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易错点 26 发酵工程
1.有关“倒平板”
（1）培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
（2）要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
（3）倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打
开，以免杂菌污染培养基。
（4）平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既
可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（5）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板
不能用来培养微生物。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
（6）整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
2.有关“平板划线法”
①第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。
②灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
③在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌
的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
④划线时最后一区域不要与第一区域相连。
⑤划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
3.有关“选择培养基与鉴别培养基”
4.有关“消毒和灭菌”
项目 选择培养基 鉴别培养基
制备方法 培养基中加入某些化学物质 培养基中加入某种指示剂或化学药品
依据某些微生物对某些物质或环境条
原理 产生特定的颜色或其他变化
件的嗜好或抗性而设计
用途 从众多微生物中分离出所需的微生物 鉴别不同种类的微生物
消毒：使用较温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
1．下列有关微生物培养基的配制表述错误的是（ ）A．培养硝化细菌的培养基中的铵盐可作为氮源和能源
B．尿素固体培养基中的KHPO 能用于维持培养基的pH
2 4
C．培养光能自养型的蓝细菌的培养基中不需提供有机物
D．马铃薯蔗糖固体培养基中的琼脂能作为酵母菌的碳源
2．酵母的蛋白含量高，可用作饲料蛋白，且有些酵母能利用工业废甲醇作为碳源进行繁殖，
既可减少污染，又可降低成本。研究人员拟从土壤中分离该类酵母并大量培养，操作流程如下
图。下列相关叙述正确的是（ ）（注：25×16型血细胞计数板，表示计数室中有25个中格，
每个中格又分成16个小格。）
A．实验前需对玻璃器皿、金属用具和培养基进行干热灭菌
B．只有③过程中使用的培养基需以甲醇作为唯一的碳源
C．为了保证结果准确，对每一个平板的菌落都要进行计数并取平均值
D．将发酵液稀释1000倍后，用25×16 （ 1mm×1mm×0．1mm）型血细胞计数板计数10个中
格中的细胞数为60个，则发酵液中每毫升有1．5×10⁹个细胞
3．植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解成葡萄糖，进而葡萄糖通过发酵转化为能源, 为生
产和生活服务。请回答下列问题：
(1)自然界中分解纤维素的微生物大多分布在 _________的土壤中。将从土壤中获得的微生物培
养在以纤维素为碳源，并加入刚果红的培养基上，筛选周围有_________的菌落。
(2)为分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）:
刚果红溶
酵母膏 无机盐 淀粉 纤维素粉 琼脂 水
液
培养基甲 十 + ＋ ＋ - ＋ +
培养基乙 ＋ ＋ ＋ - ＋ ＋ +
（注：“ + ”表示有，“—”表示无）
据表判断，培养基甲不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是
____________________________________;培养基乙_________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴 别纤维素分解菌,原因是__________________。
(3)生产中可以将被纤维素分解菌分解得到的葡萄糖进行酒精发酵，常用菌种是_________。 为
了确保获得产物乙醇,发酵环节要注意____________________________________。
1．传统发酵技术中四种常用菌种的比较
项目 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
生物学分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
异养兼性厌
代谢类型 异养需氧型 异养需氧型 异养厌氧型
氧型
前期需氧，
发酵条件 一直需氧 一直需氧 无氧
后期不需氧
生长适宜温度 18～25 ℃ 30～35 ℃ 15～18 ℃ 室温
制作酸奶、泡
生产应用 酿酒、发面 酿醋 制作腐乳
菜
2．泡菜发酵过程中乳酸菌、乳酸及亚硝酸盐含量的变化
项目 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
发酵 少(有O、乳酸菌活 增加(硝酸盐还原菌的
2
少
初期 动受抑制) 作用)
下降(硝酸盐还原菌受
发酵 最多(乳酸抑制其他菌
积累、增多、pH下降 抑制，部分亚硝酸盐
中期 活动)
被分解)
减少(乳酸继续积累，
发酵 下降至相对稳定(硝酸
pH继续下降，抑制 继续增多，pH继续下降
后期 盐还原菌被完全抑制)
其活动)
含量
变化
曲线
亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化
注意
氨形成的
3.消毒和灭菌的辨析项目 条件 结果 常用方法 应用范围
煮沸消毒法 日常用品
较为温和 仅杀死物体表面或 巴氏消毒法 不耐高温的液体
消毒 的物理或 内部的部分微生物 用酒精擦拭双
化学方法 (不包括芽孢和孢子) 化学药剂消毒法 手、用氯气消毒
水源
灼烧灭菌法 接种工具
杀死物体内外所有 玻璃器皿、金属
强烈的理 干热灭菌法
灭菌 的微生物，包括芽 用具
化因素
孢和孢子 培养基及容器的
高压蒸汽灭菌法
灭菌
4.两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
(1)接种环的灼烧：①第一次划线前， (1)在进行稀释操作时，每支试管及
避免接种环上可能存在的微生物污染 其中的9 mL水、移液管均需灭菌；
培养基；②再次划线前，杀死上次划 操作时，试管口和移液管应在离酒精
线结束后接种环上残留的菌种，使每 灯火焰1～2 cm处。
次划线的菌种直接来源于上次划线的 (2)涂布平板时：①涂布器用体积分
末端；③划线结束后，杀死接种环上 数为70%的酒精消毒，取出时要让多
注意事项
残留的菌种，避免细菌污染环境和感 余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少
染操作者。 量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引
(2)接种环灼烧后，要冷却后才能接触 燃；②不要将过热的涂布器放在盛放
菌液，以免温度太高杀死菌种。 酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒
(3)划线时用力要大小适当，防止用力 精；③酒精灯与培养皿距离要合适，
过大将培养基划破 移液管头不要接触任何其他物体
可以观察菌落特征，对混合菌进行分
优点 可以计数，可以观察菌落特征
离
操作较麻烦，平板不干燥效果不好，
缺点 不能计数
容易蔓延
都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌
共同点
落；都可用于观察菌落特征5．两种微生物计数方法的比较
间接计数法 直接计数法
项目
(稀释涂布平板法) (显微镜计数法)
当样品的稀释度足够高时，培养
基表面生长的一个菌落，来源于 利用特定细菌计数板或血细胞计数
原理 样品稀释液中的一个活菌，通过 板，在显微镜下计算一定容积的样品
统计平板上的菌落数，就能推测 中微生物的数量
出样品中大约含有多少活菌
每毫升原液所含细菌数：每小格内平
公式 每克样品中的菌落数＝×M
均细菌数×400×104×稀释倍数
当两个或多个菌体连在一起时，
缺点 不能区分细胞死活
平板上观察到的只是一个菌落
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
6．微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物
挑取法 菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
养法
鉴定培
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物
养法
(2)微生物的鉴别方法
根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、
菌落特征鉴别法
隆起程度和颜色等特征进行鉴别
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基
指示剂鉴别法
变红说明该种微生物能够分解尿素
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌
染色鉴别法
为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
7.微生物的分离与计数实验中对照组和重复组的设置及作用
(1)两种对照组的设置及作用
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观
察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置至少3个
平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。
1．下列关于微生物实验室培养的说法错误的是（ ）
A．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
B．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板进行计数
C．为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌
D．振荡培养的目的是提高培养液的溶解氧的含量，使菌体充分接触培养液，提高营养物质的
利用率。
2．酵母菌生长的最适宜温度在18～30℃之间，在氧气充足的环境中主要以出芽生殖的方式快
速增殖。大约每1.5～2小时增殖一代。某研究性学习小组据此探究酵母菌种群密度的动态变化，
进行了如下实验，实验操作步骤如下：
第一步：配制无菌马铃薯葡萄糖培养液和活化酵母菌液。
第二步：利用相同多套装置，按下表步骤操作。
装置编号 A B C D
无菌马铃薯葡萄糖培养液/ml 10 10 5 5
装置容器内的溶液 无菌水/ml — — 5 5
活化酵母菌液/ml 0.1 0.1 0.1 0.1
温度/℃ 5 25 5 25
第三步：用血细胞计数板计数装置中起始酵母菌数目，做好记录。
第四步：将各装置放在其他条件相同且适宜的条件下培养。
第五步：连续7天，每天随机抽时间取样计数，做好记录。
回答下列问题：
(1)改正实验操作步骤中的一处错误______________。
(2)该小组研究课题是____________________________。实验中对酵母菌计数可采用
____________法，若直接吸取培养液进行计数，则所得数值___（填“偏大”或“偏小”或
“偏大、偏小都有可能”）。
(3)某同学第5天在使用血细胞计数板计数时做法如下：
①振荡摇匀试管，取1mL培养液并适当稀释（稀释样液的无菌水中加入了几滴台盼蓝染液）。②先将_________放在血细胞计数板的计数室上，用吸管吸取稀释后的培养液滴于其边缘，让
培养液自行渗入，多余培养液用吸水纸吸去，制作好临时装片。
③显微镜下观察计数：在观察计数时只记___（填“被”或“不被”）染成蓝色的酵母菌。
④该小组同学在一次实验中取样液后，并稀释10倍，用图乙所示的血细胞计数板
（1mm×1mm×0.1 mm，400个小方格）计数。若用图2的计数结果作为每个中方格的平均值（·
代表酵母菌），则此样液中酵母菌的密度是__________个/mL。
(4)研究人员还设置了A、B、C、D四组实验（每组接种酵母菌数量一致），实验A组：20mL
培养液；实验B组：20mL培养液并在a点后定期补充适量培养液；实验C组：20mL培养液并
仅在a点时补充一次适量培养液；实验D组为理想条件。测得种群数量随时间的变化如图甲所
示。实验A、B、C、D组酵母菌的种群数量变化曲线分别对应图中的_____曲线。
3．莠去津是一种含氮的有机化合物，它是广泛使用的除草剂之一，在土壤中不易被降解。为
修复被莠去津污染的土壤，研究人员按下面程序筛选能降解莠去津的细菌（莠去津在水中溶解
度低，含过量莠去津的固体培养基不透明）。回答下列问题：
(1)为选取能降解莠去津的细菌，应从______的土壤中选取样品，然后加入______（填“清水”、“生理盐水”或“无菌水”）制备成土壤浸出液。
(2)本实验中在固体培养基接种菌种的方法是______，接种后的培养皿应该倒置后置于恒温培养
箱中培养一段时间后，观察______（答出两点）等菌落特征。
(3)实验测得A~C瓶中三类细菌的密度如下图所示：
由图推断，从A瓶到C瓶液体培养的目的是______。实验结果显示，甲类细菌密度迅速降低，
可能原因是______。
(4)从图示固体培养基上的菌落中，就能筛选出目的菌，原理是______。
1．传说杜康的儿子墨塔在一次酿酒时发酵过头，直至第21天开缸时，发现酒液已变酸但香气
扑鼻，酸甜可口，于是他结合“甘一日”和“酉”字，给这种酸水起名为“醋”，下列有关叙
述正确的是（ ）
A．酿酒过程中发酵液出现的气体都是在酵母菌细胞的细胞质基质中产生的
B．酿酒时糖类未耗尽，酵母菌的发酵也会停止，由pH上升和酒精含量增多导致
C．墨塔酿酒反成醋可能是由于发酵装置密封不严造成的，若适当升温则醋味更浓
D．统计活酵母菌数量时，可用显微镜直接计数法，统计的结果比实际数目低
2．图中的已驯化菌群是从某肉制品加工厂污水处理池中初步筛选的可水解油脂并利用的菌群，
为进一步筛选高效水解油脂的菌群进行了如图所示的操作。下列相关叙述正确的是（ ）A．培养基中除了油脂提供的成分还需加入氮源和碳源
B．随着培养基中油脂浓度变大导致菌群朝着高效水解油脂的变异方向发展
C．在菌种分解油脂的过程中培养基的pH会呈现先下降再上升的变化趋势
D．若要研究优秀菌的生长规律，可在液体培养的不同时间段采用稀释涂布平板法短时间内测
定其数量
3．某生物兴趣小组把从固体培养基上分离出来的野生酵母菌接种到盛有等量同种液体培养基
的三个相同锥形瓶中，并分别放在转速为2l0r/min、230r/min、250r/min的摇床上培养，得到如
图所示结果，下列有关分析错误的是（ ）
A．在固体培养基上分离所需菌种可以使用平板划线法
B．用血细胞计数板对培养液中酵母菌直接计数时，数值会偏小
C．在不同培养条件下相同锥形瓶内酵母菌种群的最大数量不同
D．实验结果出现不同的原因与培养过程中氧气的供应量有关
4．在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”探究实践中，要规范地进行无菌操作。下列与
无菌操作相关的说法，正确的是（ ）
A．为了防止杂菌污染，应将配制好的选择培养基分装到培养皿中再进行高压蒸汽灭菌B．将土样进行10倍稀释后，取1mL上清液加入盛有9mL蒸馏水的试管中依次等比稀释
C．将涂布器在火焰上灼烧，待其上的酒精燃尽后，必须先冷却再进行涂布平板操作
D．待长成的菌落稳定后，要在无菌条件下进行尿素分解菌菌落的观察和计数
5．下列关于微生物发酵的说法，不正确的是（ ）
A．腐乳制作主要利用毛霉，柠檬酸的生产主要利用黑曲霉
B．泡菜和果酒发酵均需无氧条件，果酒发酵需控制在28℃
C．发酵得到的微生物菌体（单细胞蛋白）可作为牲畜饲料
D．通过菌体分离和干燥即可完成细菌代谢物的提取
6．青霉素是人类发现的第一种抗生素，由青霉菌分泌。科学家发现青霉菌在葡萄糖含量较低
时会分泌青霉素杀死其他细菌，以保证自身生存所需的能量供应。下列关于工业化大规模生产
青霉素过程的叙述，正确的是（ ）
A．青霉素具有杀菌作用，发酵罐无需严格灭菌
B．选育出的高产青霉菌菌株可直接用于大型发酵
C．降低发酵液中的葡萄糖浓度，有利于青霉菌增殖
D．发酵过程中需严格控制温度、pH和溶解氧等培养条件
7．细菌需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列与此有关的说法
正确的是（ ）
A．乳酸菌与颤藻所利用的碳源物质是相同的
B．氮源不可能为细菌的生长、代谢提供能量
C．琼脂是细菌生长和繁殖中不可缺少的一种物质
D．培养大肠杆菌时，培养基中不需要加入生长因子
8．物质m是一种有机物（仅含有C、H两种元素），会污染土壤。m在培养基中达到一定量
时培养基表现为不透明。某研究小组欲用三种培养基筛选土壤中能高效降解m的细菌（目标
菌）。①号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入m（5g/L）；②号培养基；氯化钠
（5g/L），硝酸铵（ 3g/L），其他无机盐（适量），m（15 g/L）；③号培养基：氯化钠
（5g/L），硝酸铵（ 3g/L），其他无机盐（适量），m（45g/L）。
(1)在①号培养基中，为微生物提供氮源的是____________。②③号培养基中为微生物提供碳源
的有机物是_______________。
(2)用①号培养基从土壤悬浮液中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长
并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择_________菌落进一步纯化，选择的依据是__________
(3)若将土壤悬浮液接种在②号液体培养基中，培养一段时间后，甲、乙菌的比例会
_______________，其原因是_______________。
(4)假设从③号培养基中得到了高效降解m并能转变为丙酮酸的细菌，则在有氧条件下，丙酮
酸可为该菌的生长提供_______________。
9．佩戴口罩是预防病原体感染的有效措施。熔喷布是口罩生产的重要原料，其主要成分是聚
丙烯（分子式（C H）），其易降解程度是评价口罩合格性的重要指标之一。某研究小组从土
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壤中分离出高效降解聚丙烯的细菌，回答下列问题：
(1)该研究小组所用的培养基应以聚丙烯为唯一碳源，其目的是________。这样的培养基按功能
划分，属于______培养基。
(2)称取1.0g某土壤样品，转入适量无菌水中，制备成100mL菌悬液，经梯度稀释后，获得细
胞密度不同的菌悬液，分别取0.1mL菌悬液涂布在该固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液
培养后平均长出了60个高效降解聚丙烯的菌落，则该土壤样品约含高效降解聚丙烯的细菌
________个；在对该细菌进行扩大培养时，若持续增加培养基中营养物质的浓度，将不利于提
高菌种的种群密度，原因是______。
(3)为避免污染环境和传播病原体，废弃口罩作为垃圾进行收集转运时，必需先进行严格的
___________处理。
(4)若在3个细菌培养基平板上均接种稀释倍数为105的土壤样品0.1mL，培养一段时间，平板
上菌落数分别为35个、33个、34个，则可推测每克土壤样品中的细菌数为3.4X10-7个。运用
这种方法统计的结果往往较实际值偏小，原因是________。
10．自生固氨菌是土壤中能独立固定空气中氨气即细菌，将玉米种子用自生固氮菌拌种后播种，
可显著提高产量并降低化肥的使用量。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测
定的研究，部分实验流程如下图。回答下列问题：(1)步骤①土样应取自表层土壤的原因是______。
(2)下表为两种培养基的配方，步骤④应选其中的培养基____，原因是______。
培养基类
培养基组分
型
甘露醇（C H O）、KH PO 、MgSO 7HO、NaCl、KSO 、CaCO 、蒸馏水、
A培养基 6 14 4 2 4 4 2 2 4 3
琼脂
B培养基 蛋白胨、酵母提取物、NaCl、蒸馏水、琼脂
(3)步骤④所用的接种工具是________。若在④的平板上统计的菌落的平均数量为126个，则每
克土壤中含有的固氮菌为_____个。
(4)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48小时，经离心后收集下层细胞并转移至特定
培养中进行固氨能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，
科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验，30天后测定土壤微生物有机氮含量，结
果如下图。
注：CK：对照处理组：
N：尿素处理组（每盆土壤浇50mL有氮全营养液：成分为在1000mL无氮植物营养液中加入
0.12克尿素）
CM12：自生固氮菌CM12处理组（每盆土壤浇50mL接种自生固氮菌的无氮植物营养液）。
①对照组（CK）的处理为_________。②自生固氮菌较共生固氮菌（如根瘤菌）的应用范围更广，原因是___________。
