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试题的特点和背景：本题依托农业微生物基因编辑真实科研情境，以根际促生恶臭假单胞菌UW4的人工改造为核心载体，融合PCR技术、限制酶切割、自杀质粒载体构建、两步同源重组、正负双向筛选等核心基因工程知识点，是一道贴合现代生物育种技术、兼具基础性与应用性的高考压轴类实验题。
UW4是恶臭假单胞菌，属于根际促生菌（PGPR），是农业微生物领域的经典工程菌材料。其功能是合成ACC脱氨酶，分解植物根系分泌的ACC（乙烯前体物质），降低植物体内乙烯浓度，解除乙烯对根系伸长的抑制，显著促进作物生根、提升抗盐、抗旱等抗逆能力，是生物菌肥的重要候选菌株。
但也存在缺陷：UW4能感知ACC并向植物根部定向游动（趋化），但根部吸附、长期定殖的效率偏低，菌在根际留存时间短，田间促生效果不稳定。
改造目标：在ACC趋化受体ACCR蛋白的羧基端（C端）融合一段五肽标签。该五肽可以增强细菌在根表的黏附能力，提升定殖效率，让工程菌更长时间驻留在根际，稳定发挥降乙烯、促生长的作用。
试题配套三幅图示层层递进，完整呈现“目的片段制备→重组质粒构建→同源重组编辑→菌株筛选鉴定”的全实验流程，本文将结合科研背景，逐图拆解实验逻辑、逐问解析考点与答案。
试题：（2026年6月云南高考题）UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体(ACCR)的羧基端。回答下列问题：
第一步：构建pEX质粒(图a)，复制原点(ori)不能在UW4菌株中启动复制(质粒不复制策略)。
（1）PCR每次循环一般可以分为变性、复性和三步。
答案：延伸
解析：PCR一个循环包含三步：①变性：90~95℃，双链DNA解旋为单链；②复性（退火）：55~60℃，引物与单链模板互补结合；③延伸：70~75℃，TaqDNA聚合酶从引物末端合成新DNA链。
（2）构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是(答出2点)。
图a解读：目的片段拼接与重组质粒构建流程
图a为实验上游核心操作，完成目的基因片段无缝拼接与重组自杀质粒构建，是后续基因编辑的基础，核心逻辑为“重叠PCR拼接+双酶切定向连接”。
（1）片段制备：以UW4菌株ACCR基因序列为模板，分别扩增出基因前端同源臂、后端同源臂；通过引物设计在前端片段末端添加五肽编码序列，利用重叠延伸PCR技术，无缝拼接形成“前端同源臂－五肽序列－后端同源臂”的完整目的片段，保证五肽可与ACCR基因同框翻译，不发生移码突变（增加或减少非3的整数倍个碱基对，造成突变位点之后所有密码子阅读框架全部发生改变，这种突变叫作移码突变）。
（2）酶切与连接：对拼接完成的目的片段与pEX空载质粒，同时采用KpnⅠ、EcoRⅠ两种限制酶进行双酶切，产生两种不同的黏性末端；通过DNA连接酶完成定向连接，最终构建出含目的片段、抗性基因、蔗糖致死基因的重组自杀质粒。
重组自杀质粒（非复制型质粒）：复制原点ori在目标宿主UW4中完全不能启动复制，游离质粒无法自主复制，会随细胞分裂不断丢失；只有发生同源重组、把质粒整合到细菌拟核DNA上，抗性基因才能跟着基因组稳定遗传。质粒游离时必死，只有整合才能存活，所以叫 “自杀质粒”。
（3）双酶切核心作用：彻底避免质粒自身环化、目的片段自身环化，同时锁定目的片段正向插入方向，保证五肽序列精准连接在ACCR蛋白羧基端，保障基因编辑的准确性。
第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2(图b)。
图b解读：两步同源重组基因编辑流程（单交换→双交换）
图b为核心基因编辑过程，通过单次同源重组（单交换）+二次同源重组（双交换），实现无痕定点敲入五肽序列，配套正负筛选体系完成初步菌株筛选。
（1）第一次同源重组（单交换，获得UW4-1菌株）：将重组pEX质粒导入UW4菌株，质粒无法自主复制，仅能通过同源臂与菌株拟核的野生ACCR基因发生单交换，整个质粒骨架完整整合到细菌拟核DNA中。此时菌株基因组同时存在野生ACCR序列和带五肽的改造序列，且携带庆大霉素抗性基因与蔗糖致死基因。通过庆大霉素正向筛选，未整合质粒的野生菌株因无抗性死亡，仅UW4-1整合菌株存活。
（2）第二次同源重组（双交换，产生两类菌株）：UW4-1菌株基因组中的同源序列再次发生随机双交换，切除质粒骨架序列，产生两种结果：一是靶向编辑，同源交换把整个质粒骨架（ori+庆大霉素抗性基因+蔗糖致死基因）完整切除。蔗糖致死基因被彻底丢掉，菌株可以在含蔗糖的培养基存活。仅保留“前端－五肽－后端”序列，获得目标工程菌UW4-2；二是回复突变，同源交换把插入的外源片段整体切除，基因组恢复成原始野生序列，即初始亲本菌株。表现为庆大霉素敏感、蔗糖耐受。
图中的第二次筛选是负向筛选，用蔗糖筛选，培养基加入蔗糖：凡是基因组还保留sacB蔗糖致死基因的细菌都会裂解死亡；只有丢掉质粒骨架的两类细菌才能存活：①成功插入五肽的UW4-2；②变回野生型的回复菌株。
答案：防止目的基因自身环化、防止质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接（保证目的基因正向插入质粒）（写出任意2点即可）
解析：只用一种限制酶切割时，质粒和目的基因两端产生相同黏性末端，容易出现质粒自连、目的基因自连、目的基因反向插入；两种不同限制酶切割，两端产生不同黏性末端，只能定向正向连接。
（3）我国科学家将来自玉米的a-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是：。
答案：防止工程菌(或重组质粒)扩散到环境中，造成基因污染
解析：花粉失活是防止转基因植物的外源基因随花粉扩散；质粒不复制策略的目的是，质粒的复制原点ori不能在UW4中启动复制，质粒无法在菌体内独立复制。只有质粒整合到拟核DNA上才能随染色体复制保留，游离质粒会随细胞分裂丢失，避免游离重组质粒扩散到环境造成基因污染。
（4）要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加 ，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是；在第二次筛选培养基中添加。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是(填图c中序号)；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并。
图c解读：重组菌株拟核结构分型与鉴定依据
图c展示二次筛选后四种拟核结构，区分存活菌株与淘汰菌株，是试题填空与鉴定方法设问的核心依据。
（1）①④结构：保留完整质粒骨架（复制原点、抗性基因、蔗糖致死基因），携带致死基因，在蔗糖培养基中无法存活，二次筛选后被完全淘汰，不属于实验最终菌株。
（2）②结构（野生回复株）：无五肽插入，序列为原始“前端－后端”，片段长度最短，是双交换回复突变的产物，可在蔗糖培养基存活，为非目标菌株。
（3）③结构（目标工程菌UW4-2）：成功插入五肽序列，序列为“前端－五肽－后端”，片段长度更长，是实验所需的功能改造菌株。
（4）鉴定：②③菌株筛选性状完全一致，无法通过培养基区分，仅能通过PCR扩增目标区段后进行琼脂糖凝胶电泳，依据条带迁移速率（片段长度差异）鉴定。
答案：庆大霉素 pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长 蔗糖 ② 电泳检测
解析：第一次筛选：庆大霉素。筛选原理：pEX质粒携带庆大霉素抗性基因，只有发生第一次同源交换、质粒整合到拟核的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基存活；未导入质粒的野生菌无抗性，无法生长。
第二次筛选培养基添加：蔗糖。质粒上有蔗糖致死基因。如果质粒完整保留在拟核中，蔗糖致死基因表达，细菌无法存活；只有第二次同源交换丢掉蔗糖致死基因，细菌才能在含蔗糖的培养基存活。
另一株菌株拟核DNA结构：选②。UW4-2：只保留 “前端-五肽-后端”（对应图③）；另一同源交换产物：丢失五肽序列，恢复为原始 “前端-后端”（对应图②）。
最后一空：琼脂糖凝胶电泳（电泳检测）。两种菌株DNA片段长度不同，PCR扩增产物经电泳，条带位置不一样，可区分。（以上是个人观点，仅作参考，关于两次同源重组的细节过程下次再解析）
