如何使用好宏基因组分析软件:MetaWRAP 篇

1. MetaWRAP 软件介绍

MetaWRAP 开源的宏基因组分析流程工具 https://github.com/bxlab/metaWRAP，旨在提供一个易用、灵活且全面的数据分析流程，能够从原始测序数据开始，成宏基因组分析的核心任务。MetaWRAP 集成了多种主流生物信息学工具，支持以下关键模块：质量控制，拼接（metaSPAdes 或者 MEGAHIT 等），宏基因组分箱（使用 metaBAT2、MaxBin2 和 CONCOCT），多分箱引擎结果优化（Bin Refinement）

可以实现如下功能：

可视化与分类注释（Taxonomic Profiling）
基因组分箱（Binning）：整合 MetaBAT2、MaxBin2、CONCOCT 等多种分箱工具
分箱提纯与优化（Bin Refinement）：采用混合算法合并不同分箱结果，大幅提升 bin 的完整度和纯度, 这里需要注意的时候的地方该模块可以使用第三方的分箱结果，但是单次Bin Refinement 最大支持 3 个分箱引擎，如果提供更多的分箱引擎结果需要迭代多次。
分箱重装配（Reassemble Bins）
丰度估算与功能注释
结果统计与可视化

大家使用 MetaWRAP的核心功能主要是分箱（Binning）功能，特别是Bin Refinement模块，通过组合三个不同工具（MetaBAT、MaxBin、CONCOCT），可以显著提高高质量宏基因组组装基因组（MAGs）质量。

2. 值得关注的几个问题

2.1 分箱引擎选择

MetaWRAP可以提供很多丰富的模块组，但是该软件2020年后基本不再进行更新，很多功能模块不再是宏基因组数据分析的最佳实践，比如分箱模块MetaBAT、MaxBin 和 CONCOCT, 根据最新的测评文章 “Comprehensive benchmarking of metagenomic binning tools reveals key factors for improved genome recovery“ (https://www.nature.com/articles/s41467-026-71521-w) 的结果，基于神经网络的　COMEBin，SemiBin2-multi和VAMB-multi 在测评中胜出，需要特别注意的地方是，SemiBin2和SemiBin2-multi 以及VAMB-multi 和VAMB是不同的分箱策略，分箱效果是不同的，从结果看VAMB 要比 VAMB-multi 差很多，SemiBin2 可以使用单样本模式取代SemiBin2-multi。

使用 checkm2 评估 MetaBAT2, SemiBin2, Comebin 以及 metawrap bin_refinement的分箱结果

2.2 MAG 优化

针对 bin 优化问题，MetaWRAP 的Bin Refinement通过组合多个分箱引擎可以得到更多的 MAGs，这里大概有几个需要值得关注的地方：

不同的分箱优化工具，对 bin 的打分 score算法不同，直接导致最后优选出的 bins会有一些差别，比如有些 bin 使用 MetaWRAP 可以保留，但是在 DAS_tool流程中会被过滤掉。
合并 bin 的问题，DAS_tool 选择 score 最好的 bin, MetaWRAP 使用一种 “破坏性策略”（这里描述为不是单纯的 selector, 而是 refinement），可以通过通过多引擎交集策略选择并来自多个分箱工具中相似的 bin 的contigs，从而有效降低污染度。

2.3 性能问题

MetaWRAP分箱导致运行时间比较长的核心模块是 checkm (https://github.com/ecogenomics/checkm)，提升性能的策略是使用 checkm2 (https://github.com/chklovski/CheckM2/tree/main/bin) 替换 checkm。可以参考　”https://github.com/masalgar/metaWRAP/blob/master/bin/metawrap-modules/bin_refinement.sh“，速度提升接近4倍

这里需要注意的是：checkm2 和checkm 计算的污染度和完整度会有一些差别，所以无法完全重复 checkm的结果，从小规模测试结果（使用 checkm2 评估）显示，checkm2 的结果 MAGs 的数量会多于 checkm，污染度也会低于 checkm，但是完整度要稍微低于 checkm 的结果。

使用checkm2评估基于checkm1和checkm2的metawrap bin_refinement以及das_tool的最终结果

2.4 实践逻辑

最后推荐的实践方案：分箱选择 COMEBin(推荐 GPU环境)，SemiBin2（考虑到大规模项目，使用单样本模式可以规模化，推荐 GPU 环境）和 metabat2（速度快，CPU 即可）三个引擎，然后使用 MetaWRAP 核心功能模块 Bin Refinement 模块，并使用checkm2替换 checkm，同时确保较高的性能和质量。

MetaWRAP 需要和 checkm2使用不同的 conda环境，从容器部署的角度，可以将checkm2 和MetaWRAP 2个conda环境部署在同一个容器，在 bin_refinement.sh 显式指定对应的 checkm2完成软件层兼容，并在执行命令时将 checkm2 的数据库映射到容器内部/db 位置

该部分内容会集中到下一期宏基因组分箱培训课程。