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这里展示的是组织框选区域和对齐情况。在这里可以看到CytAssist表达实验过程中图像与检测到的组织重叠情况，框选的正方形区域就是最终分析的空转数据区域（蓝色区域是实际检测到的区域），这个区域选择是和组织形态学密切结合的，需要结合生物学背景情况选择。

注意：当我们对齐后，可以看到这个框选的方框边缘的形状，方框四个脚正常情况下对齐后理论上应该是：

正方形：左上角 

六边形：右上角 

三角形：左下角 

圆圈：右下角

这里存放的是CytAssist表达实验过程中与显微镜图像对齐的情况。最下方的滑块可以拖动，确定显微镜图像和CytAssit表达实验图像之间的对齐情况，主要是看其边缘的边界和形态特征是否对齐。

这个就是和Summary报告中展示一样，与图像匹配对齐的UMI总数。

每8µm bin的总UMI计数映射到空间位置，评估不组织检测和对齐情况。

下方图图中，用每个点的颜色，来展示了对齐到组织上的UMI数量。可以调节色标和不透明度，来检查对齐质量。

Bin-Level Metrics

bins水平下的一些指标展示

Bin Size (µm)：

展示不同分辨率bins：这里表中是8µm和16µm

Number of Bins Under Tissue：

不同分辨率bins下的组织含有的spot总数。

Mean UMI Counts per Bin：

不同分辨率bins下的组织的UMI均值。

Mean Genes per Bin：

不同分辨率bins下的组织的Genes均值。

spaceranger也会跑降维聚类的情况，给大家展示下具体聚类的情况，以评估样本的细胞类型多样性是否符合预期。这里展示不用分辨率bins下聚类的数字分群结果映射到空间位置和umap降维上的结果。这里是可以选择8µm和16µm分辨率bims下的结果进行查看。

这个展示了各个数字分群的差异基因表格，其中ID是每个基因的Ensemble ID，Name是基因的symbol。L2FC是是每个数字分群中表达与其他数字分群间比较，该基因表达的 log2 比率。值为 1.0 表示该数字分群与其他数字分群相比，该数字分群的表达量增加了 2 倍。p 值是表达差异统计显著性的度量（已经做过Benjamini-Hochberg多重检验校准后），是基于负二项式检验。

Cell Segmentation

这里同之前summary一样，展示的是空间切片框选区域按分割方法鉴定Cell进行统计Cell的各个指标情况。

Number of Cells：

大于等于1的unique的UMI的Cells数目

Reads in Cells：

每个cell的reads数目与整体实验的reads数目占比

UMIs in Cells：

每个cell的UMI占比

Mean Reads per Cell：

中位reads数目

Median Genes per Cell：

中位基因数目

Median UMIs per Cell：

中位UMI数目

Median Cell Area (μm²)：

中位cell占据区域大小，是通过计算各个cell按分割鉴定2平方微米方格的占据格子数目情况来计算的。

Median Nucleus Area (μm²)：

中位nucleus占据区域大小，是通过计算各个nucleus按分割鉴定2平方微米方格的占据格子数目情况来计算的。

Maximum Nucleus Diameter (pixels)：

以像素单位检测到Nucleus的最大可能直径。

Cell Segmentation

这里展示了spaceranger所做的聚类降维后的数字分群映射到空间位置的情况。

可以通过控制左上角Tissue image、Segmentatio和Clusters勾选，可以看下聚类结果与HE染色呈现的组织病理结构的吻合程度，吻合程度越高，提示数据质量越好。

Cell区域统计的Cell数目统计直方图。是根据2μm²的分辨率bins下相加计算得出。

基于cell下的降维分群情况。

与Cell Size Distribution同理，这是展示的每个cell的基因和细胞数目的统计直方图。

与Cell Size Distribution同理，这是展示的每个cell的UMI和细胞数目的统计直方图。

与之前Bin-Level Metrics内相似，这个展示了cell分辨率下各个数字分群的差异基因表格，其中ID是每个基因的Ensemble ID，Name是基因的symbol。L2FC是是每个数字分群中表达与其他数字分群间比较，该基因表达的 log2 比率。值为 1.0 表示该数字分群与其他数字分群相比，该数字分群的表达量增加了 2 倍。p 值是表达差异统计显著性的度量（已经做过Benjamini-Hochberg多重检验校准后），是基于负二项式检验。

关于空间转录组数据和组织形态学结构吻合的补充

本次将Visium HD网页报告剩余部分介绍给大家了，基于图像和不同bins分辨率的情况，还有基于软件鉴定Cell分辨率基础上的结果。

注意大家需要留意的是图像对齐组织形态结构的情况，一些鉴定的聚类和HE染色的组织形态结构是否吻合，以评估是否存在一定组织脱片的情况。

UMI表达分布是否符合组织表达预期，这个需要一定的生物学背景结合，举例：对于肿瘤组织而言，组织染色致密的往往是癌细胞区域，其通常表达量高，UMI分布应该比较高，相反细胞稀疏的平滑肌区域、成纤维细胞区域通常表达量低，其UMI分布应该比较低。

HE染色和检测区域的吻合程度判定一定要注意，需要结合生物学背景看，想这些框选区域，需要结合显微镜下的片子情况来看，可以看到显微镜下本身就是存在一堆空泡区域，这种不一定是脱片引起的，也可能本身组织结构存在一定间隙情况，具体情况需要结合组织的真实结构来判读。一般来说如果显微镜下结构存在，而该地方UMI和聚类结果没有，这个区域温和程度不高，可能该位置产生了脱片情况。如果脱片的这区域不是非常多，还可以接受，如果大面积UMI分布很低，那么可能需要考虑重做了。 

下方是一些示例帮助大家理解：举例框选区域不一定就是细胞结构，因此没有UMI分布是可能正常的情况。所以需要大家根据众多对齐的结果和生物学背景综合判读，无法一概而论。

后记

spaceranger的结果比较复杂，理解起来需要有一定组织形态学、生理学和病理学的知识，实际形态和检测结果区域温和程度需要综合研判，评估脱片情况。尺度把握也是比较麻烦，还是以你实际研究目的出发，如果显微镜下细胞结构存在，而这个区域没有检测UMI分布没有，可以考虑不同分辨率调整看下，UMI分布是否改善，如果不同分辨率无法改善，此时，需要考虑这类区域发生的比例，如果大面积的细胞结构都没有UMI分布，脱片严重，该片子在实验端捕获存在异常情况，可能需要改善空转实验条件，或者使用增强组织和破片吸引度的防脱片的玻片来做空转。

说了这么多，下一期我们继续讲spaceranger后续结果文件的解读，大家多多关注！