生信人必学!AI蛋白质设计与AI多肽设计与AI基因编辑线上直播!

六大顶尖课程

01 AI多肽设计

02 AI蛋白质设计

03 AI抗菌肽设计

04 AI抗体设计

05 合成生物学与基因线路设计

06 AI基因编辑

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AI+多肽设计详细课表

AI多肽设计课表

Day 1：短肽设计基础、结构数据库与PyMOL可视化一、短肽设计的生物学基础

1.1 短肽分类与生物医学功能：系统讲解结合肽（binder）、功能肽、抑制肽、细胞穿膜肽（CPP）的定义与功能差异；重点阐述8–30个氨基酸线性短肽的优势（易合成、易修饰、适合蛋白-蛋白相互作用界面）与局限（稳定性差、蛋白酶易降解、细胞通透性低）。

1.2 短肽-蛋白结合界面的结构特征：介绍短肽在结合界面上的典型构象：α-螺旋、β-折叠、polyproline II螺旋、无规卷曲。

1.3 Hotspot残基与相互作用类型：深入讲解PPI界面中的hotspot理论：芳香族残基（Phe/Trp/Tyr）的π-π堆积、疏水残基的疏水作用、带电残基（Arg/Asp/Glu）的盐桥与氢键。

1.4 短肽设计的策略框架与流程概览：展示从“靶点选择”到“候选推荐”的完整闭环：靶点序列获取 → 候选生成（PepMLM/LigandMPNN）→ 性质筛选 → 结构评估（AF2）→ 界面分析 → 实验验证概念。

二、蛋白质结构数据库与Linux服务器基础

2.1 UniProt数据库：序列、功能域与注释检索：演示如何在UniProt中搜索靶蛋白、获取标准FASTA序列、查看功能结构域（Pfam）、亚细胞定位与疾病关联信息。

2.2 RCSB PDB数据库：结构检索与质量评估：讲解PDB数据库的搜索策略：按靶点名称、关键词、序列相似性检索；重点教授分辨率（resolution）判断、生物组装体（biological assembly）选择与实验方法（X-ray/Cryo-EM/NMR）差异。

2.3 FASTA与PDB文件格式解析：通过文本编辑器直接打开FASTA和PDB文件，讲解文件头信息、序列记录、ATOM记录、链标识（chain ID）与残基编号规则。

2.4 Linux基础命令与服务器连接：SSH连接方法、文件系统导航（cd/pwd/ls）、文件查看（cat/head/tail）、路径概念（绝对路径vs相对路径）。三、PyMOL三维结构可视化实操

3.1 PyMOL核心概念与界面导航：讲解Object、Chain、Residue、Atom、Selection的层级关系；演示GUI界面与命令行双模式操作，加载示例结构1YCR（p53-MDM2复合物）。

3.2 复合物结构加载与多样化显示：练习cartoon、surface、sticks、spheres、lines等多种显示模式的切换与组合；按chain着色（color by chain）、按B-factor着色（反映pLDDT质量）。

3.3 结合界面识别与距离测量：使用PyMOL selection语言选取短肽链（如chain B）及其周围5 Å范围内的靶蛋白残基；使用distance命令测量关键原子间距离，识别hotspot相互作用对。

3.4 高清图片渲染、标注与结果保存：学习ray渲染、标签添加（label）、视角保存（scene）与高清图片输出（png 300dpi）；输出1张带标注的p53-MDM2结合界面图。

Day 2：蛋白质语言模型、ESM2原理与Jupyter入门一、从自然语言到蛋白质语言模型

1.1 机器学习基本概念：输入、模型、输出、训练与推理：用“识别手写数字”到“ChatGPT对话”的类比，讲解机器学习四要素：输入数据（features）、模型架构（architecture）、参数（parameters）、损失函数（loss）；区分训练（training，模型学习参数）与推理（inference，模型预测新数据）两个阶段。

1.2 自监督学习与掩码语言建模（MLM）原理：解释“没有人工标签时如何学习”：MLM通过随机遮盖输入序列中的部分token，让模型根据上下文预测被遮盖的内容；在蛋白质中，即遮盖某个氨基酸，根据周围残基预测该位置的氨基酸类型。

1.3 Transformer架构与注意力机制：用可视化图示讲解Self-Attention的核心思想：序列中每个位置都能“看到”其他所有位置，并根据相关性分配注意力权重；解释为什么Transformer能捕捉蛋白质中远距离残基的共进化关系。

1.4 蛋白质序列的Token化与上下文学习：将20种标准氨基酸对应为20个token（加特殊token共约33个）；蛋白质序列即“句子”，同源家族即“语法规则”，保守位点即“高频词”，让学员建立直观的NLP→蛋白质类比。二、ESM2蛋白质语言模型体系

2.1 ESM系列模型演进：回顾ESM-1b（650M参数）→ ESM-2（8M到15B多规格）→ ESMFold（结构预测）→ ESM-IF（反向折叠）的发展脉络；说明ESM-2是当前蛋白质序列表示的state-of-the-art模型。

2.2 ESM2-650M架构解析：讲解33层Transformer、1280维embedding、约6.5亿参数的规模；说明ESM2在UniRef50上自监督预训练，蛋白质家族的进化约束与结构倾向。

2.3 ESM2在短肽评估中的应用：Perplexity打分：讲解perplexity（困惑度）的直观含义：模型认为该序列“像不像”天然蛋白质；perplexity越低，序列越符合天然蛋白质的统计规律，可作为短肽“天然性”的初筛指标。

2.4 从ESM2到PepMLM：微调策略与条件化生成：解释PepMLM如何在ESM2-650M基础上，使用PepNN和Propedia数据库中的肽-蛋白配对数据进行微调；核心变化：将靶蛋白序列作为条件（condition），强制模型学习“给定靶点，生成结合肽”的映射关系。

三、Jupyter入门与ESM2评分实操

3.1 Jupyter Lab界面导航与单元格操作：演示启动Jupyter、浏览器访问、新建notebook、代码单元格（code cell）与Markdown单元格的区分；讲解运行（Run）、中断（Interrupt）、重启内核（Restart Kernel）的操作场景。

3.2 Python基础：变量、字符串、列表与print输出：教授当天必需的Python最小知识集：变量赋值（sequence = "ACE"）、字符串拼接、列表创建（["A","C","E"]）；所有概念均与ESM2评分脚本中的实际代码对应。

3.3 ESM2评分脚本运行与参数修改：打开教师提供的esm2_score.ipynb，演示加载transformers库、加载ESM2-650M模型、输入FASTA序列、获取per-sequence perplexity的完整流程。

3.4 Perplexity结果解读与对比分析：分别对3条天然结合肽、3条随机打乱序列、3条全丙氨酸序列运行评分，记录结果并对比；讨论：为什么天然肽perplexity最低？随机序列为什么分数高？全丙氨酸序列说明什么？

Day 3：PepMLM短肽生成、PPL评估与Python数据处理一、PepMLM短肽生成核心原理

1.1 PepMLM方法概述：靶序列条件化的掩码语言模型：系统讲解PepMLM的输入输出：输入 = 靶蛋白序列（≤500 aa）+ 目标肽长度参数；输出 = N条候选肽序列 + 对应的PPL分数；强调PepMLM是“完全基于序列”的设计工具，无需结构输入。

1.2 核心创新：肽区域全掩码与条件概率重建：深入解析掩码策略：将靶蛋白序列与肽序列拼接，对肽区域全部设为[MASK]，模型需要根据靶蛋白上下文重建整个肽序列；这种“条件化重建”迫使模型学习靶点-肽的配对关系。

1.3 Top-k采样策略：平衡多样性与生成质量：讲解解码策略：在每个氨基酸位置，模型输出20种氨基酸的概率分布；top-k采样（论文使用k=3）指从概率最高的3个候选中随机选择，而非总是选概率最高的；k值越大，多样性越高，但可能引入低质量残基。

1.4 伪困惑度（PPL）评估体系与阈值解读：详细讲解PPL的数学定义与生物学意义：PPL反映模型对“该肽作为靶点结合剂”的置信度；

1.5 PepMLM的方法边界与适用范围：PepMLM计算候选（in silico），de novo设计等。

二、Python数据处理与配置文件基础

2.1 Python字典与列表：理解结果数据结构：讲解列表（有序集合，用于存储多条序列）和字典（键值对，用于存储序列-分数映射）的基本操作；查看PepMLM输出的JSON/CSV文件，识别其中的列表和字典结构。

2.2 YAML配置文件格式与参数读写：介绍YAML的语法规则（缩进表示层级、键值对格式）；识别target_fasta、peptide_length、num_sequences、top_k等关键参数的含义与修改方法。

2.3 Pandas表格操作：读取、排序、过滤与统计：演示pandas.read_csv()读取结果、sort_values()按PPL排序、条件过滤（如去除含Cys过多的序列）、基本统计（mean/median/count）；完成从原始结果到筛选表的转换。

2.4 Matplotlib基础：PPL分布直方图绘制：绘制PPL分布图、标记阈值线、直观判断生成质量。三、PepMLM短肽生成与筛选实操

3.1 配置靶点FASTA、肽长度与采样参数：选择标准靶点，修改config.yaml中的目标序列路径、肽长度（默认12 aa）、生成数量（50条）、top-k值（3）。

3.2 运行生成脚本与实时监控输出日志：在命令行执行python pepmlm_generate.py，观察终端输出的进度条、每条生成肽的序列与PPL值。

3.3 结果清洗：去重、去除非标准氨基酸与长度过滤：运行清洗脚本，去除重复序列、含非标准氨基酸（B/J/O/U/X/Z）的序列、与设定长度不符的序列；统计清洗前后的序列数量变化。

3.4 PPL排序、性质统计与Top 20候选输出：使用pandas按PPL升序排列，计算每条肽的净电荷（pH 7）、疏水氨基酸比例、芳香族残基数量、半胱氨酸数量；综合PPL与性质指标，人工精选Top 20候选，导出为CSV备用。

Day 4：复合物结构预测评估、PyMOL界面分析与批量处理一、深度学习蛋白质结构预测原理

1.1 结构预测方法演进：从同源建模到深度学习：回顾SWISS-MODEL、I-TASSER、Phyre2等传统方法的核心思想与局限；讲解深度学习时代AlphaFold2的突破性贡献：Evoformer架构、MSA（多序列比对）与配对表示（pair representation）联合进化。

1.2 AlphaFold2与AlphaFold-Multimer的核心差异：明确区分AF2（单链结构预测，输出pLDDT）与AF-Multimer（多链复合物预测，额外输出ipTM与PAE）。

1.3 三大评估指标详解：pLDDT、ipTM、PAE：pLDDT（per-residue predicted LDDT）、残基对误差矩阵、界面区域PAE介绍。

1.4 短肽-蛋白复合物预测的特殊挑战：讲解短肽复合物预测的三大难点：① 肽链柔性大、构象空间大；② 训练数据中短肽复合物占比低；③ 弱亲和力界面信号弱；说明为什么AF-Multimer对短肽的预测confidence通常低于单域蛋白，以及如何谨慎解读结果。

二、复合物结构评估与PyMOL界面分析

2.1 加载预计算AF2结果：pLDDT着色与质量判断：在PyMOL中加载pdb文件，使用color by b-factor直观展示pLDDT分布，识别低置信度区域。

2.2 界面接触残基识别：距离阈值与原子对筛选：使用PyMOL selection命令选取肽链与靶蛋白中距离<5 Å的原子对；利用find_pairs或自定义脚本输出接触残基列表；区分“主链-主链”“主链-侧链”“侧链-侧链”接触类型。

2.3 关键相互作用类型判断：氢键、盐桥、疏水堆积：结合PyMOL可视化与距离测量，识别界面上的典型相互作用：氢键（N-O距离2.5-3.5 Å）、盐桥（带电残基对<4 Å）、疏水堆积（芳香环平面间距<5 Å）。

2.4 PAE矩阵热图解读与预测可靠性评估：在Jupyter中绘制PAE热图；重点观察肽残基（链B）与靶蛋白残基（链A）交叉区域的PAE值。

三、Python批量评估与自动化处理

3.1 Python循环与条件判断：批量处理结构文件：教授for循环遍历文件列表、if条件判断筛选高质量结构，批量读取多个AF2结果的ipTM值，自动筛选ipTM>0.7的候选。

3.2 界面接触自动提取脚本运行与结果整理：自动从pdb文件中提取肽-蛋白界面接触残基对；修改脚本中的距离阈值（如从5.0改为4.0 Å），观察接触数变化，理解参数敏感性。

3.3 路径A候选肽的结构评估表填写：将Day 3生成的Top 20候选中已预计算AF2结构的肽，逐一填写评估表：序列、PPL、ipTM、pLDDT均值、界面接触数、关键相互作用、综合评级（推荐/保留/淘汰）。

Day 5：结构驱动设计、LigandMPNN优化一、结构驱动的短肽设计原理

1.1 传统固定骨架设计：Rosetta能量函数与Rotamer库：回顾RosettaDesign的经典流程：输入蛋白质主链骨架 → 能量函数评估 → rotamer库侧链packing → 输出最优序列；说明传统方法依赖物理能量函数，计算成本高且对骨架质量敏感。

1.2 ProteinMPNN：图神经网络学习Structure-to-Sequence映射：讲解ProteinMPNN的核心创新：将蛋白质主链看作图（节点=残基，边=空间邻近关系），使用图神经网络（GNN）直接学习“骨架 → 最优序列”的映射；相比Rosetta，ProteinMPNN更快、更准确、对骨架误差更鲁棒。

1.3 LigandMPNN：显式建模非蛋白原子与短肽链：在ProteinMPNN基础上，讲解LigandMPNN对非蛋白原子（小分子、核酸、金属离子、肽链）的显式建模。

二、短肽成药优化

2.1 线性短肽的成药瓶颈：稳定性、通透性、免疫原性：系统讲解短肽面临的三大障碍：胃肠道蛋白酶快速降解、难以穿越肠上皮屏障、潜在的免疫原性反应。

2.2 化学修饰策略：环化、订书肽、非天然氨基酸：介绍提升短肽稳定性的常用化学手段：① 头尾环化（end-to-end cyclization）或侧链-侧链环化（如R4-R10内酰胺桥）；② 订书肽（stapled peptide，烯烃桥锁定α-螺旋）；③ 非天然氨基酸替换（如N-甲基氨基酸、D-型氨基酸抵抗蛋白酶）。

2.3 递送策略：细胞穿膜肽融合、纳米颗粒封装：讲解短肽进入细胞的递送方案：与CPP（如TAT、Penetratin）融合、脂质纳米颗粒（LNP）封装、外泌体靶向递送，说明短肽作为蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）配体的应用前景。三、LigandMPNN固定骨架优化实操

3.1 复合物骨架PDB准备与链指定：识别靶蛋白链（chain A）与肽链（chain B），确认肽链的残基编号范围；讲解PDB文件格式中链标识与原子坐标的对应关系。

3.2 LigandMPNN参数配置：温度、采样数、设计区域：打开config_ligandmpnn.json，讲解关键参数：temperature（温度，控制序列多样性，建议0.1-0.3）、num_seq_per_target（每条骨架输出序列数）、fix_selected_chains（固定靶蛋白链）、redesigned_chains（重设计肽链）；学员根据靶点修改参数。

3.3 序列重设计与结果对比：原肽vs优化肽：运行python run_ligandmpnn.py，获取LigandMPNN设计的新肽序列；将输出序列与原始PDB中的肽序列进行比对，观察：哪些位置被保守保留？哪些位置发生了突变？突变残基的理化性质变化（如疏水→带电）可能带来什么影响？3.4 优化序列的AF2-Multimer验证与PPL交叉评估：对比原始肽与优化肽的ipTM、pLDDT、界面接触数；同时用Day 2的ESM2评分脚本对优化肽打分，观察perplexity变化；建立“结构优化序列也应具有低perplexity”的交叉验证思维。

通过课程学习您将得到

让学员更好的知道当下蛋白质设计的核心热点以及优势能独立完成蛋白结构可视化：用 PyMOL 加载复合物、识别结合界面、测量相互作用、渲染高清结构图。能使用 ESM2 完成序列评分，用 PepMLM 实现靶标定向短肽生成，并通过 Python 完成数据清洗、筛选与可视化。能用 AF2/Multimer 预测肽 - 蛋白复合物结构，解读 pLDDT/ipTM/PAE 指标，完成界面分析与质量评估。能用 LigandMPNN 基于固定骨架优化短肽序列，结合多指标完成候选肽筛选与成药优化方案设计。建立AI 短肽设计完整思维闭环：靶点选择→候选生成→性质筛选→结构评估→优化验证。具备独立解决实操问题的能力，能合理解读 AI 预测结果、规避模型局限，输出可实验验证的短肽候选。掌握跨工具联用能力，实现 ESM2、PepMLM、AF2、LigandMPNN、PyMOL 的流程化配合使用。

AI蛋白质设计详细课表

AI蛋白质设计课表

一、熟悉超算环境与蛋白质从头设计实践

1.环境搭建：Linux，VS code，Jupyter notebook*

a)超算的登录

b)Linux系统的常用shell命令：vim, ls, cd, less, rm等；

c)一些package安装的常用命令：pip, conda, source等。

d)Jupyter notebook的安装和使用。

e)VS code的基本配置：连接服务器；选择不同python版本的Interpreter；debug模式的使用等。

2.基础知识讲解

a)三类方法在不同程度上探索蛋白质序列空间：

i.蛋白质定向进化（directed evolution）

ii.固定蛋白质主链的序列设计（Fix-backbone protein design）

iii.蛋白质的从头设计（De novo protein design）

b)关键数据库：RCSB PDB， SCOPe， CATH， UniRef， BFD等

c)常见概念和名词： rotamer， scaffold， motif，domain，backbone，side-chain，apo和holo结构，

d)使用的不同模型的原理，transformer，diffusion模型，Flow Matching等。

3. Rfdiffusion3+ProteinMPNN生成序列

a)Rfdiffusion3生成蛋白质骨架结构，ProteinMPNN精细的生成氨基酸序列。

b)Rfdiffusion3的安装实操

c)Rfdiffusion3的使用实操

d)ProteinMPNN的安装实操

e)ProteinMPNN的使用实操

f)Rfdiffusion+ProteinMPNN生成序列，AphaFold2筛选序列。整体实操流程：

i.计算SAP（Spatial Aggregation Propensity）的值，选择3-6个氨基酸作为hotspot，即结合位点；这里需要使用Rosetta进行计算，首先将安装rosetta，准备蛋白，再计算每一个氨基酸的SAP值，将SAP数值映射到结构上。选择hotspot位点。

ii. Rfdiffusion结构设计，生成~10000个蛋白质主链结构；

根据上面挑选得到的hotspot位点，更改相应的hotspot参数，生成新的结构

iii.ProteinMPNN-FastRelax进行序列设计，每一个主链结构两个对应的序列，共设计~20000个序列；

iv.筛选:使用AlphaFold2预测设计结构，预测的置信度pAE<10，预测结构与设计结构的RMSD<1A，从中挑选95个进行实验验证。

4.其它的蛋白质设计方法的实操*

a)BindCraft——序列生成和筛选的自动化实现

BindCraft相比于Rfdiffusion+ProteinMPNN更加用户友好，一站式设计流程，序列的生成和筛选自动化实现。将讲解其中参数的设计和选择，如过滤序列条件、生成氨基酸的偏好性等。使用包括置信度评分（如AlphaFold2预测得到的pLDDT、ipTM）、物理指标（如Rosetta界面能量）和序列特征（如疏水性比例）进行筛选。

b)MIT开发的Bolzgen方法原理、安装使用讲解。

安装和使用boltzgen讲解，将详细讲解yaml配置文件的写法，以一个靶点为例，从头生成VHH与该靶点结合。

c)PPIFlow：基于flow-matching的生成方法，原理，安装和使用方法。

二、蛋白质结构预测和分析

1.蛋白质结构预测方法

1)从CASP比赛结果来简述蛋白质结构预测方法的发展。基于能量函数 -> 接触图的应用 -> 端到端的预测结构（AlphaFold2）。

2)AlphaFold2的模型相比于以前的方法有什么改进

a)将基于MSA和基于模板的方法整合，使用注意力机制进行MSA信息和模板信息的相互交流。

b)以前提取MSA信息为计算协方差矩阵，AlphaFold2创造性的直接将MSA信息作为输入，将图像识别的算法转变成了自然语言处理算法，减少了中间处理过程中的信息损失。

3)AlphaFold3相比于AlphaFold2改进了什么，还有什么不足。

a)扩展到了多种生物分子的复合物结构预测，包括蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-小分子，并使用扩散模型。

b)复合物组装与动态预测缺陷，抗体-抗原复合物结构准确度有待提高。

4)运行网页server上的AlphaFold3预测结构

5)如何使用AlphaFold3预测蛋白质的糖基化，不同糖基化的类型的输入方法。

6)AlphaFold3输出结果分析，各项置信度指标的含义，以及如何判断预测的准确度，如pLDDT，ipTM，PTM，PAE。

7)本地部署和运行ColabFold，由于AlphaFold3在安装过程中需要下载大量资源，且不能商用，因此不演示AlphaFold3的安装过程，如有问题可以帮助解决。

2.蛋白质结构分析和可视化

1)pdb文件的解读，每一行中的内容代表什么含义。

2)用 pymol 可视化蛋白质结构*

a)pymol的基础操作讲解

b)如何将实验值投影到结构图的颜色上，如何画出发表文章中好看的图

3)计算蛋白质结构中两个氨基酸的距离*

a)使用python的文本文件操作实现

b)使用python中biopython包实现

3.蛋白质结构相关物理性质的计算*

1)二级结构的分类和计算

2)溶剂可及表面积（SASA）的讲解及计算

三：蛋白质序列分析，数据挖掘和训练数据准备

讲解和实操：

1.获得同源序列

1)了解不同蛋白质序列库，如UniRef90，UniClust30，Pfam等

2)了解不同工具原理并使用：NCBI BLAST，Jackhmmer，HHblits

3)给定一条蛋白质序列，比对序列库，生成多序列比对（MSA）*

2.对MSA进行频率分析*

1)使用python的文本文件操作实现

2)使用python中biopython包实现

3)绘制序列Logo，可视化的展示每个位点的氨基酸频率和保守性

3.序列的同源性计算和进化树的绘制*

1)不同同源性的计算方法及应用情景，氨基酸序列的identity和Similarity，BLOSUM62的介绍。

2)进化树的绘制

4.基于序列相似性阈值划分训练集和测试集*

1)为什么要做？避免数据泄露

2)选择相似性度量方法

3)相似性矩阵的计算

4)划分数据集

5.大规模蛋白质序列的聚类分析和去冗余*

1)为什么要做？防止过度学习某一类序列特征，消除序列偏差；也能防止训练过程中数据泄露。

2)聚类方法的选择，CD-HIT、MMseq2和Linclust

3)选择代表序列，去冗余

4)实际复现S2ALM这一模型文章中的聚类方法。mmseqs easy-cluster examples/DB.fasta clusterRes tmp --min-seq-id 0.7 -c 0.8 --cov-mode 1

四、蛋白质的大语言模型及其应用

1.基础知识讲解

1)介绍蛋白质的语言模型（26字母语言模型->20氨基酸字母表，上下文依赖->氨基酸的共进化）

2)为什么要开发蛋白质大语言模型？1. 相比于结构或功能信息，序列信息更加海量；2. 蛋白质序列通过进化而来，可以学习蛋白质基本规律，折叠，共进化等

3)模型架构和基础理论：transformer，多头注意力机制，Bert，GPT，T5等

2.基于Bert架构的蛋白质语言模型

1) ESM系列（ESM-1b、ESM-1v、ESM2、ESM C）

2)ESMFold：无需MSA信息的结构预测

3)使用抗体序列库训练的语言模型：Ablang，AntiBERTy

3.类似GPT的生成模型ProGen

1)36层Transformer解码器架构，包含12亿参数

2)引入“控制标签”（如蛋白质家族ID、功能属性）作为输入，生成蛋白质序列空间以外的新的蛋白质序列

3)成功生成新的溶菌酶

4.多模态的蛋白质语言模型ESM3

1)模型架构融合序列，结构和功能信息

2)相比于ESMFold，单体结构预测精度更好

3)基于多模态提示（序列、结构、功能关键词）设计新的蛋白质序列

4)ESM3的安装，生成序列，快速结构预测。*

5.蛋白质语言模型的应用和实战演练*

1)获得序列embedding以构建下游模型（Cell systmes文章举例），从文章github仓库中提炼序列embedding的代码并学习使用。

2)使用不同的蛋白质语言模型，零样本的预测蛋白质突变效应。

3)给定少量的突变效应数据作为训练数据，训练模型，预测新的突变效应值。

五、深度学习辅助酶设计

1.基础知识讲解

酶的过渡态理论，theozyme，fitness landscape，epistasis

2.酶学性质预测

1.DLKcat与GotEnzyme数据库介绍

2.UniKP:利用预训练模型挖掘、改造Kcat

3.CLEAN:基于对比学习的EC号预测挖掘稀有脱卤酶

3.蛋白质热稳定性改造

1.MutCompute介绍

2.利用MutCompute改造PETase(Nature)

3.ThermoMPNN介绍与使用*

4. Pythia介绍与使用*

4.从Frances H. Arnold（2018年因在酶的定向进化领域的贡献获得诺贝尔化学奖）的工作看酶的定向进化方法的发展

1.传统定向进化实验流程

2.MLDE（Mechine Learning Directed Evolution），学习序列与酶性能之间的映射关系，推荐新的突变组合（PNAS文章）

3.ftMLDE（focused training MLDE），主动学习流程，构建informative的训练数据（Cell Systems文章）。零样本突变效应预测挑选数据集，再通过小样本数据训练的策略微调。

5.酶的从头设计

1.从头设计Diels-Alder催化酶

a)基于Rosetta的Inside-out策略（Science文章）

b)通过Foldit蛋白质折叠游戏改善结构问题（Nat. Biotechnol.文章）；

c)Foldit蛋白质折叠游戏的实践*

2.从头设计荧光素酶，Family-wide hallucination，基于该酶家族的结构幻化出新的结构（Nature文章）

3.RFdiffusion+PLACER从头设计丝氨酸水解酶（Science文章）

6. 利用预测结构的相似性，挖掘序列的新酶功能（复现顶刊cell文章）*

1.InterPro数据库中下载数据

2.TM-score计算结构距离

3.UPGMA结构聚类，画出进化树

4.挑选序列

六、蛋白质功能与互作预测；实验验证与AI模型训练预测闭环

1.蛋白质功能预测：

1)基础知识：

a)基因本体论（Gene Ontology, GO），

b)MF/BP/CC，MF Molecular Function分子功能；BP Biological Process生物过程；CCCellular Component 细胞组分。

c)GAF (GO Annotation File) 文件。

d)本体文件来理解GO术语之间的层次关系。

e)解析GAF，提取蛋白质ID和GO ID。

2)DeepGO-SE，通过蛋白质的语言模型提取序列嵌入，预测蛋白质的功能

3)DPFunc：先用蛋白语言模型提取残基特征，再在接触图上用 GCN 学习结构信息，并引入结构域（domain）指导，最后把多层特征映射到 GO 图上，显著提升对罕见功能项和低序列相似蛋白的预测精度

4)Prot2Text-V2模型。Prot2Text-V2将图神经网络（Graph Neural Network, GNN）与大型语言模型（Large Language Model, LLM）融合到同一个编码器-解码器框架中，有效整合了包括蛋白质序列、结构和文本注释在内的多种数据，以自由文本形式输出蛋白质功能预测结果

5)ProteinKG65构建蛋白质知识图谱，基于Gene Ontology (GO) 和 UniProt 等权威知识库，将蛋白质的功能、结构、相互作用等知识组织成图谱形式，支持下游的机器学习任务，如蛋白质功能预测、表示学习、药物靶点发现等

2.蛋白质相互作用预测：

Science文章：使用更深的进化信号：omicMSA+新的深度学习网络：RF2‑PPI。在全人类蛋白质组中筛出一批高置信度的互作，用于补齐人类互作图谱、解释疾病突变和蛋白功能。

1. 更深的进化信号：omicMSA

从约 30 PB 的未组装基因组/转录组数据里挖人类蛋白的同源序列，而不仅仅依赖 UniRef 等传统数据库。

构建omicMSA，使得每个蛋白的深度比常规模板 MSA 深 7 倍左右，协同进化信号显著增强。

2. 新的深度学习网络：RF2‑PPI

AI+抗菌肽设计详细课表

AI抗菌肽设计课表

第一天：基础环境与抗菌肽入门

抗菌肽基础理论

1.抗菌肽的重要性与应用前景：阐述多重耐药菌的严峻挑战，以及抗菌肽作为新型抗菌剂的独特优势（快速杀菌、不易产生耐药性）。

2. 抗菌肽的定义、分类与作用机制：明确抗菌肽是生物体先天免疫产生的短肽，重点讲解以破坏细胞膜为主的作用机制，这是其设计的重要物理基础。

3.抗菌肽的理化特性：深入剖析决定其活性的关键参数：

两亲性：亲水与疏水残基在空间上的排列，影响其与细胞膜的相互作用。

净正电荷：通常为正值，使其能吸引带负电的细菌膜。

螺旋性：常见的二级结构，影响其插入膜的能力。

4.从天然到人工的设计原则：分析天然抗菌肽的结构特征，总结出人工设计所遵循的基本规则，如特定氨基酸组成比例、电荷范围等。

上机操作

手把手带领学员搭建稳定、可复现的AI科研环境，克服入门的第一道技术门槛。

1.Linux基础入门：针对生物背景学员，讲解必备命令。如使用cd、ls导航和查看目录；chmod管理文件权限；grep、pip进行文本搜索和包安装。

2.Conda及Jupyter Notebook安装与配置：演示如何用Conda创建独立的Python环境，避免包冲突。并配置Jupyter Notebook在此环境中运行。

3.Jupyter Notebook基础使用：指导学员创建第一个Notebook，混合使用Markdown撰写实验笔记和代码块执行Python命令，形成良好的可重复研究习惯。

第二天：抗菌肽数据库与序列分析

核心目标：掌握数据获取与处理的技能，学会从权威数据库中提取并格式化分析所需的序列数据。

抗菌肽数据库介绍

1.APD3数据库：介绍其基于活性的分类系统，如何根据目标微生物快速查找相关肽序列。

2.DRAMP数据库：强调其包含抗菌肽、抗癌肽、抗病毒肽的全面性，以及丰富的注释信息（如修改、构象）。

3.CAMP数据库：重点介绍其集成的在线预测工具，可作为后续模型结果的初步验证参考。

上机操作—Python生物信息学实战

1.Python基础编程：快速掌握变量、列表/字典数据结构、for/while循环、if条件判断及函数定义，为后续脚本编写打下基础。

2.Python 进阶：学习导入os, pandas等模块；使用pandas的DataFrame高效管理序列数据表；掌握Biopython核心对象Seq和SeqRecord，用于读取、处理和写入FASTA等格式文件。

3.实战演练：

编写脚本，通过APD3的本地文件，自动检索具有特定长度和电荷范围的抗菌肽。

编写函数，将下载的多条序列从FASTA格式批量转换为包含序列名、序列字符串、长度等信息的CSV表格，便于后续分析。

第三天：AMP-Diffusion架构解读

核心目标：深入理解当前AI蛋白质设计的核心模型原理，并学会提取可用于下游任务的序列特征。

Transformer核心原理及在蛋白语言模型中的应用

1.注意力机制与Encoder Block：摒弃复杂数学，用“信息聚焦”的比喻讲解Self-Attention如何让序列的每个位置都能关注全局信息，这是理解一切现代蛋白模型的基础。

2.序列建模基础：解释如何将氨基酸字母（如A, R, N）转化为数字向量（Token Embedding），并添加位置编码以保留序列顺序信息。

3.ESM-2模型介绍：阐述ESM-2作为一个基于Transformer架构、在海量蛋白质序列上训练而成的“蛋白质大语言模型”，其输出的Embedding（嵌入向量）如何浓缩了该序列的结构与功能语义信息。

上机操作—提取与利用序列Embedding

1.环境配置：在Conda环境中安装pytorch和transformers库。

2.提取ESM-2 Embedding：编写代码，加载预训练的ESM-2模型，输入一条示例抗菌肽序列，提取其最后一个隐藏层的所有氨基酸位点特征或池化后的整体序列特征。ESM-2 Embedding 打分与分析。

3.Embedding打分与分析：演示如何计算不同抗菌肽序列Embedding之间的余弦相似度，以量化它们的“功能性相似度”；或使用PCA降维后可视化，观察活性肽与非活性肽在嵌入空间中的分布差异。

第四天：AMP-Diffusion模型实践与序列生成

核心目标：掌握扩散模型生成抗菌肽序列的全流程，并实现基于理化参数的可控设计。

抗菌肽扩散模型原理与应用

1.生成式模型基础对比：简要对比VAE、GAN和扩散模型在生成数据时的核心思想与优劣，突出扩散模型在生成质量和稳定性上的优势。

2.AMP-Diffusion架构详解：重点讲解“条件扩散过程”。解释模型如何在训练时学习从添加噪声的序列逐步去噪恢复为原始序列，并在生成时通过输入特定的条件向量（如目标电荷值、疏水性值）来引导去噪方向，从而生成符合要求的序列。

3.可控生成策略：详细说明如何将计算得到的净电荷、疏水性指数等具体标量参数，通过一个条件编码网络，融入模型的每一步生成过程中。

上机操作—从配置到生成

1.环境配置：根据提供的AMP-Diffusion项目README，安装特定版本的依赖库，配置模型路径。

2.加载模型与参数设置：学习加载预训练好的生成器和条件编码器，并理解关键参数如生成步数、噪声调度器的意义。

3.执行可控生成：编写循环，系统性地生成不同“电荷-疏水性”组合条件下的抗菌肽序列（例如，高电荷高疏水、高电荷低疏水等各100条）。

4.基础分析：对生成的数百条序列进行快速统计分析，绘制序列长度分布直方图，并验证其平均电荷和疏水性是否与设定条件相符，评估模型的可控性。

第五天：计算筛选、排序与设计验证

核心目标：建立多级计算评估流程，从海量生成序列中筛选出高活性、低毒性的候选者，并形成最终报告。

多维度计算评估体系

1.抗菌活性预测原理：介绍amp-scanner-v2等工具背后的深度学习模型（通常是CNN或Transformer），如何将序列Embedding映射为活性概率分数。

2.安全性评估方法：讲解ToxinPred和HemoFinder等工具的使用逻辑与置信度解读。

3.理化特性验证标准：建立多参数综合评价体系，明确活性分数、毒性概率、溶血概率、实际电荷/疏水性与设计目标的偏差等指标的权重，形成可量化的排序标准。

上机操作

1.活性预测：对第四天生成的所有序列，调用amp-scanner-v2模型进行批量活性评分，筛选出高于阈值的序列。

2.安全性筛选：对上一步的活性候选序列，依次使用ToxinPred和HemoFinder进行毒性与溶血性预测，剔除高风险的序列。

3.多级筛选与排序：编写脚本，综合活性评分、毒性/溶血概率、与目标理化性质的契合度，计算一个综合优先级得分，并对所有通过初步筛选的序列进行排序。最终报告生成：列出Top 20-50的候选序列，并包含其序列字符串、长度、预测活性分数、预测毒性概率、关键理化性质等完整信息，为后续的化学合成与湿实验验证提供明确指导

通过课程学习您将得到

独立完成Linux+Python+Conda+Jupyter科研环境搭建与基础运维，适配 AI 抗菌肽设计流程。熟练使用 Biopython、Pandas 完成抗菌肽序列获取、清洗、格式转换与批量分析。掌握 ESM2 序列 Embedding 提取、相似度计算与降维可视化。独立运行AMPDiffusion实现按电荷 / 疏水性可控生成抗菌肽序列。完成抗菌肽活性、毒性、溶血批量预测，建立多级筛选流程并输出 Top 候选序列。三、能力目标形成AI 抗菌肽完整设计思维：数据库挖掘→序列特征提取→AI 可控生成→多指标计算评估→实验候选推荐。具备跨工具联用能力，实现数据库、Python、ESM2、AMP、Diffusion、预测工具的流程化配合。能独立解决实操问题，合理解读 AI 生成与预测结果，输出可直接用于湿实验验证的方案。

AI抗体设计课表内容

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一、代码基础，抗体基础，介绍各大药企在AI辅助抗体药物开发上的布局，复现GSK在抗体亲和力成熟上的工作

1. 代码基础知识讲解，环境搭建：Linux，VS code*

a) 超算的登录

b) Linux系统的常用shell命令：vim, ls, cd, less, rm等；

c) 一些package安装的常用命令：pip, conda, source等。

d) VS code的基本配置：连接服务器；选择不同python版本的Interpreter；debug模式的使用等。

2. 抗体基础知识讲解：

a) VDJ重排，germline，CDR区域，表位（epitope/paratope），抗体亲和力成熟，抗体的可开发性等概念介绍

b) 不同抗体编号方案（Kabat，Chothia，IMGT）讲解，使用python自动化对抗体序列编号，并识别CDR区域*

c) 抗体药物开发的基本流程

3. 各大药企在AI辅助抗体药物开发上的布局：讲解各大药企公司发表的文献及报告:

a) Genetech的lab-in-the-loop,结合了实验和计算方法的迭代优化策略的工作

b) Genmab手动建立了多样性的抗体可开发性数据集,以进行可开发性数据的训练和预测.

c) GSK、阿斯利康、诺和诺德等在抗体亲和力成熟上做的工作等。

4. 抗体结构预测

1) 通用蛋白结构预测模型：AlphaFold3。

u 运行网页server上的AlphaFold3预测结构，https://alphafoldserver.com*

u AlphaFold3输出结果分析，各项置信度指标的含义，以及如何判断预测的准确度，如pLDDT，ipTM，PTM，PAE。

u AlphaFold3的安装过程讲解。

a) 抗体专用结构预测模型：ImmuneBuilder，IgFold。实操如何在服务器安装和使用。

5. 复现GSK在抗体亲和力成熟上的工作*

第二天

二、基于大语言模型的抗体亲和力成熟。

1. 基础知识讲解

1) 介绍蛋白质的语言模型（26字母语言模型->20氨基酸字母表，上下文依赖->氨基酸的共进化）

2) 为什么要开发蛋白质大语言模型？1. 相比于结构或功能信息，序列信息更加海量；2. 蛋白质序列通过进化而来，可以学习蛋白质基本规律，折叠，共进化等

3) 模型架构和基础理论：transformer，多头注意力机制，Bert，GPT，T5等

2. 基于Bert架构的蛋白质语言模型

1) ESM系列（ESM-1b、ESM-1v、ESM2、ESM C）

2) ESMFold：无需MSA信息的结构预测

3) 多模态的蛋白质语言模型ESM3

4) 使用抗体序列库训练的语言模型：Ablang，AntiBERTy

3. Adaptyv EGFR Binder比赛——设计靶向EGFR的更高亲和力binder。

1) 比赛结果展示

2) 比赛排名靠前的抗体/蛋白是如何设计的

a) 第一轮比赛，排名第一的方法：BindCraft

b) 第二轮比赛，排名第一的方法：Cradle，在Cetuximab的基础上，用的LLM，突变了10个FR的氨基酸

c) 第二轮比赛，排名第二的方法：对一个纳米抗体进行人源化改造

d) 第二轮比赛，排名第三的方法：保留与结合重要的氨基酸，生成其它氨基酸RFdiffusion+inverse folding

4. 零样本的抗体亲和力成熟*

1) Efficient evolution，基于序列的语言模型推荐突变点（Nat. Biotechnol.文章）

i.了解语言模型推荐突变点的原理；

ii. 安装package和模型参数。https://github.com/brianhie/efficient-evolution

iii. 运行以推荐突变点：python bin/recommend.py [sequence]

2) Structure evolution，基于结构的语言模型推荐突变点（Science文章）

i. 了解inverse folding推荐突变点原理

ii. 安装package和模型参数

1. git clone https://github.com/varun-shanker/structural-evolution.git

2. conda env create -f environment.yml

3. conda activate struct-evo

4. wget -P ~/.cache/torch/hub/checkpoints https://zenodo.org/records/12631662/files/esm_if1_20220410.zip

5. unzip ~/.cache/torch/hub/checkpoints/esm_if1_20220410.zip

iii. 运行以推荐突变点：python bin/recommend.py examples/7mmo_abc_fvar.pdb \

--chain A --seqpath examples/7mmo_chainA_lib.fasta \

--outpath examples/7mmo_chainA_scores.csv \

--upperbound 109 --offset 1

5. 小样本的抗体亲和力成熟*，在已有少量样本的亲和力数据下训练模型。

使用MULTI-evolve的方法预测多点的组合突变。

第三天

三、抗体可开发性预测和优化

1. 抗体可开发性优化在药物开发过程中的意义，

2. 衡量抗体可开发性要考虑的因素，如免疫原性、自聚集性、结合特异性、稳定性等等

3. 以一篇专利文件为例讲解AI辅助抗体改造的案例。Patent No.: US12110324B2。Generate:Biomedicines公司通过AI方法在tezepelumab上改成的一种靶向（TSLP）的长效单克隆抗体GB-0895。

4. 抗体结构简单物理性质的计算：溶剂可及表面积（SASA）的讲解及计算；等电点的计算；蛋白质表面电荷分布的计算。*

5. 讲解Ginkgo举办的抗体可开发性预测比赛的结果。

6. 公开的抗体可开发性数据的收集。

7. 抗体性质预测的模型实践，展示在小样本的情景下训练机器学习模型*

1) 数据处理，划分数据集

2) 模型构建，基于特征工程的机器学习模型（随机森林，XGboost，ElasticNet等）；学习根据蛋白质序列和结构信息构建常见特征。seq_features = feature_utils.get_all_seq_features(heavy_seq, light_seq, is_fv=True, isotype='igg1', lc_type='lambda')

3) 模型训练和评价，GridSearchCV交叉验证调参等

4) 模型的可解释性，特征重要性分析

第四天

四：抗体可开发性预测和优化2和抗体人源化

1. 基于蛋白质语言模型的可开发性预测*

1) 零样本的可开发性预测

2) 少样本的可开发性预测。给定抗体序列和相应的性质，构建下游模型预测。

a) 数据处理，划分数据集

b) 获得序列embedding以构建下游模型，实现蛋白质序列的不同方式encoding，包括"onehot", "georgiev", “esm”系列模型。

c) 深度学习模型的构建。上游的大语言模型+下游简单线性层。

d) 模型训练和评价：绘制训练曲线，训练集和测试集的评价指标随epoch的变化，

2. 免疫原性预测

1) 免疫系统介绍，MHC-I和MHC-II，Anti-drug Antibody等基础概念

2) 免疫原性预测是MHC结合肽段的预测

3) 预测免疫原性。netMHCpan的原理讲解，安装和使用

3. 抗体人源化

1) 人源化的基础知识和流程。目标：保留亲和力+减小免疫原性+好的稳定性和可开发性。CDR移植到人源框架，回复突变，Vernier Zone，

2) Germline的搜索，IMGT/V-QUEST 数据库搜索得到V 基因和J基因相似的人类germline序列。

3) 人源化的经典方法biophi的原理讲解、安装和使用。

4) 基于AI和基于物理能量（Rosetta）的方法是如何辅助抗体人源化的。

5) 排除抗体序列的PTM。

第五天

五、抗体（scFv, VHH）的从头设计

1. 从头设计的意义

1) 跨膜蛋白例如GPCR，难以稳定表达为可溶性蛋白

2) VHH动物免疫羊驼成本高。

3) 更高效快速获得候选分子

2. 基础模型方法概念介绍：Diffusion模型、 flow-matching、全原子（all-atom）建模等

3. 不同公司和方法模型、实验结果讲解

1) Rfdiffusion3+ProteinMPNN生成序列，AphaFold2筛选序列。将学会各个包的安装，不同参数的选择，结合的hotspot位点选择。

a) Rfdiffusion3结构设计，生成~10000个蛋白质主链结构；根据hotspot位点，生成新的结构：

./scripts/run_inference.py 'contigmap.contigs=[B1-100/0 100-100]' 'ppi.hotspot_res=[A30,A33,A34]' inference.output_prefix=test_outputs/binder_test inference.num_designs=10000

b) ProteinMPNN-FastRelax进行序列设计，每一个主链结构两个对应的序列，共设计~20000个序列；

c) 筛选:使用AlphaFold2预测设计结构，预测的置信度pAE<10，预测结构与设计结构的RMSD<1A，从中挑选95个进行实验验证。

2) Nabla Bio开发的JAM（Joint Atomic Modeling）系统

3) Chai2 Discovery开发的Chai-2方法，用以实现抗体的从头生成

4) MIT开发的Bolzgen方法原理、安装使用讲解。

安装和使用boltzgen讲解，将详细讲解yaml配置文件的写法，以一个靶点为例，从头生成VHH与该靶点结合。

5) PPIFlow：基于flow-matching的生成方法，原理，安装和使用方法。

4. VHH的生成实践

1) 确定纳米抗体序列框架（Framework区域）序列，生成CDR区域序列。分析整理纳米抗体序列，绘制序列保守性的Logo图，以此确定在生成VHH时，哪些位置的氨基酸需要固定。

2) 对生成的序列进行筛选。在亲和力、序列稳定性、可开发性等各个方面进行筛选。

a) 预测结构与设计结构的RMSD，AlphaFold预测设计结构的置信度pAE等

b) 筛选Cys，Met等氨基酸含量

c) 减少电荷patch

d) 根据等电点等性质筛选。

合成生物学与基因线路设计

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一、：合成生物学导论与入门

主题：从DNA组装到生命系统设计

一、合成生物学定义与发展简史（1小时）

定义与核心概念

合成生物学是通过工程化方法设计和构建生物系统，以解决实际问题的跨学科领域，融合生物学、工程学和信息学。

核心目标：改写生命遗传指令，实现定制化功能（如生产药物、能源）。

发展简史

起源：20世纪中叶，DNA双螺旋结构发现和蛋白质合成技术奠定基础。

里程碑：

2000年：基因网络开关设计（Collins团队）。

2002年：人工合成脊髓灰质炎病毒（Wimmer团队）。

2010年：首个人工合成基因组细胞（Venter团队）。

2014年：非天然碱基配对整合（Romesburg团队）。

现状：21世纪后快速发展，聚焦基因组设计、细胞工程和产业应用。

二、常用软件工具与网站介绍

基因设计工具

DNAWorks：免费在线软件，用于设计寡核苷酸链（适用小片段合成）。

商业软件：如Snapgene，GenBank（序列数据库）、EMBL（欧洲生物信息学资源），支持基因组全序列下载和分析。

功能：序列优化、引物设计、模拟基因表达。

代谢通路建模工具

KEGG（京都基因与基因组百科全书）：可视化代谢通路，辅助设计合成生物学模块。

实践平台

iGEM（国际基因工程机器大赛）官网：提供标准化生物元件库和社区资源。

NCBI（美国国家生物技术信息中心）：综合数据库，支持基因序列检索和功能注释。

三、代谢数据库与知识库

核心数据库

代谢组学数据库：如HMDB（人类代谢组数据库），整合代谢物结构和功能信息。

基因组数据库：GenBank、EMBL、DDBJ（日本DNA数据库），存储全基因组序列。

功能：通过序列比对和通路映射，预测基因功能和代谢网络。

知识库应用

设计阶段：利用数据库筛选标准化生物元件（如启动子、终止子），确保设计可行性。

测试阶段：比对实验数据与数据库，验证代谢通路效率（如酶活性分析）。

四、互动实践：常用软件使用

实践目标

掌握DNA序列设计、组装模拟。

步骤与工具

DNA设计：使用Snapgene输入目标序列，生成寡核苷酸链并模拟组装。

数据分析：通过NCBI BLAST比对序列相似性，评估设计准确性。

第二天

二、基因编辑与工具技术

eCRISPR技术、基因合成、生物元件设计（启动子/终止子）

一、基因编辑技术基础概念

基因编辑定义与核心原理

定义：通过人工干预修改生物体基因组，实现特定性状改变。

核心原理：

DNA断裂与修复：双链断裂（DSB）触发细胞修复机制（NHEJ或HDR）。

碱基编辑：直接修改单个碱基，无需断裂DNA。

基因编辑工具发展历程

第一代：ZFN（锌指核酸酶，2000年代初，靶向性差）。

第二代：TALEN（转录激活因子样效应核酸酶，2010年代，灵活性提升）。

第三代：CRISPR-Cas9（2012年诺贝尔奖，高效、低成本、可编程）。

二、CRISPR-Cas9系统详解

CRISPR系统组成与工作机制

核心组件：

Cas9蛋白：切割DNA的“剪刀”。

sgRNA（单导RNA）：引导Cas9到目标位点（含20nt互补序列）。

PAM（原间隔序列）：Cas9识别的短序列（如NGG）。

工作机制：

sgRNA与Cas9结合，形成复合物。

复合物识别PAM，切割DNA双链。

细胞通过NHEJ或HDR修复断裂。

CRISPR系统操作流程

步骤：

设计sgRNA：选择目标基因的PAM序列，设计20nt互补RNA。

构建载体：将sgRNA和Cas9基因插入质粒（如pCRISPR1）。

转化宿主：将载体导入细胞（如HEK293T细胞）。

筛选与验证：通过PCR、测序确认编辑效率。

CRISPR技术优化方向

提高特异性：使用高保真Cas9变体（如HF-Cas9）。

降低脱靶率：优化sgRNA浓度，避免非特异性切割。

扩展应用场景：开发CRISPR-Cas12（靶向单链DNA）和CRISPR-Cas13（靶向RNA）。

CRISPR实验注意事项

实验设计：设置阴性对照（如非靶向sgRNA）。

数据分析：使用NGS（下一代测序）评估编辑效率。

三、基因编辑实验设计实践

实验方案设计要点

明确目标：编辑单个基因（如敲除）或多基因（如代谢通路优化）。

选择宿主：根据基因功能选择模式生物（如大肠杆菌、酵母、人类细胞）。

优化条件：调整sgRNA浓度、Cas9表达量、转化方法（如电穿孔）。

不同微生物宿主SgRNA设计原则

原核生物（如大肠杆菌）：

优先选择PAM序列（如NGG），避免CRISPR-Cas系统的天然防御机制。

真核生物：

避免设计在基因组重复区域或调控序列中的sgRNA。

筛选方法与验证

筛选：通过抗生素抗性或荧光标记（如GFP）筛选成功转化细胞。

验证：PCR扩增：设计引物跨越编辑位点，检测片段大小。

测序：对PCR产物进行Sanger测序，比对参考序列。

功能检测：如编辑后基因表达量（qPCR）、表型变化（如细胞生长速度）。

单基因编辑设计与多基因编辑设计

单基因编辑：

步骤：设计sgRNA→构建载体→转化细胞→筛选→验证。

多基因编辑：

示例：在酵母中同时编辑3个代谢基因（如ADH1、PGK1、GAPDH）。

第三天

三、基因线路工程与动态调控

主题：细胞内的“逻辑电路

基因电路设计原理

‌一、基因线路概述

1. ‌定义与功能‌

o‌基因线路‌：生物体内基因表达的调控网络，通过逻辑门（与门、或门、非门）实现特定功能（如代谢调控、信号响应）。

o‌核心功能‌：

§‌开关控制‌：基因表达的“开/关”（如乳糖操纵子）。

§‌信号处理‌：环境信号（如光、温度）的响应与转导。

§‌稳态维持‌：通过负反馈调节基因表达水平。

2. ‌应用领域‌

o‌生物制造‌：优化代谢通路。

o‌疾病治疗‌：基因疗法。

o‌环境监测‌：工程菌检测污染物。

3. ‌案例对比‌

o‌原核案例‌：大肠杆菌乳糖操纵子（LacI蛋白抑制转录，乳糖诱导表达）。

o‌真核案例‌：人类β-珠蛋白基因增强子（远端调控序列激活转录）。

‌二、基因线路设计原则‌

1. ‌模块化设计‌

o‌原则‌：将复杂功能拆解为独立模块（如启动子、转录因子、报告基因）。

o‌示例‌：设计“光控开关”线路，分离光敏蛋白与报告基因（如GFP）。

2. ‌稳定性与可预测性‌

o‌正交设计‌：减少模块间干扰（如避免共用转录因子）。

o‌鲁棒性‌：通过冗余设计（如双启动子）确保功能稳定。

3. ‌实验验证方法‌

o‌荧光报告基因‌：定量表达水平（如GFP荧光强度）。

o‌qPCR‌：检测转录效率（如mRNA量）。

‌三、实践操作：基因线路构建

1. ‌工具介绍‌

o‌CRISPR-Cas9‌：精准编辑基因（如敲除抑制子）。

o‌质粒载体‌：携带基因线路元件（如pCRISPRi）。

o‌电转化技术‌：将载体导入细胞（如大肠杆菌）。

2. ‌设计“光控开关”基因线路‌

o‌步骤‌：

1. ‌设计光敏蛋白‌：选择光敏离子通道（如ChR2）或光敏转录因子（如PhyB）。

2. ‌构建载体‌：将光敏蛋白基因与报告基因（如GFP）插入质粒。

3. ‌转化宿主‌：将载体导入大肠杆菌，筛选阳性克隆。

4. ‌验证功能‌：光照后检测GFP荧光（定性）或qPCR（定量）。

3. ‌实验

o‌阴性对照‌：使用非光敏蛋白（如GFP空载质粒）。

o‌优化条件‌：调整光强、曝光时间。

‌四、动态调控原理

1. ‌负反馈与正反馈‌

o‌负反馈‌：转录因子抑制自身表达（如乳糖操纵子中的LacI蛋白）。

o‌正反馈‌：转录因子激活自身表达（如噬菌体λ的CI蛋白）。

2. ‌时间延迟效应‌

o‌原因‌：基因表达与调控的滞后（如转录、翻译过程）。

o‌影响‌：导致系统振荡或稳态偏离。

3. ‌案例：大肠杆菌动态调控高产莽草酸‌

o‌背景‌：莽草酸是合成抗病毒药物的原料。

o‌调控机制‌：

§‌负反馈‌：莽草酸合成酶（如AroB）抑制自身表达。

§‌优化策略‌：通过CRISPR敲除抑制子（如AroB的负调控蛋白），提高产量。

‌五、系统集成与案例分析（

复杂线路设计策略‌

o‌振荡器‌：结合负反馈与时间延迟（如基因表达振荡）。

o‌开关‌：利用逻辑门（如与门）控制多基因表达。

o‌脉冲发生器‌：通过瞬时信号触发基因表达（如热激响应）。

1. ‌案例分析：合成生物学中的动态调控‌

第四天

四、代谢工程与生物制造

主题：微生物细胞工厂的理性设计与代谢通路设计与重构

‌‌一、细胞工厂与理性设计范式‌

1. ‌细胞工厂定义‌

o利用工程化微生物（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母）作为“生物反应器”，通过重构代谢网络生产高值化学品（如1,3-丙二醇、氨基酸、生物燃料）。

2. ‌范式转型‌

o‌传统模式‌：随机诱变+高通量筛选（低效、不可预测）。

o‌理性设计‌：基于基因组尺度模型 + 代谢通量分析 + AI预测（精准、可复现）。

3. ‌发展历程‌

o天然发酵（酿酒酵母产乙醇）→ 代谢工程（大肠杆菌产乳酸）→ ‌AI驱动设计‌（AlphaFold辅助酶结构预测，优化限速步骤）。

4. ‌核心挑战‌

o‌鲁棒性‌：抗渗透压、高温、产物毒性（如1,3-丙二醇抑制生长）。

o‌效率‌：产物得率，需突破热力学极限。

o‌原料多样性‌：利用农业废弃物（如秸秆水解液）替代葡萄糖，降低碳源成本。

‌二、物质流-能量流-信息流协同设计

1. ‌热力学驱动：ATP/NADH平衡‌

o产物合成需消耗还原力（如NADPH用于脂肪酸合成）或产生还原力（如1,3-丙二醇生成消耗NADH）。

o‌策略‌：引入NADH再生系统（如甲酸脱氢酶）或切换碳源（甘油 vs 葡萄糖）调控辅因子比例。

2. ‌动力学驱动：酶活性调控‌

o限速酶（如AroE、DhaT）表达量不足导致通量瓶颈。

o‌优化方法‌：使用NCS文库（N端编码序列）精细调控翻译效率，提升酶活性3–8倍。

3. ‌代谢网络重构：通量平衡分析（FBA）‌

o‌原理‌：基于质量守恒与反应约束，求解最大生物量或产物产量的代谢流分布。

4. ‌‌案例：碳-氮比调控谷氨酸棒杆菌产谷氨酸‌

o高碳氮比（>20:1）激活谷氨酸脱氢酶，抑制TCA循环，使α-酮戊二酸积累并转化为谷氨酸。

三、底盘细胞开发策略‌

1. ‌设计原则‌

o‌鲁棒性底盘‌：引入热休克蛋白（如GroEL/ES）增强耐热性，提升高温发酵稳定性。

o‌稳定性底盘‌：基因组简化（删除非必需基因如 prophage、转座子），减少代谢负担与基因组不稳定性。

2. ‌技术方法‌

o‌智能抗逆元件‌：构建温度响应型启动子，在37°C以上激活抗逆基因表达。

o‌无诱导表达系统‌：利用组成型强启动子替代IPTG诱导，降低生产成本。

3. ‌案例：枯草芽孢杆菌底盘改造‌

o‌目标产物‌：N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）

o‌改造策略‌：

§引入唾液酸合成途径（neuA, neuB, neuC）

§构建NCS文库优化关键酶表达（GFP荧光强度提升8.47倍）

§删除竞争途径（如glcA）减少副产物

‌

第五天

五、 合成生物学中高通量筛选技术

‌

‌1、主题‌：传统高通量筛选技术

一、传统高通量筛选技术体系‌

1. ‌三大技术支柱‌

o‌机器人自动化系统‌：通过协作机器人（如Explorer G3）实现96/384孔板的自动加样、温孵与转移，日处理通量可达10⁵–10⁶样品。

o‌液体处理器‌：精准控制纳升–微升级液体分配（误差<2%），支持混合、稀释、分液一体化，消除人为操作偏差。

o‌检测系统‌：

§‌荧光检测‌：报告基因（GFP、LacZ）用于基因表达水平量化；

§‌细胞增殖检测‌：MTT/Resazurin法评估细胞代谢活性；

§‌离子通道筛选‌：膜片钳自动化平台检测神经靶点化合物活性。

2. ‌数据处理流程‌

o‌原始数据‌：荧光强度、吸光度、成像特征

o‌标准化‌：Z’因子评估（Z’>0.5为合格）

o‌分析工具‌：GraphPad Prism、Python（pandas + scikit-learn）进行剂量响应曲线拟合与Hit筛选。

3. ‌案例‌

o‌报告基因筛选‌：构建“GFP-乳糖操纵子”大肠杆菌库，用荧光酶标仪筛选强启动子变体。

‌二、微流控与液滴微流控技术‌

1. ‌技术原理‌

o‌微流控芯片‌：通过光刻/软光刻技术在PDMS芯片中构建微通道网络，集成样品制备、反应、分选、检测单元（尺寸<2 cm²）。

o‌液滴微流控‌：利用油水两相流生成‌皮升级（pL）单分散液滴‌，作为独立微反应器，实现：

§单细胞包裹与恒化培养

§酶基因表达产物的高通量筛选

§细胞裂解与代谢物捕获

2. ‌通量优势‌

o传统：10³–10⁴样品/天

o液滴系统：‌10⁵–10⁶液滴/小时‌（DropAI系统实测）

3. ‌实验设计‌

o‌非标记荧光分选‌：利用微生物自发荧光（NADH/FAD）检测生长速率，分选“高产”菌株。

o‌荧光编码系统‌：FluoreCode技术，通过不同荧光强度组合编码液滴组分，实现百万级组合并行筛选。

三、拉曼光谱在代谢物高通量筛选中的应用‌

1. ‌原理与优势‌

o‌拉曼散射‌：激光激发分子振动模式，产生特征“指纹光谱”，无需标记即可检测：

§脂肪酸（C-H伸缩峰：2850 cm⁻¹）

§聚羟基脂肪酸酯（PHAs，1240 cm⁻¹）

§蛋白质二级结构（Amide I, 1650 cm⁻¹）

o‌无损、快速、单细胞级‌：单细胞光谱采集<1秒，适用于活细胞动态监测。

2. ‌操作流程‌

o‌样品准备‌：细胞悬液滴于硅基片或微流控出口

o‌光谱采集‌：使用532 nm或785 nm激光，积分时间1–10 s

o‌数据分析‌：

§主成分分析（PCA）区分细胞表型

§支持向量机（SVM）分类高产/低产菌株

3. ‌应用‌

o‌油脂生产菌筛选‌：对产油酵母（如Yarrowia lipolytica）进行拉曼成像，识别高脂含量单细胞。

o‌液滴-拉曼联用‌：SERS增强基底嵌入微流控芯片，实现“生成-检测-分选”一体化。

4. ‌技术瓶颈‌

o信号弱（需SERS增强）

o数据维度高（>1000波数点/光谱），需AI降维分析

四、AI驱动的高通量筛选闭环

1. ‌DBTL循环升级‌

o‌Design‌：AI预测酶结构（AlphaFold）→ 优化催化位点

o‌Build‌：自动化合成基因库（CRISPR-Cas9 + Golden Gate）

o‌Test‌：液滴微流控 + 拉曼/荧光检测 → 生成百万级表型数据

o‌Learn‌：机器学习模型（XGBoost、神经网络）训练预测模型，反向优化设计

2. ‌工业级平台案例‌

o‌SynGears™平台‌：AI驱动的“数字基座”，整合基因设计、通路模拟与筛选数据，实现“设计即优化”。

AI基因编辑课表内容

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第一天

1. 基因组编辑技术简述

1.1 基因组测序、编辑和读写时代及基因组编辑技术现状简述

2. 基因组编辑四代技术原理

2.1 四代基因组编辑技术发展历程

2.2 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas系统的组成和工作原理

3. CRISPR/Cas系统的来源及分类

3.1 CRISPR/Cas系统的发现过程

3.2 CRISPR/Cas系统的适应性免疫原理

3.3 CRISPR/Cas系统的分类依据和类型

4. CRISPR/Cas系统介导的DNA编辑工具

4.1 CRISPR/Cas9基因编辑工具

4.2 CRISPR/Cas12a基因编辑工具

5. CRISPR/Cas系统衍生工具的发展

5.1 碱基编辑工具的组成、作用原理及其应用

5.2 引导编辑的作用机理、应用及其发展动态

6. CRISPR/Cas介导的基因调控、细胞成像和核酸检测技术

6.1 CRISPR/Cas介导基因调控技术的原理和工具组成

6.2 CRISPR/Cas介导细胞成像技术的原理和工具组成

6.3 CRISPR/Cas介导核酸检测技术的原理和工具组成

第二天

1. 脱靶效应及其检测

1.1 脱靶效应的检测方法：扩增子测序、全基因组测序、GUIDE-seq等

1.2 脱靶效应的规避方法

2. 基因编辑流程-以植物为例

2.1 靶位点sgRNA或crRNA的设计原则

2.2 表达盒设计和构建的方法

2.3 植物原生质体瞬时表达系统

2.4 基因编辑载体的遗传转化

2.5 基因编辑突变体的检测

3. 基因组编辑常用软件实操

3.1 靶位点设计软件Cas-Designer、BE-Designer、PE-Designer等

3.2 突变分析软件Cas- Analyzer、BE-Analyzer、PE- Analyzer

4. 基因组编辑技术在各领域的应用现状及前景

4.1 基因组编辑技术在基因治疗、免疫学、病毒诊断等方面的应用

第三天理论部分（人工智能+基因编辑背景）

1.深度学习概述

1.1. 深度学习的基础

1.2. 深度神经元网络的工作原理

1.3. 深度学习技术的发展趋势：自监督学习、迁移学习和少样本学习的进展

2.深度学习在基因编辑中的应用

2.1. 基于监督学习的应用：序列标签模型

2.2. 零样本预测模型的应用：结构模型、大语言模型、多模态模型、

2.3. 少样本预测框架的应用（Design-Build-Test-Learn和Lab-in-the-loop范式）

3.深度学习在gRNA优化与设计中的应用

3.1. gRNA活性预测

3.2. 脱靶效应预测

3.3. gRNA预测模型介绍

4. AI辅助的蛋白定向进化在基因编辑中的应用

4.1. 蛋白定向进化的基本概念与实验方法

4.2 AI辅助的蛋白进化工具

4.3. AI与实验反馈的结合

5. AI蛋白质设计在基因编辑中的应用

5.1. 蛋白质设计工具

5.2. 酶设计

5.3. binder设计

6.AI酶挖掘在基因编辑中的应用

6.1. 基于大语言模型挖掘基因编辑酶

6.2. 基于结构比对挖掘基因编辑酶

第四天深度学习在基因编辑中的应用实操教学

1. 基础知识和环境搭建

1.1. GPU服务器登录

1.2. Linux基础知识

1.3. Python基础知识

1.4. 常用深度学习工具包介绍及安装

2.利用深度学习预测gRNA活性

2.1. 配置深度学习环境，安装gRNA活性预测所需的工具

2.2. 高通量数据获取：公开数据集的介绍与使用

2.3. 数据集划分：训练集、验证集、测试集

2.4. 模型搭建与调试：深度学习模型架构设计（如CNN, RNN）

2.5. 模型性能评估：精度、召回率、F1分数等评估指标

2.6. gRNA活性预测：实际应用案例演示和预测结果的解读与应用

3.利用深度学习预测编辑活性

3.1. 环境配置：安装所需工具与库

3.2. 数据获取：编辑活性相关数据集清洗

3.3. 数据集划分

3.4. 模型搭建与调试

3.5. 模型性能评估

3.6. 编辑活性预测：预测结果的展示与解读

4.零样本蛋白进化工具AiCE实操

4.1. AiCE的原理与应用场景

4.2. 环境搭建

4.3. 逆折叠模型的使用：如何利用AiCE进行高活性突变预测；案例演示与实际操作

4.4. 应用实例：碱基编辑器的高效进化

5.少样本蛋白质定向进化工具EVOLVEpro实操

5.1. EVOLVEpro的背景与应用

5.2. 环境搭建与配置

5.3. 基于DMS数据的少样本微调

5.4. 基于实验数据反馈的少样本微调

5.5. 应用实例：Cas12f的高效进化

第五天基因编辑工具设计与挖掘案例复现

1. 设计MLH1 binder提高引导编辑编辑(PE)效率

1.1. 背景知识：基于RFdiffusion + ProteinMPNN + AlphaFold的binder设计流程

1.2. 环境搭建与配置

1.3. 输入结构准备(AlphaFold预测)

1.4. 结构骨架生成：利用RFdiffusion进行结构采样与优化，生成蛋白质结构骨架

1.5. 序列设计：基于RFdiffusion生成的结构骨架，进行序列的优化设计

1.6.复合体结构预测验证：使用AlphaFold进行binder与目标蛋白复合体的结构预测，验证设计的复合体结构是否符合预期

1.7. 结果可视化：使用PyMOL进行结构和设计结果的可视化

2. Cas13抑制剂设计

2.1. 背景知识：Cas13的结构与功能介绍

2.2. 输入结构准备

2.3. 蛋白质设计流程：结合RFdiffusion、ProteinMPNN与AlphaFold设计Cas13抑制剂

2.4. 设计结果分析和可视化

3.基于蛋白质语言模型挖掘新型CRISPR系统

3.1. 蛋白质语言模型在酶挖掘中的介绍与流程

3.2. 序列数据库介绍与下载

3.3. 搜索(query)序列准备

3.4. 基于ESM语言模型挖掘Cas12家族基因编辑酶

4.基于三维结构挖掘新型CRISPR系统

4.1. 结构比对的背景知识：结构比对的重要性与应用；比较不同结构比对工具的优缺点

4.2. Foldseek系列工具介绍：介绍Foldseek、Foldseek multimer、Folddisco、FoldMason等工具的基本原理和使用

4.3. 结构数据库介绍与下载：PDB，AFDB，ESM Atlas

4.4. 输入结构准备：准备用于比对的目标蛋白质结构文件

4.5. Foldseek网页版使用：演示如何使用Foldseek网页版进行结构比对；讲解如何理解输出结果并进行后续分析

4.6. Foldseek本地版使用：本地部署Foldseek并使用命令行工具进行比对

4.7. DALI和TM-align工具本地版使用：介绍DALI与TM-align工具本地版的安装与使用

4.8. 结构进化树构建：使用FoldMason构建蛋白质结构的进化树

讲师介绍

AI蛋白质设计与AI抗体设计

主讲老师在学术界和工业界都有丰富算法开发和应用经验，博士毕业于国内顶尖课题组，从事蛋白质结构预测和蛋白质设计的研究工作，相关工作成果已在Cell Systems、Angew. Chem. Int. Ed.、JCIM等国际知名期刊发表论文。目前在知名药企担任高级研究员，主导AI驱动的大分子药物设计平台开发与团队管理。

AI多肽设计与AI抗菌肽设计

主讲老师在学术界和工业界都有丰富算法开发和应用经验，毕业于南开大学院士课题组，从事AI多肽设计、抗菌肽设计以及蛋白质设计的研究工作，相关工作成果已在New England、Plos one等国际知名期刊发表

AI基因编辑

主讲老师在学术界具有多年的研究经历和应用经验，来自于国内顶尖课题组，从事基因组编辑技术与人工智能交叉融合的研究工作，相关工作成果已在Nature Biotechnology、Nature Plants、Trends in Biotechnology等国际知名期刊发表

合成生物学与基因线路设计

主讲老师博士毕业于某合成生物学专业顶尖双一流高校，主要从事合成生物学工具开发，基因电路设计与动态调控，高附加值天然产物化学品合成路径挖掘与高水平合成，精通大肠杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母，解脂酵母等微生物细胞工厂的基因编辑和构建，具备完整的从上游菌株改造到下游放大生产的产业化经验，已经实现多个产品的产业化落地，在Metabolic Engineering，Bioresour Technol，Appl Microbiol Biotechnol，J Agric Food Chem，ACS Synthetic Biology等杂志共发表SCI文章16篇，申请发明专利8项

授课时间

01.AI多肽设计

2026.7.4-2026.7.5(09:00-11:30--13:30-17:00)

2026.7.7-2026.7.8(19:00-22:00)

2026.7.11-2026.7.12(09:00-11:30--13:30-17:00)

02.AI蛋白质设计

2026.6.6-2026.6.7(09:00-11:30--13:30-17:00)

2026.6.10-2026.6.11(19:00-22:00)

2026.6.13-2026.6.14(09:00-11:30--13:30-17:00)

2026.6.16-2026.6.17(19:00-22:00）

03.AI抗菌肽设计

2026.7.18-2026.7.19(09:00-11:30--13:30-17:00)

2026.7.21-2026.7.22(19:00-22:00)

2026.7.25-2026.7.26(09:00-11:30--13:30-17:00)

04.AI抗体设计

2026.6.23-2026.6.26(19:00-22:00)

2026.6.27-2026.6.28(09:00-11:30--13:30-17:00)

2026.6.29-2026.6.30(19:00-22:00)

05.合成生物学与基因线路设计

2026.6.13-2026.6.14(09:00-11:30--13:30-17:00)

2026.6.25-2026.6.26(19:00-22:00)

2026.6.27-2026.6.28(09:00-11:30--13:30-17:00）

06.AI基因编辑

2026.6.13-2026.6.14(09:00-11:30--13:30-17:00)

2026.6.25-2026.6.26(19:00-22:00)

2026.6.27-2026.6.28(09:00-11:30--13:30-17:00）

腾讯会议直播上课课后提供直播回放

培训费用

课程报名费用：

AI多肽设计、AI抗菌肽设计、AI蛋白质设计、AI基因编辑、AI抗体设计：

公费价：每人每班￥6880元（含报名费、培训费、资料费）

自费价：每人每班￥6580元（含报名费、培训费、资料费）

合成生物学与基因线路设计：

公费价：每人每班￥5880元（含报名费、培训费、资料费）

自费价：每人每班￥5480元（含报名费、培训费、资料费）

重磅优惠:

优惠1：

报二送一（同时报名两个班免费赠送一个学习名额赠送班任选）

两班同报：10880元（可学习三个直播课）

三班同报：14880元（可学习四个直播课）

四班同报：18880元（可学习六个直播课）

特惠2：24880元（可免费学习两整年本单位举办的任意课程）

优惠3：提前报名缴费可享受300元优惠（仅限十五名）

特惠福利：报一送二、报三个送全部回放（额外送的回放）（包含全套课程回放和课件资料ppt）

（可点击跳转详情链接）：

回放一：本课程为视频课！机器学习生物医学培训！

回放二：本课程为视频课！单细胞空间转录组培训！

回放三：本课程为视频课！比较基因组学培训！

回放四：本课程为视频课！机器学习蛋白质组学培训

回放五: 本课程为视频课！CRISPR-Cas9基因编辑培训！

回放六：本课程为视频课！蛋白质晶体结构解析培训！

回放七：本课程为视频课！深度学习基因组学培训！

回放八：本课程为视频课！机器学习微生物多组学联合分析！

培训特色及福利

1、课程特色--全面的课程技术应用、原理流程、实例联系全贯穿

2、学习模式--理论知识与上机操作相结合，让零基础学员快速熟练掌握

3、课程服务答疑--主讲老师将为您实际工作中遇到的问题提供专业解答

授课方式：通过腾讯会议线上直播，理论+实操的授课模式，老师手把手带着操作，从零基础开始讲解，电子PPT和教程开课前一周提前发送给学员，所有培训使用软件都会发送给学员，有什么疑问采取开麦共享屏幕和微信群解疑，学员和老师交流、学员与学员交流，培训完毕后老师长期解疑，培训群不解散，往期培训学员对于培训质量和授课方式一致评价极高!

学员对于培训给予高度评价

腾讯会议实时直播解答|手把手带着操作

报名咨询方式（请二维码扫描下方微信）

微信：Z13283822597

电子邮箱：z13283822597@163.com

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