2区7.5分!审稿人很难拒的发文模板:TCGA+CPTAC公共数据库挖掘+细胞敲除+免疫组化+分子对接,把PR阴性子宫内膜癌故事讲圆!

为探究CD146在子宫内膜癌（EC）中的差异表达，我们分析了从TCGA数据库获取的545例EC组织及35例癌旁正常组织的RNA-seq数据。与正常子宫内膜相比，EC组织中PR和CD146的mRNA水平均显著下调（图1A，B）。利用CPTAC蛋白质组学数据在蛋白水平进一步验证了这一下调趋势，证实与正常子宫内膜样本相比，EC中PR和CD146的表达均显著降低（补充图1），支持mRNA-蛋白表达模式的一致性。鉴于PR和CD146在EC中呈现共下调模式，我们进一步探究了它们在肿瘤进展中的潜在临床意义。基于PR和CD146的表达水平，将EC病例系统性地分为若干亚组（图1C）。在PR低表达亚组中，采用Kaplan-Meier生存分析评估CD146表达状态对患者临床结局的影响。结果显示，在该亚组中CD146表达水平与总生存期（OS）无显著相关性（p = 0.1785，图1D），但与疾病特异性生存期（DSS）和无进展间期（FPI）显著相关（p < 0.05，图1E，F）。多重检验分析进一步表明，CD146高表达和低表达水平均与DSS和FPI相关，其中CD146低表达表现出尤为显著的影响（图1G）。接下来，为探索CD146影响患者预后的潜在生物学通路，我们进行了通路富集分析。通路富集分析表明，在PR-low EC患者中，CD146表达与EMT和葡萄糖代谢相关通路密切相关（图1H-K）。为验证这些通路是否介导CD146的生物学功能，我们通过细胞功能实验进一步探索了其潜在机制。

上述结果表明CD146在EC组织中下调，并参与调控EMT和葡萄糖代谢。然而，CD146、EMT和葡萄糖代谢之间的精确调控相互作用及分子机制仍有待阐明。为此，我们开展了一系列基于细胞的功能实验。

为研究高糖环境对JEC细胞的影响，我们首先评估了葡萄糖刺激下的增殖活性。CCK-8实验显示，与对照组相比，10、25和50 mM葡萄糖处理以浓度依赖方式显著增加JEC细胞的增殖（图2A），表明升高的葡萄糖水平可显著增强细胞增殖。划痕愈合实验表明，25 mM葡萄糖暴露显著提高了JEC细胞的迁移率（图2B，C），提示其迁移能力增强。同样，Transwell侵袭实验证明25 mM葡萄糖处理显著增强了JEC细胞的侵袭能力（图2D，E），进一步支持高糖的促侵袭作用。此外，流式细胞术分析显示，10 mM和25 mM葡萄糖处理均显著降低了JEC细胞的凋亡率（图2F，G），提示高糖同时具有抗凋亡作用。

综上所述，这些结果表明高糖微环境抑制凋亡并增强JEC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示升高的葡萄糖水平可能通过促进更具侵袭性的肿瘤表型而推动EC进展。

为进一步研究高糖对JEC细胞中CD146表达及EMT的影响，我们建立了高糖诱导细胞模型并检测了关键EMT标志物的变化。首先，我们验证了高糖是否能有效诱导JEC细胞发生EMT过程。qRT-PCR结果显示，高糖处理显著上调了间充质相关标志物的表达，包括N-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail和Slug，同时在mRNA水平下调了上皮标志物E-钙黏蛋白（图3A）。一致地，CD146表达在高糖条件下也显著降低（图3B）。Western blot分析进一步证实，高糖暴露不仅显著上调了作为EMT特征性标志的N-钙黏蛋白水平，同时还伴随着CD146表达的显著降低（图3C，D）。这些结果表明CD146表达与高糖诱导的EMT呈负相关，提示CD146可能作为参与该过程的调控因子。

进一步的Western blotting实验证明，CD146敲低增强了高糖诱导的N-钙黏蛋白上调，并相应抑制了E-钙黏蛋白的表达，支持CD146缺失在高糖条件下促进EMT并加速肿瘤进展的作用（图4A-D）。相反，CD146过表达显著降低了N-钙黏蛋白水平并升高了E-钙黏蛋白水平，表明强制表达CD146可有效抑制高糖诱导的JEC细胞EMT（图4E-H）。与JEC细胞中的观察结果一致，HEC-1A细胞中CD146敲低得到了相似的结果（补充图2A-C）。具体而言，CD146缺失不仅进一步增强了高糖诱导的N-钙黏蛋白上调，同时在正常葡萄糖条件下抑制了E-钙黏蛋白的表达。此外，观察到显著的形态学转变（补充图2D），其特征为从上皮样的鹅卵石或多边形形态转变为间充质样的梭形表型，这是EMT过程的典型形态学特征。

综合来看，这些发现表明高糖条件下CD146表达的缺失可能加剧EC细胞的EMT，从而促进肿瘤增殖和迁移。高糖刺激可能通过调控细胞黏附分子CD146的表达来促进EMT并增强EC细胞的恶性表型。

为进一步验证CD146在EC中的表达和角色，我们进行了免疫组织化学（IHC）分析。结果表明，与正常子宫内膜组织相比，EC组织中CD146表达显著降低。半定量评分和统计分析证实，相对于正常对照，EC标本中CD146水平显著降低（P<0.01，图4I-K）。此外，配对样本分析进一步证明，同一患者EC组织中的CD146表达一致性地低于匹配的癌旁正常组织（P<0.01，图4L）。至此，涵盖转录组学、蛋白质组学和组织样本研究的多层面分析一致证实了EC中CD146表达的下调。这些临床观察与前述体外研究结果一致，进一步强化了CD146在EC中下调的结论。

为评估CD146作为EC治疗靶点的潜力，我们整合了药物敏感性筛选和分子对接方法，系统探索其药理学作用。基于CD146低表达与EC患者预后不良相关的发现，我们通过药物敏感性分析进一步探索了靶向CD146相关信号通路的治疗策略。基于基因表达与药物敏感性之间的Spearman相关性（ ρ ）和Cliff's delta（ δ ），我们鉴定了与CD146表达最显著相关的五种小分子化合物。这些包括Mcl-1抑制剂UMI-77\1939、Aurora激酶抑制剂Tozasertib\1096、TGF- β 受体抑制剂SB505124\1194、VEGFR抑制剂Cediranib\1922和FGFR抑制剂PD173074\1049，它们参与凋亡、细胞周期调控、EMT、血管生成和生长因子信号转导等关键生物学过程（图5A）。

在PR-low亚组中的进一步分析表明，CD146表达与预测的药物敏感性之间存在显著关联（FDR < 0.001）。具体而言，CD146水平与PD173074\1049（ ρ = −0.50 ， δ = −0.52 ，图5B）、Cediranib\1922（ ρ = −0.49 ， δ = −0.46 ，图5C）、UMI-77\1939（ ρ = −0.45 ， δ = −0.46 ，图5D）和Tozasertib\1096（ ρ = −0.43 ， δ = −0.42 ，图5E）的敏感性呈负相关，提示较高的CD146表达可能增强肿瘤对这些药物的敏感性。值得注意的是，CD146表达与TGF- β 受体抑制剂SB505124\1194的敏感性呈显著正相关（ ρ = 0.42 ， δ = 0.41 ，图5F），表明较低的CD146表达可能与对该化合物敏感性增强相关。这些计算发现与我们之前关于CD146下调在高糖条件下促进JEC细胞EMT的体外观察结果一致。综合来看，这些数据提示CD146低表达可能促成细胞依赖于TGF- β 信号通路来维持侵袭性表型的状态。因此，使用SB505124靶向该通路可能代表针对这一特定EC分子亚型的潜在治疗策略。

分子对接分析进一步支持上述发现，证明所有评估的小分子化合物均以良好的亲和力与CD146蛋白结合，表现为结合能低于-5.00 kcal·mol −1 且形成至少两个氢键（表2，图5G-K）。这些结果表明化合物与CD146之间具有良好的结合亲和力和稳定的相互作用模式，从而为未来设计和优化靶向CD146的治疗策略提供了结构基础。