aBIOTECH | AI赋能TnpB进化:基于生成模型+能量优化,打造高活性“迷你基因剪刀”

TnpB是一种由转座子编码、约400个氨基酸的超紧凑型蛋白，被视作CRISPR系统的进化祖先。作为一种可编程的RNA引导核酸酶，其极小的体积使其成为开发下一代基因编辑工具的有力候选者。然而，目前已发现的TnpB蛋白种类有限，且其编辑效率普遍低于传统的CRISPR-Cas系统。为提升其切割活性，研究采用包括截短蛋白或ωRNA、密码子优化、引入核定位信号及重构连接域等多种策略。尽管这些方法有效增强了TnpB编辑系统的性能，但仍需要开发直接针对TnpB核酸酶分子的智能设计策略，从根本上提升其基因编辑活性。

近日，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所姚斌院士团队在aBIOTECH发表了题为“Engineering high-efficiency mutants of the transposase ISDra2 TnpB via protein-generative models and energy-optimized design”的研究论文。在该研究中，作者开发了提升TnpB编辑活性的策略TnpB-GMRE，该策略整合了TnpB生成模型和高通量虚拟筛选方法，最终获得了综合性能优良的ISDra2 TnpB的五点突变体TnpB-TD。

作者首先开发了基于团队开发的蛋白质大语言模型MP-TRANS的生成模型（图1A-B）。利用该生成模型直接生成了10万条ISDra2 TnpB的多点突变体序列，基于最小恢复率选择了前1000条且空间分布较广的序列进行后续分析（图1C）。对这些序列的突变位点进行分析发现，每段序列的突变数主要分布在10-14之间（图1D）；同时，绝大多数突变集中于TnpB蛋白的识别结构域（REC）、切割结构域（RuvC）及楔形结构域（WED）中（图1E-F）。最终，作者利用FoldX and EvoEF2计算了这1000条序列的能量值，选择能量最优的前5条序列进行验证。

图1. TnpB蛋白生成模型的性能评估与多点突变体筛选

作者将以上五个TnpB突变体的编码序列按照人源细胞密码子优化后，构建相应质粒并分别转染至HEK293T细胞，选择AGBL、ROSA26、EMX1、AAVS这四个基因，共八个不同靶点进行体内实验验证。结果显示，野生型ISDra2 TnpB及突变体TnpB-TA、TnpB-TC、TnpB-TD在AGBL-1、AGBL-2、ROSA26-1、ROSA26-3和AAVS-2位点均表现出较高的编辑效率。尤其是在AGBL-1、AGBL-2、ROSA26-1和ROSA26-3位点，TnpB-TD突变体的编辑效率分别是野生型ISDra2 TnpB的1.2、1.2、1.46和1.5倍（图2A）。同时，野生型ISDra2 TnpB与TnpB-TD突变体在这些靶点均保持了较低的脱靶率（图2B）。

随后，通过对野生型ISDra2 TnpB与TnpB-TD的编辑效率高于0.1%的编辑事件进行分析发现，同一个核酸酶在不同靶点的编辑类型不同；野生型ISDra2 TnpB与TnpB-TD在同一靶点的编辑类型也不同。总体而言，TnpB-TD突变体较野生型产生更多样化的编辑结果，且在所有四个靶点均展现出更强的长片段（>10 bp）编辑能力（图2C）。

图2. TnpB突变体的编辑活性及编辑类型分析

为探究TnpB-TD突变体编辑活性增强的分子机制，作者进行了500 ns的分子动力学模拟分析。RMSD轨迹表明TnpB-TD整体稳定性有所提高。RMSF分析结果显示，与野生型相比，TnpB-TD突变体中REC、WED和RuvC结构域的某些区域波动性显著降低，进一步支持该突变体具有更高的结构稳定性（图3A）。对Cα原子轨迹的降维分析表明，TnpB-TD突变体所处的构象空间比野生型ISDra2 TnpB更为集中；自由能景观分析进一步显示，TnpB-TD突变体的能量盆地范围更广，与其增强的结构稳定性及更丰富的稳定构象态分布相一致（图3B）。

此外，通过结构比对分析，我们观察到TnpB-TD中的残基Q147和Q148向与核酸相互作用通道方向延伸。而在野生型TnpB中，Q147向外伸展，Q148则埋藏在蛋白内部（图3C）。此外，库仑势分析表明，TnpB-TD中Q147和Q148位点表现出比野生型更强的正静电势，其侧链平均静电势分别为5.856 kcal/(mol·e)和7.036 kcal/(mol·e)，显著高于野生型对应位点的数值（3.30 kcal/(mol·e)和1.58 kcal/(mol·e)）。这些残基位于预测的ωRNA界面附近，提示静电作用可能增强了其结合稳定性。

图3. TnpB-TD突变体编辑活性增强的分子机制解析

该研究得到了科技部重点研发计划项目和国家自然科学基金等项目的资助。中国农业科学院生物技术研究所关菲菲、丁烨坤和北京畜牧兽医研究所许国顺为本文共同第一作者，北京畜牧兽医研究所田健为通讯作者。

引用本文：

Guan F, Ding Y, Xu G, Fan L, Gu X, Wang Y, et al. Engineering high-efficiency mutants of the transposase ISDra2 TnpB via protein-generative models and energy-optimized design. aBIOTECH 2026:100027.

https://doi.org/10.1016/j.abiote.2026.100027

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IF 5.1（2025年6月发布）

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