优化碱基编辑器的连接子长度,以实现精准的作物育种和基因治疗

单核苷酸变异（SNVs）对作物农艺性状的变异（Zhao等人，2011年）和人类遗传疾病（Hu等人，2018年）具有重要影响。与其他需要DNA双链断裂或供体模板的基因编辑技术不同，碱基编辑器（BEs）能够高效实现单核苷酸替换（Komor等人，2016年）。先进的碱基编辑器BE4max是通过将一种进化型的胞嘧啶或腺嘌呤脱氨酶与化脓性链球菌 Cas9切口酶（nSpCas9）连接而成的（Koblan等人，2018年）。最初的碱基编辑器仅限于C·G到T·A和A·T到G·C的转换（Komor等人，2016年；Gaudelli等人，2017年）。随着技术的进步，包括对DNA修复途径的修改以及使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）（Tong等人，2024年）、甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG）（Tong等人，2023a，2023b）等酶，现在可以直接编辑腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），从而实现了所有12种类型的点突变，大大扩展了碱基编辑器的应用范围。这些工具推动了基因功能研究（Kuscu等人，2017年；Yuan等人，2018年）、基因治疗（Komor等人，2016年；Liang等人，2017年；Zeng等人，2018年）、动物模型构建（Liu等人，2018年；Wang等人，2020年；Hu等人，2025年；Zhong等人，2025年）和精准育种（Zong等人，2017年；Li等人，2018年，2021年；Huang等人，2023年）的发展，凸显了它们在研究和生物技术中的不可或缺性。

尽管碱基编辑器在各种应用中表现出高效率，但其较宽的编辑窗口限制了精准编辑的进展（Komor等人，2016年）。编辑窗口指的是脱氨酶在单导向RNA（sgRNA）引导下能够有效催化碱基修饰的区域，通常覆盖几个到十几个碱基。当该窗口内存在多个可编辑的碱基时，脱氨酶会非选择性地修饰所有可访问的碱基，导致旁观者编辑。例如，乳腺癌易感基因1/2（BRCA1/2）（Findlay等人，2018年）和β-地中海贫血基因位点HBB（Liang等人，2017年）在活性窗口附近包含多个胞嘧啶（Cs），这些“旁观者碱基”容易发生意外编辑，从而影响碱基编辑的精准性。

在碱基编辑系统中，连接子对于将催化结构域（脱氨酶）与靶向结构域（Cas9蛋白）连接起来至关重要，以确保编辑的精准性和效率。第一代碱基编辑器由David Liu团队开发，使用了16个氨基酸组成的XTEN连接子（Komor等人，2016年）。后续的优化版本BE4max引入了改良的核定位信号（NLS）、32个氨基酸组成的连接子以及优化的密码子序列，提高了编辑效率（Koblan等人，2018年）。先前的研究表明，连接子长度和刚性都会影响碱基编辑的窗口和效率（Tan等人，2019年；Kuang等人，2021年；Zhao等人，2022年；Feola等人，2024年）。然而，目前我们对连接子属性如何影响编辑机制的理解仍然有限。大多数现有编辑器依赖经验确定的固定连接子长度，这限制了通过调整连接子长度来减轻旁观者效应的潜力。

因此，我们系统地研究了连接子长度如何调节碱基编辑效率和编辑窗口。我们开发了一种可调节的碱基编辑系统，通过改变连接子长度来调控编辑窗口。我们发现，将连接子长度缩短至7个氨基酸可以在保持目标编辑效率的同时显著缩小编辑窗口，从而减少旁观者效应。基于这些发现，我们开发出了高效且精确的碱基编辑器，适用于作物育种和基因治疗。进一步验证表明，这一策略适用于多种脱氨酶。

在水稻原生质体和再生植物中的实验表明，该系统在多个基因位点上提高了编辑精准度，有效减少了旁观者氨基酸变化，降低了早终止密码子的出现，并最小化了可变剪接的干扰。此外，我们在13个测试位点上成功修复了病原体SNVs，意外编辑减少了93.0%。总之，我们开发的短连接子碱基编辑器在推进精准作物育种和基因治疗方面具有巨大潜力。