
Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得
Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于
PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子可以控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．4号条带的小鼠是野生型，2号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】D
【详解】A、分析图中可知，启动子在编码区的左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录
后，可以在Gata3基因转录后，使GFP基因转录，Gata3基因的启动子也能控制GFP基因的表达，A正确；
B、据图可知，因启动子在左侧，转录从左向右，而翻译方向从mRNA的5'-3'，Gata3蛋白在GFP蛋白的
左侧，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；
C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有
小片段，是野生型，C正确；
D、若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子都能扩增出相应的片段则不能区分杂
合子和纯合子，D错误。故选D。
16．质膜内在蛋白在植物生物膜系统中广泛存在，是植物运输水分和CO 的主要通道。为了研究干旱胁迫
2
下质膜内在蛋白基因Z1（图1表示已知其中一条链的碱基序列）在玉米中的表达和调控情况，科研人员建
构含有Z1基因的高表达载体（图2表示该载体的T-DNA序列），通过转基因技术培育出了Zl蛋白高表达
植株。请回答下列问题。
(1)通过PCR扩增Zl基因时，通常选择下列____组合作为引物对。
A．5'-TAAGTTGTCT-3'和5'-CTTGGATGAT-3'
B．5'-TCTGTTGAAT-3'和5'-CTTGGATGAT-3'
C．5'- GAACCTACTA -3'和5'- ATTCAACAGA -3'
D．5'- ATCATCCAAG -3'和5'- ATTCAACAGA -3
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，图2中的Ubiquitin和P35S是 ，其功能是 。
(3)为检测质膜内在蛋白基因是否导入玉米细胞，可采用PCR技术对转基因玉米株系进行检测，并对PCR
产物用电泳技术来鉴定。由图3电泳结果可知， 号玉米株系含有目的基因。(4)为探究Z1转基因玉米的抗干旱能力，对野生型玉米株系（WT株系）和ZI转基因玉米（Oe1-3株系）
进行干旱处理后测定其地上部分的鲜重，分别计算其相对于正常条件下生长的野生型植株的地上部分生物
量，结果如图4所示。图示结果说明 。
(5)为进一步探究Z1基因在分子及细胞水平的作用机制，研究人员将Z1基因与绿色荧光蛋白基因连接到同
一载体上并导入玉米细胞,发现绿色荧光分布在细胞膜上；在图2的Ubiquitin下游连接GUS基因（表达产
物可水解底物呈蓝色），发现蓝色主要分布在叶肉细胞中。请结合Z1蛋白的功能推测其作用机制是 。
【答案】(1)B
(2) 启动子 RNA聚合酶识别和结合的序列，启动转录过程
(3)1-4
(4)干旱处理会降低玉米地上部分鲜重，而超表达ZmPIPI；1基因能够增强玉米植株对干旱胁迫的耐性
(5)Z1蛋白可被转运至细胞膜促进对二氧化碳的运输和利用，提高玉米植株的光合活力
【详解】（1）图1所示碱基序列磷酸端为5'端，羟基端为3'端，在进行PCR操作时，引物应和模板链的
3'端根据碱基互补配对原则结合，通常选择下列B组合作为引物对。
（2）图2中的Ubiquitin和P35S位于目的基因的上游，应是RNA聚合酶结合位点，即启动子，可启动转
录过程。
（3）由图3电泳结果可知，1-4 号玉米株系和含有目的基因的质粒经PCR后的电泳产物含有片段，说明
1-4 号玉米株系含有目的基因。
（4）据图可知，在干旱条件下，与正常条件下生长的野生型植株相比较，转基因玉米株系相对地上部分
生物量降低较少，野生型降低较多，说明干旱处理会降低玉米地上部分鲜重，而超表达ZmPIPI；1基因能
够增强玉米植株对干旱胁迫的耐性。
（5）将Z1基因与绿色荧光蛋白基因连接到同一载体上并导入玉米细胞,发现绿色荧光分布在细胞膜上，说
明Z1基因表达的蛋白分布在细胞膜上；在图2的Ubiquitin下游连接GUS基因（表达产物可水解底物呈蓝
色），发现蓝色主要分布在叶肉细胞中，说明Z1基因主要在叶肉细胞中表达。综上分析可知，Z1蛋白可
被转运至细胞膜上，可提高玉米植株的光合活力，推测其促进对二氧化碳的运输和利用。17．（2023·扬州·高三期中）研究人员从土壤中分离获得能分解纤维素的细菌（A菌），从A菌中提取一
种纤维素酶基因（CBHⅡ）并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒（图1）连接构建成重组质粒
并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌（B菌）。请回答下列问题:
限制酶 识别序列及酶切位点
BglⅡ A↓GATCT
BstEⅡ G↓GTAACC
SacI G↓AGCTC
MspI C↓CGG
BamHI G↓GATCC
限制酶识别序列及酶切位点
(1)表列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，MspⅠ切割DNA后形成的黏性末端是 。
(2)CBHⅡ基因两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，因此在扩增CBHⅡ基因时，需要在
两种引物的 （填“5'”或“3'”）端分别添加相应限制酶的识别序列。
(3)图2中B链为CBHⅡ基因转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。图中酶切位点1和酶切位点2所对应的酶分别是 、 ，选用两种限制酶切割的目的是 。
(4)图2中构建成功的重组质粒应包括 结构（至少答3点）。为鉴定重组质粒是否构建成功，
将重组质粒导入A菌，并将其接种在含 的培养基上培养，然后将3个不同菌落扩大培养后提
取质粒分别进行双酶切验证，将酶切产物分别进行 ，结果如图3所示。据图分析，菌落
中成功导入了重组质粒。
(5)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基分为三组，进行不同处理后，在相同条件下
培养一段时间，测定培养基中纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种 ，说明
。预期该工程菌在处理废弃物及保护环境方面可能的应用，请举一例： 。
【答案】(1)—GC
(2)5'
(3) BglⅡ BstEⅡ 保证CBHⅡ基因与pUT质粒定向连接
(4) 复制原点、标记基因、启动子、终止子、目的基因 抗生素N （琼脂糖凝胶）电泳
2、3
(5) A菌 B菌分解纤维素能力比A菌更强 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染
【详解】（1）根据表格中MspⅠ识别序列和切割位点，MspⅠ切割DNA后形成的黏性末端是—GC。
（2）引物是从子链的5'端往3'方向延伸，为了能让扩增出的目的基因与表达载体正确连接，则需要在引物
的5'端分别添加相应限制酶的识别序列。
（3）目的基因的B链为模板链，转录的方向为子链的5'端往3'方向延伸，根据表达载体的启动子位置，可
知酶切位点是1BglⅡ，酶切位点2是BstEⅡ，选用两种限制酶切割可保证CBHⅡ基因与pUT质粒定向连接。
（4）完整的重组质粒应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点。BstEⅡ破坏了抗生素M
抗性基因，但保留了抗生素N抗性基因，因此为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒导入A菌，并将
其接种在含抗生素N的培养基上培养，图3为琼脂糖凝胶电泳图谱，由CBHⅡ基因大小可知，菌落2和3
扩增出了目的基因，说明成功导入了重组质粒。
（5）对照组1为空白对照，对照组2应为接种A菌，由柱状图长短可知，B菌分解纤维素能力比A菌更强。
该菌降解纤维素的能力更强，可用于降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。
18．金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科
研人员将MT基因导入大肠杆菌构建工程菌，利用这一工程菌吸附工业废水中的重金属。回答下列问题：
(1)为获取目的基因，从 中提取mRNA，通过 法获得MTcDNA。MTcDNA的碱基序列与
细胞中MT基因的碱基序列 （填“相同”或“不同”）。
(2)为了提高工程菌MT蛋白的产量，将MT基因与外源表达增强元件连接（图甲表示引物对应的位置）。利用PCR检测连接是否成功，可选择的引物组合是 （填字母），该PCR反应体系中需加入
酶。
A．①+③B．①+④C．③+②D．③+④
(3)将改造后的目的基因进行PCR扩增，得到的片段末端为平末端，而载体E只有能产生黏性末端的酶切
位点。为了能够将MT基因与载体E相连，可以在上述引物的 （填“5′”或“3′”）端添加能产生黏
性末端的限制酶识别序列；也可以借助中间载体P将MT基因接入载体E。（图乙表示载体P和载体E的
酶切位点及相应的酶切序列）
后者具体操作步骤如下：
①选用 酶将载体P切开，再用DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，
将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接。为了提高获得重组质粒的效率，除了考虑适宜的外
界条件、目的基因的浓度外，还需考虑 （写出两点）。
(4)将重组质粒导入到用 处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有 的培养基筛选出MT工程
菌。
(5)通过检测发现MT基因已经成功导入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属，可能的原因是：
。
【答案】(1) 动物肝脏细胞 逆转录/反转录 不同
(2) B TaqDNA聚合酶/耐高温的DNA聚合酶(3) 5′ EcoRV 启动子 终止子 XhoI和PstI 质粒的浓度、质粒的纯度、DNA连
接酶的浓度DNA连接酶活性
(4) CaCl 卡那霉素
2
(5)转入大肠杆菌中的MT基因不表达/表达量少/表达不及预期
【详解】（1）分析题意，金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，为获取
目的基因，可从动物肝脏细胞中提取mRNA，通过逆转录（反转录）法获得MTcDNA；MTcDNA是经过
逆转录得到的，该过程中由于成熟的mRNA已经经过剪切等过程，不含内含子等非编码序列，故
MTcDNA的碱基序列与细胞中MT基因的碱基序列不同。
（2）PCR扩增时，应选择一对引物，引物需要与模板的3’端结合，本操作中将MT基因与外源表达增强
元件连接，利用PCR检测连接是否成功，需要扩增表达增强元件和目的基因，结合题图可知，可选择的引
物组合是①+④ ，故选B；由于PCR过程中所需温度较高，故PCR反应体系中需加入TaqDNA聚合酶/耐
高温的DNA聚合酶。
（3）PCR扩增时与引物的3‘端结合，’为了能够将MT基因与载体E相连，可以在上述引物的5′端添加能
产生黏性末端的限制酶识别序列。
①PCR所用的DNA聚合酶扩增出的M基因的末端为平末端，则可用EcoRV酶将载体P切开，形成平末端，
由于T4DNA连接酶可以连接平末端，所以用T4DNA连接酶将M基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②由于载体P'不具有表达M基因的启动子和终止子，所以选用XhoI和PstI酶组合对载体P'和载体E进行
酶切，将切下的M基因和载体E用DNA连接酶进行连接，得到含有启动子和终止子的表达载体；为了提
高获得重组质粒的效率，除了考虑适宜的外界条件、目的基因的浓度外，还需考虑质粒的浓度、质粒的纯
度、DNA连接酶的浓度DNA连接酶活性等。
（4）将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法，故可将重组质粒导入到用CaCl 处理的大肠杆菌
2
中完成转化；结合图示可知，重组质粒含有的标记基因是卡那霉素，故利用含有卡那霉素的培养基筛选出
MT工程菌。
（5）由于转入大肠杆菌中的MT基因不表达/表达量少/表达不及预期，故通过检测发现MT基因已经成功
导入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属。
19．（2023·辽宁高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-
淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列
问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR中使用的聚合酶属于 （填写编号）。①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR的模板。
【答案】(1)蛋白质
(2)③
(3)②③
(4)标记基因
(5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检
测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片
段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶
切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。
20．（2023·四川乐山一模）新冠病毒为单股正链RNA病毒，其主要表面抗原为S蛋白，由S基因控制合
成。新冠病毒疫苗按技术路径分为三类：灭活疫苗（Vero细胞）、重组新型冠状病毒疫苗（CHO细胞）和
腺病毒载体疫苗。回答下列问题。
(1)以新冠病毒的RNA为模板，通过RT-PCR获取S基因（DNA）时，需要的酶是 。在RT-
PCR过程中，引物的作用是 。(2)Vero细胞为非洲绿猴肾细胞的传代细胞系细胞，将新冠病毒接种到Vero细胞，经培养、灭活后可制成
新冠病毒灭活疫苗。Vero细胞的培养应在培养箱中进行，培养箱的气体环境为 ，为利于Vero
细胞生长，培养基中一般添加 。
(3)CHO细胞是中国仓鼠卵巢的细胞系细胞。CHO-GS是人工敲除了谷氨酰胺合成酶基因（GS基因）的
CHO细胞，该细胞在不含甲硫氨酸硫氧胺（MSX）的培养基上不能生活。研究人员将 构建于
质粒上并导入CHO-GS细胞后，该细胞可在不含MSX的培养基上生活，并产生S蛋白。
(4)腺病毒是DNA病毒，位于两ITR间的基因可以表达。其中E1区控制合成的El蛋白能启动基因组的复
制。用腺病毒作载体，研制腺病毒新冠病毒疫苗的技术路径如上图所示。人工改造腺病毒DNA时，研究
人员删除了E1区。删除E1区的好处是 。重组S基因腺病毒在人胚胎肾细胞中不能完成复制，
但在基因工程改造过的人胚胎肾细胞（细胞系293）却能大量增殖，推测“基因工程改造”应是
。
【答案】(1) 逆转录酶、Taq酶 界定要扩增的目的基因；是逆转录酶、Taq酶的结合部位；是子
链延伸的起点
(2) 5%CO 、95%空气 血清
2
(3)S基因、GS基因
(4) 限制腺病毒DNA的复制，提高安全性 将E1基因导入人胚胎肾细胞
【分析】（1）动物细胞培养的条件：①营养物质：由于目前人们对动物细胞所需的营养成分还未完全搞
清楚，因此除了加入糖类、氨基酸、无机盐、微量元素、维生素、促生长因子外，还要加入血清、血浆等
天然物质。②无菌、无毒的环境：定期更换培养基；为防止杂菌污染，加入抗生素。③适宜的温度和
PH。④气体环境：O 是细胞代谢所必须的，CO 是调节培养液的PH，一般把细胞培养在含5%CO、95%
2 2 2
空气的混合气体的培养箱中。
（2）PCR基本原理：是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用
酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加
入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种
dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为
单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温
度升至合适温度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA
片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一
个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、
热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。【详解】（1）通过RT-PCR获取的基因时，先在逆转录酶由RNA得到cDNA，再以cDNA为模板，在Taq
酶的作用下通过PCR进行DNA扩增。在RT-PCR过程中，引物的作用是界定要扩增的目的基因；是逆转
录酶、Taq酶的结合部位；是子链延伸的起点。
（2）Vero细胞是动物细胞，动物细胞培养是培养箱的气体环境为(95%空气+ 5%的二氧化碳)。为利于vero
细胞生长，培养基一般添加血清等天然成分。
（3）将S基因构建于质粒上并导入CHO-Gs细胞后，其表达后会产生S蛋白，(S基因控制产生S蛋白)，
同时要想该细胞在不含MSX的培养基生活，还必须导入GS基因，则此细胞就可在不含MSX的培养基上
生活，并产生S蛋白。
（4）E1区控制合成的E1蛋白能够启动基因组的复制，删除E1区后改造后的腺病毒缺少E1基因无法合成
E1蛋白，从而限制腺病毒DNA的复制，提高安全性。重组后S基因腺病毒在人胚胎肾胞不能完成复刺，
但在基因工程改造过程的人胚胎肾细胞中却能大量增殖，推测基因工程改造的目的增大对目的基因的载量。
重组后S基因腺病毒在人胚胎肾细胞不能完成复制，但在基因工程改造过程的人胚胎肾细胞中却能大量增
殖，推测推测“基因工程改造”应是将E1基因导入人胚胎肾细胞，使重组S基因腺病毒人胚胎肾细胞中
能大量增殖。
