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普 通普 ® 高 通 普 通 高 中 教 科 书 中 高 课 程中 标 教 准 科 教 科书 书 生 生物学 物 学 选择性必修 3 PUTONG GAOZHONG JIAOKESHU 选 择 SHENGWUXUE 性 生物技术与工程 必 修 3 生 物 技 术 与 工 程 绿绿色色印印刷刷产产品品 定价： 元 生生物物选选择择性性必必修修33封封面面66..00..iinndddd 11 22002200//66//1166 上上午午1100::4499生物学 普 通 高 中 教 科 书 选择性必修 3 生物技术与工程 人民教育出版社 课程教材研究所 编著 生物课程教材研究开发中心 ·北京·主 编：朱正威 赵占良 副 主 编：何奕騉 本册主编：孙万儒 包春莹 编写人员：（以姓氏笔画为序） 于 璇 包春莹 刘 丹 孙万儒 卓 婧 高崇明 韩之明 焦雨铃 责任编辑：刘 丹 美术编辑：王 喆 普通高中教科书 生物学 选择性必修3 生物技术与工程 人民教育出版社 课程教材研究所 编著 生物课程教材研究开发中心 出 版 （北京市海淀区中关村南大街17号院1号楼 邮编：100081） 网 址 http://www.pep.com.cn 版权所有·未经许可不得采用任何方式擅自复制或使用本产品任何部分·违者必究 如发现内容质量问题，请登录中小学教材意见反馈平台：jcyjfk.pep.com.cn 如发现印、装质量问题，影响阅读，请与×××联系调换。电话：×××-××××××××目 录 科学家访谈 生物科技创造美好未来 ——与杨焕明院士一席谈 第1章 发酵工程....................................................... 1 科技探索之路 从传统发酵技术到发酵工程 ............... 2 第1节 传统发酵技术的应用 ........................................ 4 ........................... 探究・实践 制作传统发酵食品 6 第2节 微生物的培养技术及应用 ................................ 9 一 微生物的基本培养技术 ................................... 9 ............................. 探究・实践 酵母菌的纯培养 12 拓展视野 微生物菌种的高通量筛选 ................. 15 二 微生物的选择培养和计数 ............................. 16 探究・实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与 ................................................. 计数 18 与生物学有关的职业 发酵工程制药工 ............. 21 第3节 发酵工程及其应用 .......................................... 22第2章 细胞工程...................................................... 31 科技探索之路 细胞工程的发展历程 ......................... 32 第1节 植物细胞工程 .................................................. 34 一 植物细胞工程的基本技术 ............................. 34 ............................. 探究・实践 菊花的组织培养 35 二 植物细胞工程的应用 ..................................... 39 第2节 动物细胞工程 .................................................. 43 一 动物细胞培养 ................................................. 43 二 动物细胞融合技术与单克隆抗体 ................. 48 与生物学有关的职业 细胞培养工程师 ............. 51 三 动物体细胞核移植技术和克隆动物 ............. 52 第3节 胚胎工程 .......................................................... 56 一 胚胎工程的理论基础 ..................................... 56 二 胚胎工程技术及其应用 ................................. 60 第3章 基因工程...................................................... 67 科技探索之路 基因工程的诞生和发展 ..................... 68 第1节 重组DNA技术的基本工具 ............................. 70 .................... 探究・实践 DNA 的粗提取与鉴定 74第2节 基因工程的基本操作程序 .............................. 76 ........ 探究・实践 DNA 片段的扩增及电泳鉴定 84 拓展视野 历史不能忘记中国科学家对PCR的 贡献 ...................................................... 86 第3节 基因工程的应用 .............................................. 87 第4节 蛋白质工程的原理和应用 .............................. 93 第4章 生物技术的安全性与伦理问题.................. 99 科技探索之路 生物技术发展与社会进步 ............... 100 第1节 转基因产品的安全性 .................................... 101 第2节 关注生殖性克隆人 ........................................ 106 第3节 禁止生物武器 ................................................ 111 .... 附录1 植物组织培养实验常用培养基的配方和配制方法 116 ...... 附录2 DNA的粗提取与鉴定实验相关试剂的配制方法 117 .................... 附录3 琼脂糖凝胶电泳实验相关试剂的配方 117科学家访谈 生物科技创造美好未来 —与杨焕明院士一席谈 杨焕明 浙江温州人，中国科学院院士，发展中国家科学院院士，美国、德国、 印度国家科学院及丹麦皇家科学院外籍院士，欧洲分子生物学组织外籍 成员。 杨焕明院士一直从事基因组学的研究， 何一位参与研究的科研人员都可以自由回 取得了多项有影响力的科研成果。2017年 答，因为大家对自己的工作目标都非常清 10月29日，在深圳国家基因库，他在百忙 楚，都知道自己在做什么，为什么要做。 之中接受了我们的采访。 人类基因组计划对方方面面产生的影响， 我们有目共睹。在今天看来，我国科学家 问：您从事基因组学的研究，取得了很 贡献的1%的工作量并不算大，但却意义深 多重要成果。在研究过程中，您印象最深刻 远，这项工作使我国科学家走向了国际舞 的一件事是什么？ 台，展示了我们的智慧和实力。在这个过 答：在人类的自然科学史上，这半个 程中科学家建立了我国基因组学研究的技 多世纪是生命科学研究进展最快的时期， 术平台及专业队伍，从而为我国此后的生 其中最重要的是1953年DNA双螺旋结构 命科学研究和生物产业发展奠定了重要基 的发现，而我印象最深刻的则是我国参与 础。人类基因组计划的完成是六国科学家 的人类基因组计划。那时很多同行都认为 共同参与和贡献的结果，它还形成了一种 这件事在我国是可望而不可即的，但我们 精神——人类基因组计划的精神，即“共 做成了，并且做得很好。那个时候，大家 需、共有、共为、共享”。“共需”是指人 都非常辛苦，夜以继日，累了就趴一会 类有着共同的命运和相同的需求，即都需 儿，可是我们都觉得很有意义，再苦再累 要了解我们自身，了解人类健康的奥秘， 心里也是甜的。国内外的记者来采访，任 这将有助于我们认识生命的起源、进化和发展，人类疾病产生的原因，长寿与衰老 个完整的中国人基因组图谱——这也是第一 的机制等。“共有”是指人类基因组是全人类 个亚洲人全基因组序列图谱；我们首先发表 的共同财富和遗产，参与人类基因组计划这 了水稻（籼稻）的基因组序列图谱以及之后 样的历史性机遇是我们大家共有的发展机会。 完成了大熊猫基因组的测序和研究工作。在 “共为”是指全人类的事理当由全世界的科学 这些工作中，尽管那时测序仪还不是我们自 家一起来做。“共享”则是研究成果共享，更 己制造的，但最好的软件是我们发明的。这 进一步就是共同分享人类美好的未来。 些成果的取得和技术的进步彰显了我国科学 家和技术人员攻坚克难的决心，凝聚着他们 问：您是怎么进入基因组学这个研究 辛勤的汗水，更带动了全球这一研究领域的 领域的？您最想与大家分享的研究成果和 发展。现在我国已经能生产测序仪这些高端 感悟是什么？ 设备了，我们还有新的梦想——设计基因 答：首先是兴趣。我小时候，第一次 组。如果说基因组测序是“读懂生命密码”， 看到莲藕时，那一圈排列整齐的小孔令我 那么基因组的设计合成就是在“编写生命密 十分惊讶，我联想到了实心的大树和空心 码”。从读到写，这是一个巨大的飞跃。 的竹子，迄今还常常感叹这些生命的奇妙。 还有，牛的角为什么长得那么对称？公鸡 问：生物技术在迅猛发展，它与人类健 为什么会每天准时报晓？后来，我知道了 康、生产生活的关系越来越密切，有关技术 这些都与基因有关，就更加想要探个究竟。 的发展和应用会给未来带来哪些变化？ 其次就是机遇。我在中学毕业后，做 答：生物技术是应用生命科学的研究 过一段时间的农业微生物的研究，后来， 成果，对生物或生物的成分、产物等进行 遇到一个好机会上了大学。之后，我又在 改造和利用的技术。生物技术是一个综合 国外的高校和顶尖的科学 性的技术体系，我们可以 殿堂里继续深造，有了更 将它与工程学原理相结 多的机会接触和参与最前 合，来进行研究、设计和 沿的科学研究，其中就包 加工生产，为社会提供 括基因组学的研究，我还 服务。生物技术的发展和 结识了很多良师益友。 应用会给未来带来的变化 我想跟大家分享的研究 可以用“生命、生态、生 成果有很多。例如，前面提 活”几个词来概括。这里 到的我国科学家参与完成了 说的“生命”，就是指我 人类基因组计划；还有之后 们健康的基础，生物技术 我国科学家承担了10%任务 让我们摆脱了许多疾病的 大熊猫基因组的测序成果以封 的“人类基因组单体型图计 威胁，有了检测和攻克更 面文章的形式发表在国际权威 划”；我们独立完成了第一 多疑难杂症以及健康长寿 杂志《自然》（Nature）上的信心。“生态”，意味着未来生物技术将 书，包括生物学的书籍。你读得越多，懂得 在建设生态文明、改善生存环境和保护生 越多，就会发现更多学习生物学的乐趣。学 物多样性等方面发挥更加重要的作用。当然， 习这部分内容绝不能靠死记硬背，首先要理 生活环境更美了，我们的生活才能更加幸福。 解生物技术的原理，然后再了解技术与社会 生活等方方面面的联系。另外，生物技术具 问：高中生学习生物技术与工程有什么 有通用性，如基因工程的一些技术也会应用 意义？您对他们学习这部分内容有什么建议？ 到发酵工程、细胞工程等，因此同学们在学 答：高中生学习生物技术与工程方面的 习这部分内容时，要结合前面所学的知识， 内容是非常重要的，一方面可以使同学们更 自下而上、纵横衔接、融会贯通。 加深入地了解现代生物科技的进展和影响； 生命是美丽的，越是对它欣赏越使我 另一方面可以为同学们在今后择业时拓宽思 们想要接近它；生命是复杂的，越是对它 路和开阔眼界，进而使自己的人生价值得以 不断探索越可以满足我们与生俱来的好奇 实现。同学们还要进一步提高自己发现、分 心。也许今天，我们赞颂生命，是因为它 析和解决问题的能力，更多地思考生物技术 的千姿百态与奇妙无比；而明天，我们会 的安全性与伦理问题，更加理性地看待科学 发现生命是最有规律的，也是最为简洁、 技术的发展，明白自己应该承担的社会责任。 明快的；将来，我们迎来的必是一个更为 兴趣是最好的老师。现在信息技术很 和谐、美妙的生命世界！ 发达，同学们可以通过各种渠道读到更多的 我最想对高中生说的话： 生命是美丽的，人生是美好的；从事研究生命 科学的人生，不仅使我们自己的人生更加美好，也 将使包括人类在内的生命世界更加美丽。 2017年10月 深圳国家基因库第 1 章 发酵工程 面包和酸奶，或者馒头夹着腐乳，是很多人喜欢的早餐。 你知道吗？这些食品的制作都离不开微生物发酵。那么，制 作不同的发酵食品，需要的微生物一样吗？如何分离和培养 微生物呢？ 除了上述可以通过传统发酵技术生产的食品，啤酒、味 精乃至胰岛素等药物的工业化生产，也利用了微生物的发酵。 然而，工业化大规模生产在菌种的选育和培养、发酵条件的 控制等方面比传统发酵生产要复杂得多，需要通过发酵工程 来实现。那么，发酵工程的流程是怎样的？它用到的技术与 传统发酵技术有什么不同？发酵工程在社会和经济中有哪些 应用？ 发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代 工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌 种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。 第1节 传统发酵技术的应用 1科技探索之路 从传统发酵技术到发酵工程 我国战国时期盛酒 的铜器和其中的酒 约9 000年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物、 水果等发酵为含酒精的饮料。后来，人们通过自然 发酵或曲种传代的固体发酵方法生产其他食品，如 酱油、醋、豆豉、腐乳和酸奶等。这种传统发酵技 展示3 000多年前古埃及人 术促进了中华民族特有的饮食文化的形成，但在几 采摘葡萄酿酒场景的壁画 千年的时间里，人们并不明白其中的原理。 1850 1900 1857年，法国微生物学家巴斯德 1897年，科学家发现了酶在酵母菌发酵中的 （L. Pasteur，1822—1895） 通 过 作用，逐渐了解了发酵的本质。之后的30多 实验证明，酒精发酵是由活的酵 年间，微生物的分离和纯化技术得到了应用， 母菌引起的，从而将酵母菌与发 发酵生产的工艺和设备不断完善，传统的固体 酵联系起来。 发酵开始向半固体发酵和液体发酵演变。同 时，作坊式的手工生产向近代工业化生产方向 发展。利用微生物生产的新产品，如酒精、柠 檬酸和淀粉酶等不断出现。 巴斯德正在做实验 电镜下的酿酒酵母（照片经后期 人工上色处理，放大约2 000倍） 2 第1章 发酵工程利用微生物发酵生产 干扰素的车间 第一批青霉素发酵罐 20世纪40年代，利用发酵工程大规模生产青霉素 20世纪70年代以后，基因工程、细胞工 成为研究的主攻方向。由于青霉素产生菌是需氧 程等的发展，使发酵工程进入了定向育种 型的，科学家在厌氧发酵技术的基础上，建立了 的新阶段。例如，运用基因工程可以将动 深层通气液体发酵技术，使青霉素的生产实现了 植物的基因转移到微生物中，获得具有 产业化。不久，随着链霉素、金霉素和土霉素等 特殊生产能力的微生物，大量生产人们 抗生素的发现及生产，抗生素发酵工业兴起。 所需要的产品，如人胰岛素、干扰素等。 1940 1960 1970 1980 1957年，用微生物生产谷氨酸获得成 20世纪80年代，科学家开始运用数 功。20世纪60年代，科学家通过研究微 学、动力学、化学工程原理以及计算 生物的代谢途径，继续改进发酵技术， 机技术对发酵过程进行综合研究，以 通过人工诱变特定微生物，获得了具有 更加合理地控制发酵过程。目前，人 更高生产能力的突变类型。之后，酶制 类已经能够自动记录和控制发酵过程 剂、多糖、维生素发酵工业相继兴起。 的全部参数。 部分发酵工程产品 生产氨基酸的工厂一角 科技探索之路 3第 1 节 传统发酵技术的应用 从社会中来 “葡萄美酒夜光杯，欲饮琵琶马上催。醉卧沙场君莫 笑，古来征战几人回。”（唐·王翰）诗中提及的葡萄酒是 人类利用微生物发酵制作而来的。通过微生物的发酵作用 还可以制作葡萄醋。葡萄酒和葡萄醋都是以葡萄为原料发 酵而来的饮品，为什么一个是醇厚浓郁、耐人寻味的酒， 一个却是酸味柔和、口感绵长的醋呢？它们的制作方法有 什么不同？你想不想自己动手制作葡萄酒和葡萄醋呢？ 葡萄及葡萄酒 本节聚焦 人类有意无意地利用微生物发酵制作果酒或其他食品， ● 什么是传统发酵技术？ 已经有几千年的历史。 ● 制作泡菜、果酒和果醋的原理是 什么？ 发酵与传统发酵技术 ● 怎样制作泡菜？怎样制作果酒 约9 000年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物、水 和果醋？ 果等发酵成含酒精的饮料。夏禹时期，已有了关于少康 （即杜康）造秫酒的传说。人类最初可能是发现储存的水果 会自然发酵变成酒，因而逐渐摸索出酿酒技术的。酿酒技 术给古代人民的生活增添了丰富的色彩（图1-1、图1-2）。 我国具有悠久的酿酒文化和历史，许多古老的酿酒工艺一 直保留并延续至今。 图1-1 汉代砖刻上的酿酒图 图1-2 展示我国古代酿酒作坊的绘画作品 4 第1章 发酵工程1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精 发酵是由活的酵母菌引起的。此后，人们才开始了解发酵的 本质。这里所说的发酵（fermentation），是指人们利用微生 物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类 所需要的产物的过程。不同的微生物具有产生不同代谢物的 能力，因此利用它们就可以生产出人们所需要的多种产物。 腐乳是我国古代劳动人民创造出的一种经过微生物发酵 制作的大豆食品。早在公元5世纪的北魏古籍中，就有关于 腐乳生产工艺的记载。千百年来，腐乳一直受到人们的喜爱。 这是因为经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分 子的肽和氨基酸，味道鲜美，易于消化吸收，而腐乳本身又 便于保存。多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉和 图1-3 正在进行发酵的豆腐坯 毛霉等，其中起主要作用的是毛霉（图1-3）。像这种直接利 用原材料中天然存在的微生物，或利用 前一次发酵保存下来的面团、卤汁等 发酵物中的微生物进行发酵、制 作食品的技术一般称为传统发 酵技术。传统发酵以混合菌 种的固体发酵及半固体发酵 为主，通常是家庭式或作坊式 的。利用传统发酵技术制作的 食品还有酱、酱油、醋（图1-4）、 泡菜和豆豉等，它们是我国传统饮 图1-4 装有醋的醋坛 食文化的重要组成部分。 尝试制作传统发酵食品 传统发酵食品的制作离不开各种各样的微生物。乳酸 菌是厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸 （反应简式1），可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。乳 酸菌种类很多，在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物 体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌分布。常见的乳酸菌 有乳酸链球菌和乳酸杆菌（图1-5）。 图1-5 电镜下的乳酸杆菌 酶 （照片经后期人工上色 1 C H O 2C H O（乳酸）+ 能量 6 12 6 3 6 3 处理，放大约6 000倍） 第1节 传统发酵技术的应用 5酵母菌是一类单细胞真菌，能以多种糖类作为营养物 质和能量的来源，因此在一些含糖量较高的水果、蔬菜表 面经常可以发现酵母菌的存在。酵母菌是兼性厌氧微生物， 在无氧条件下能进行酒精发酵（反应简式 2 ），可用于酿 酒、制作馒头和面包等。温度是影响酵母菌生长的重要因 素，酿酒酵母的最适生长温度约为28 ℃。 酶 2 C H O 2C H OH（酒精）+ 2CO + 能量 6 12 6 2 5 2 探究·实践 制作传统发酵食品 一、制作泡菜 制作传统泡菜是利用植物体表面天然 沿的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经 的乳酸菌来进行发酵的。发酵期间，乳酸会 常向水槽中补充水，根据室内温度控制发酵 不断积累，当它的质量分数为0.4%〜0.8% 时间。 时，泡菜的口味、品质最佳。 结果分析与评价 材料用具 1．用水密封泡菜坛的目的是什么？这 食盐、清水、新鲜蔬菜、蒜瓣、生姜 说明泡菜制作需要什么条件？ 及其他香辛料、泡菜坛或其他密封性良好的 2．为什么泡菜坛只能装八成满？ 罐子等。 3．你腌制的泡菜成功吗？色泽如何？ 方法步骤 口味如何？ 1．用清水和食盐配制质量分数为 进一步探究 5%〜20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用。 1．泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产 2．将新鲜蔬菜（如萝卜、黄瓜和豇豆 生。膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健 等）洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾 康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚 干后装入泡菜坛内；装至半坛时，放入蒜 至死亡。你可以查阅资料，设计实验跟踪检 瓣、生姜及其他香辛料， 测泡菜在制作过程中亚硝酸盐含量的变化， 继续装至八成满。 并探索腌制方法、时间长短和温度高低等条 3．将冷却好 件对亚硝酸盐含量的影响，寻求提高泡菜质 的盐水缓缓倒入 量的措施。 坛中，使盐水没 2．我国幅员辽阔，各地的环境条件和 过全部菜料，盖 人们的生活习惯不相同，制作出来的泡菜风 好坛盖。 味也有所差异。如果感兴趣，你可以查阅相 4．向坛盖边 关资料，制作出不同风味的泡菜。 装有菜料的泡菜坛 6 第1章 发酵工程醋酸菌是好氧细菌，当O 、糖源都充足时能通过复杂 2 的化学反应将糖分解成乙酸（反应简式3）；当缺少糖源时 则直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸（反应简式 4）。醋酸菌可用于制作各种风味的醋。多数醋酸菌的最适 生长温度为30〜35 ℃。 酶 3 C H O + 2O 2CH COOH（乙酸）+ 2H O + 2CO + 能量 6 12 6 2 3 2 2 酶 4 C H OH + O CH COOH（乙酸）+ H O + 能量 2 5 2 3 2 下面我们就动手来制作泡菜、果酒和果醋。 二、制作果酒和果醋 许多新鲜水果（如葡萄）的果皮表面附 次（注意：不是打开瓶盖），此后再拧紧瓶 着有大量的不同种类的野生酵母菌。在这些 盖。发酵时间为10〜12 d。可通过从发酵 酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒。在 瓶口取样来对发酵的情况进行监测。 有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用还可以 5．当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖， 进一步发酵成果醋。 盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。发酵温 材料用具 度为30 〜35 ℃，时间为7〜8 d。 新鲜的水果（如葡萄、苹果、山楂和龙 结果分析与评价 眼等）、洗洁精、体积分数为70%的酒精、 1．在制作果酒和果醋的过程中，发酵 发酵瓶、纱布和榨汁机等。 液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生 下面以葡萄酒和葡萄醋的制作为例来介 在发酵后多少天？引起变化的原因是什么？ 绍，用其他材料制作时可适当调整方法。 2．在制作果酒的过程中，除了酵母菌， 方法步骤 是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵 1．将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精 产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？ 清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消 3．在制作果醋的过程中， 毒，晾干备用。 酵母菌是否还会继续发 2．取新鲜葡萄，用清水冲洗1〜2次， 酵？醋酸菌从何而来？ 再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干。 采用什么措施可以加快 3．用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁 果醋的制作？ 装入发酵瓶中（注意：要留有大约1/3的空 4．你制作的果酒 间），盖好瓶盖。 和果醋的口味如何？如 4．将温度控制在18〜30 ℃进行发酵。 果你对结果不满意，应 在发酵过程中，每隔12 h左右将瓶盖拧松一 该如何改进？ 用带盖的瓶子制作葡萄酒 第1节 传统发酵技术的应用 724 20 16 12 8 4 0 3 5 9 8 第1章 发酵工程 ）gk / gm（/量含盐酸硝亚 在上述传统发酵食品的制作过程中，我们没有接种菌 种，而是利用了天然存在的菌种。菌种差异、杂菌情况不 明和发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的 品质不一。为了缩短发酵时间，确保品质稳定，工业上大 规模生产时，通常会先通过微生物培养技术获得单一菌种， 再将它们接种到物料中进行发酵。 到社会中去 查阅关于果酒和果醋工业化生产的工艺流程，比较自己制作果酒和果醋的方法与这些流 程有哪些异同。在此基础上，请思考：当把少量制作转化为大规模生产时，需要解决哪些实 际问题？你能从中体会到技术与工程的区别和联系吗？ 练习与应用 一、概念检测 测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见曲线图。 1. 油炸臭豆腐是我国一些地方的风味小吃。 制作时需要将豆腐浸入含有乳酸菌、芽孢杆菌等微 生物的卤汁中发酵。判断下列相关表述是否正确。 （1） 卤汁中的乳酸菌和芽孢杆菌不存在竞争 关系。 （ ） （2）乳酸菌发酵产生了乳酸和CO 。 （ ） 2 7 11 13 （3）微生物发酵产生了不同的代谢物使得该 发酵时间/ d 臭豆腐具有特殊的味道。 （ ） 请你帮他分析相关问题。 2. 传统发酵食品的制作需要各种各样的微生 （1）据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你 物。下列相关叙述错误的是 （ ） 认为该泡菜在什么时间食用比较合适？为什么？ A．腌制泡菜利用了乳酸菌的乳酸发酵 （2）他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”， B．制作腐乳利用了毛霉等产生的蛋白酶 造成这个结果最可能的原因是什么？ C．制作果酒利用了酵母菌在无氧条件下产 （3）加入“陈泡菜水”的目的是什么？ 生酒精 3. 有3位同学分别采用了3种不同的发酵装置 D．制作果醋利用了醋酸菌在无氧条件下产 来制作果醋。A同学用的是带盖的塑料瓶；B同学 生乙酸 用了没有盖的塑料瓶，在发酵过程中无盖的瓶口一 直由捆绑在瓶口的8层 充气口 二、拓展应用 纱布覆盖；C同学则设 1. 请举例说说你身边的传统发酵食品有哪 计了如右图所示的发 排气口 些，它们的制作原理是什么。有机会的话，你也 酵装置。结合果醋的制 可以尝试做一做。 作原理，你认为哪一种 2. 某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可 发酵装置更适合制作 出料口 以向泡菜坛中加入一些“陈泡菜水”；在用质量 果醋？你还能继续改 分数为5%的食盐水制作泡菜时，他在不同时间 进这种装置吗？ C同学设计的发酵装置示意图第 2 节 微生物的培养技术及应用 从社会中来 向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌， 再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一 些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自 制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作 过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌 不混入发酵物中呢？ 酸奶 一 微生物的基本培养技术 本节聚焦 ● 什么是培养基？如何配制？ 防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应 ● 什么是无菌技术？ 用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。在实验室培 ● 怎样进行酵母菌的纯培养？ 养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养 相关信息 和环境条件；另一方面要确保其他微生物无法混入，并将 需要的微生物分离出来。 微生物是难以用肉眼观察的 微小生物的统称，包括细菌、真 菌、病毒及一些原生生物等。本 培养基的配制 章中提及的微生物主要指用于发 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供 酵的细菌和真菌。 其生长繁殖的营养基质—培养基（culture medium），用以培养、分离、鉴定、保存 微生物或积累其代谢物。其中，不含凝固 剂（如琼脂）、呈液体状态的培养基为液体 培养基，呈固体状态的培养基为固体培养 基。在液体培养基中加入琼脂后制成的琼 脂固体培养基，是实验室中最常用的培 养基之一。微生物在琼脂固体培养基表 面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌 图1-6 盛有液体培养基的锥形瓶（左）和长有酵母 落（colony）（图1-6）。 菌菌落的固体培养基（右） 第2节 微生物的培养技术及应用 9虽然各种培养基的配方不同，但一般都含有水、碳源 （提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机 为什么培养基需要氮源？ 盐等营养物质。下面让我们一起来看一看某种常见的细菌 培养基的营养构成（表1-1）。 表1-1 1 000 mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 组分 含量 提供的主要营养 相关信息 牛肉膏和蛋白胨来源于动 牛肉膏 5 g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等 物，含有糖、维生素和有机氮等 蛋白胨 10 g 碳源、氮源和维生素等 营养物质。 NaCl 5 g 无机盐 H O 定容至1 000 mL 水 2 在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需 要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O 的需求。例 2 如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在 培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性；在培养细菌时， 一般需要将培养基调至中性或弱碱性；在培养厌氧微生物 时，需要提供无氧的条件。 无菌技术 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技 术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。 无菌技术除用来防止实验室 消毒（disinfection）是指使用较为温和的物理、化学 的培养物被其他外来微生物污染 或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌 外，还有什么作用？ （sterilization）则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所 相关信息 有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒和灭菌工作主要包括 生物消毒法是指利用生物或 两个方面：对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和 其代谢物除去环境中的部分微生 消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进 物的方法。例如，有的微生物能 行灭菌。常用的消毒方法有煮沸消毒、巴氏消毒等；灭菌 够寄生于多种细菌体内，使细菌 方法有湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等。 裂解，因此可以用它们来净化污 做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的 水、污泥。 材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物 的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精 灯火焰附近进行。 10 第1章 发酵工程资料卡 常用的消毒和灭菌方法 消毒 日常生活中经常用到煮沸消毒法。 121 ℃的条件下，维持15〜30 min来灭菌的。 在100 ℃煮沸5〜6 min，可以杀死微生物的 干热灭菌 将灭菌物品放入密闭容器如 营养细胞和一部分芽孢。对于一些不耐高温 干热灭菌箱，在160 〜170 ℃的热空气中维 的液体，如牛奶，则可使用巴氏消毒法，即 持2〜3 h可以达到灭菌的目的。耐高温的和 在62 〜65 ℃消毒30 min或80〜90 ℃处理 需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（如吸 30 s〜1 min，可以杀死牛奶中的绝大多数微 管、培养皿等）、金属用具等，可以采用这种 生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分。 方法灭菌。 此外，人们也常使用化学药物进行消毒，如 灼烧灭菌 将微生物的接种工具，如涂 用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。 布器、接种环、接种针或其他金属用具，直 除了以上方法，还常用紫外线进行消 接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅 毒。例如，接种室、接种箱或超净工作台在 速彻底地灭菌（见下图）。此外，在接种过 使用前，可以用紫外线照射30 min，以杀死 程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位， 物体表面或空气中的微生物。在照射前，适 也可以通过火焰灼烧来灭菌。 量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以 加强消毒效果。 湿热灭菌 这是 一种利用沸水、流通蒸 汽或高压蒸汽进行灭 充分燃烧层 菌的方法。其中高压 不充分燃烧层 蒸汽灭菌的效果最好。 实验室常用的高压蒸 汽灭菌锅（见左图）就 1 2 3 是以水蒸气为介质，在 接种环的灼烧灭菌（1、2、3表示先后顺序） 压力为100 kPa、温度为 高压蒸汽灭菌锅 微生物的纯培养 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形 成的含特定种类微生物的群体称为培养物。由单一个体繁 殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过 程就是纯培养。 微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离 和培养等步骤。下面我们以酵母菌的纯培养为例，通过实 际操作来学习微生物纯培养技术。 第2节 微生物的培养技术及应用 11探究·实践 酵母菌的纯培养 分散的微生物在适宜的固体培养基表 台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培 面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定 养箱等。 形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用 方法步骤 平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生 1．制备培养基 物分散在固体培养基上，之后经培养得到的 配制培养基 称取去皮的马铃薯200 g， 单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培 切成小块，加水1 000 mL，加热煮沸至马铃 养物。下面，我们尝试在马铃薯琼脂培养基 薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20 g葡 上进行酵母菌的纯培养。 萄糖（也可用蔗糖代替）、15〜20 g琼脂， 目的要求 用蒸馏水定容至1 000 mL。 1．学会配制培养酵母菌的培养基并倒 灭菌 将配制好的培养基转移到锥 平板。 形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋 2．学会进行无菌操作。 勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力 3．尝试通过平板划线操作来获得纯化 为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，灭菌 的酵母菌菌落。 15〜30 min。将5〜8套培养皿包成一包， 材料用具 用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在 酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖（或蔗 160〜170 ℃灭菌2 h。 糖）、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、 倒平板 待培养基冷却至50 ℃左右时， 烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸（或报纸）、 在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操 皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作 作步骤如下。 翻转 1 拔出锥形瓶的棉塞。 2 将瓶口迅速通过 3 用拇指和食指将培养皿打开 4 等待培养基冷却凝固 火焰。 一条稍大于瓶口的缝隙，将 后，将培养皿倒过来 培养基（10〜20 mL）倒入 放置。 培养皿，立即盖上皿盖。 12 第1章 发酵工程2．接种和分离酵母菌 24〜48 h。 通过接种环在固体培养基表面连续划 结果分析与评价 线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培 1．在未接种的培养基表面是否有菌落 养基的表面。经数次划线后培养，可以分离 生长？如果有，说明了什么？ 得到单菌落。平板划线的具体操作见下面的 2．在接种酵母菌的培养基上，你是否 流程图。 观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状 3．培养酵母菌 和大小是否一致？如果你观察到了不同形态 完成平板划线后，待菌液被培养基吸 的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起 收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒 的吗？ 置，放入28 ℃左右（培养温度因酵母菌种 3．你是如何记录实验结果的？请与其 类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 他同学交流、互评。 警示：在实验室中，切记不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。 使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 1 将接种环放在火焰上灼烧， 2 在火焰旁冷却接种环。同 3 将试管口通过火焰。 4 在火焰附近用接种环蘸取 直到接种环的金属丝烧红。 时，拔出装有酵母菌培养 一环菌液。 液的试管的棉塞。 5 1 4 3 2 5 将试管口通过火焰，并塞 6 在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用 7 灼烧接种环，待其冷却后，从第一次 上棉塞。 接种环在培养基表面迅速划三至五条 划线的末端开始作第二次划线。重复 平行线，盖上皿盖。 以上操作，作第三、四、五次划线。 注意不要将最后一次的划线与第一次 的划线相连。 第2节 微生物的培养技术及应用 13评估论点的可信程度 有一段时间，水果“酵素”风靡各地。 “酵素”是什么？水果“酵素”的制作 水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、 原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些 切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖 成分？它是否含有人们无法从其他食品中获 和水，密封，置于阴凉处发酵一至两周。 取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵 有人说，吃水果“酵素”可以美容、减 素”中的所有成分都有益于人体健康吗？ 肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论 如果要更加有力地支持或反驳水果“酵 点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。 素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？ 练习与应用 一、概念检测 无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方 1．微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又 法来避免手上微生物的污染？ 要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。 2．某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分 （1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生 离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同 物的生长越有利。 （ ） 种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培 （2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ） 养，摇床转速分别为210 r/min、230 r/min和 （3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物 250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关 的微生物培养物。 （ ） 系如下图所示。请分析回答下列问题。 2．日常生活中保存食品的方法有哪些？这 些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？ 二、拓展应用 1．某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标 签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗 干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同 种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入 2 4 8 37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，发现贴有“洗手 后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列 问题。 （1）摇床转速不同，意味着培养条件有 （1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用 什么不同？ 具有 。 （2）从图中数据你可以得出什么结论？ （2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当 其原因是什么？ 于微生物培养中的哪一步操作？ （3）为什么培养8 h后，其中2个锥形瓶 （3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行 中酵母菌的种群密度基本达到稳定？ 14 第1章 发酵工程 ）Lm / 个601×（/度密群种菌母酵 思维训练 250 r/min 230 r/min 2.5 210 r/min 2.0 1.5 1.0 0.5 0 6 10 培养时间/ h拓展视野 微生物菌种的高通量筛选 在自然界中，微生物的种类远远超过动 氧等重要发酵参数的实时监测。 植物的种类。科学家预测，目前在实验室里 一套理想的微生物菌种高通量筛选流 能够培养的微生物的种类还不到自然界中存 程是高度自动化和集成化的，整个流程中培 在的微生物种类的1%，甚至更低。在如此庞 养基的制备和分装、菌液的稀释和涂布、菌 大的微生物王国里，研究者如何获得目标菌 体的培养和保藏、单克隆的识别和挑选、微 种呢？ 生物及其代谢物的分析和检测以及数据的 过去，人们通过手工操作来进行筛选， 集成和管理等环节都体现着高通量技术的 不仅费时费力，而且大大限制了筛选量。微 应用。虽然目前离这个目标还有一定的距 生物菌种的高通 离，筛选的装置和技术也都还要不断改 量筛选以有多 进，但是微生物 个小孔的微孔 菌种的高通量筛 板为载体，采用 选无疑是微生物 自动化的操作系 研究领域的一场 统，并以灵敏、快 技术革命，也是 速的检测仪器采集 研究成果走向 实验数据，用计算机分析处理数据， 工程化发展道 微孔板 从而实现了在同一时间对上千份，甚至上万 路的强大催化剂。 份的样品进行筛选。筛选的对象可以是从自 除了微生物菌种的高通量筛选，高通 然界分离的菌株，可以是诱变产生的菌株， 量筛选技术还在微生物药物的筛选方面发挥 也可以是通过生物技术改造的菌株。 了积极的作用。我国科学家已成功构建了一 以高通量筛选某种高产突变菌种为例。 系列高通量微生物药物筛选模型，并获得了 研究人员首先会将经诱变处理的菌液分成上 一批具有生物活性的候选药物。 千份，然后把它们全部接种到含有培养基的 微孔板中培养，一段时间后检测培养物中产 物的产量，再挑选高产的菌株进行复筛…… 在这个过程中，最关键的是建立高通量的培 养和分析检测平台。研究人员往往需要开发 合适的培养基，对微生物进行微型化培养以 及利用多种检测技术来测定菌株的各项生理 生化指标等。目前，已经开发出了一些微型 生物反应器，它们就像一套小型的发酵罐， 体积一般小于100 mL，能实现对pH、溶解 高通量筛选装置（局部） 第2节 微生物的培养技术及应用 15二 微生物的选择培养和计数 本节聚焦 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离 ● 怎样运用生物与环境相适应的 出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在 观点来理解选择培养的原理？ 混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法 ● 如何通过调整培养基的配方来 或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？ 有目的地培养某种微生物？ ● 测定微生物数量的常用方法有 哪些？ 选择培养基 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出 水生栖热菌（Thermus aquaticus），进而从这种菌中提取 出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外 扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）。为什么水生栖 热菌能从热泉中被筛选出来呢？这是因为水生栖热菌能 在70〜80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此 条件下不能生存。实验室中微生物的筛选，也可以应用同 样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营 养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制 或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基 （selective medium）。 思考·讨论 选择培养基配方的设计 尿素[CO（NH ）]含氮量高，化学性 某些细菌分解成NH ，NH 再转化为NO -、 2 2 3 3 3 质相对稳定，是现代农业生产中一种重要 NH +等被植物吸收。而这些细菌之所以能 4 的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的 分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催 化尿素分解产生NH ，NH 可作为细菌生长 3 3 的氮源。 讨论 1. 如果让你配制一种培养基，将土壤 稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养 基的配方该如何设计？ 2. 该培养基与普通培养基有哪些共同 点和不同点？ 尿素分子模型 16 第1章 发酵工程微生物的选择培养 如果想知道1 g 土壤中有多少能分解尿素的细菌，仅有 选择培养基是不够的，还需要对土样进行适当的处理以及科 学的测定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大， 要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行 充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，也 就是要采用稀释涂布平板法，其操作如图1-7所示。 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 铲取土样，将样 品装入纸袋中。 2 将10 g土样加入盛有90 mL 1×107 1×106 1×105 1×104 1×103 1×102 1×10 无菌水的锥形瓶中，充分摇 匀。取1 mL上清液加入盛 有9 mL无菌水的试管中， 依次等比稀释。 90 mL无菌水 9 mL无菌水 4 将涂布器浸在盛有 酒精的烧杯中。 3 取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面。 6 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表 5 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、 面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 涂布器冷却后，再进行涂布。 图1-7 稀释涂布平板法操作示意图 第2节 微生物的培养技术及应用 17待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入 30〜37 ℃的恒温培养箱中培养1〜2 d。在涂布有合适浓 度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落（图1-8）。 微生物的数量测定 稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来 统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养 基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活 图1-8 稀释涂布平板操作后 菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含 分离得到单菌落 有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30〜300 的平板进行计数。 样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。在实际 操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保 证获得菌落数为30〜300、适于计数的平板。在同一稀释 度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目 少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察 相关信息 到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是 细菌计数板和血细胞计数板 用活菌数来表示。除上述的活菌计数外，利用显微镜进行 的计数原理相同。血细胞计数板 比细菌计数板厚，常用于相对较 直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量 大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的 的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板， 计数。用细菌计数板可对细菌等 在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微 较小的细胞进行观察和计数。 生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 提出问题 组分 含量 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何 KH PO 1.4 g 2 4 分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的 Na HPO 2.1 g 2 4 细菌？ MgSO ·7H O 0.2 g 基础知识 4 2 葡萄糖 10.0 g 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有 能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素 尿素 1.0 g 作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离 琼脂 15.0 g 出分解尿素的细菌，该选择培养基的配方见右栏。 H O 定容至1 000 mL 2 18 第1章 发酵工程实验设计 操作提示 请你根据前面学过的微生物的选择培 请你根据自己设计的实验方案进行操 养、数量测定的知识以及下面的资料，思考 作。操作中应特别注意以下问题。 有关问题，然后进行实验设计，并写出详细 1. 将涂布器从酒精中取出时，要让多 的实验方案。 余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上 【资料一】 土壤取样 灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土 烧杯中，以免引燃酒精。 壤中生长，绝大多数分布在距地表3〜8 cm 2. 要按照前面学习过的无菌操作的方 的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层 法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取 土。在城市，常见的是公园里、街道旁、花 样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后， 盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或 一定要洗手。 菜园里的土壤。你打算选择什么样的土壤做 3. 本实验使用的平板和试管较多，为 实验呢？ 了避免混淆，最好在使用前做 【资料二】 样品的稀释 好标记。例如，在标记培 测定土壤中细菌的数量，一般选用 养皿时应该注明组别、 1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行 培养日期和平板上培 平板培养。测定土壤中细菌的总量和能分解尿 养样品的稀释度等。 素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 4. 本实验耗时较 如果不同，你打算选用多大的稀释范围？ 长，需要事先规划时间， 当你第一次做这个实验的时候，可 以便提高实验效率，在操 以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将 作时有条不紊。 培养皿的标记 1×103 〜1×107倍稀释的稀释液分别涂布到 结果分析与评价 平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为 1. 结合对照组，分析培养物中是否有杂 30〜300的平板进行计数。 菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 【资料三】 微生物的培养与观察 2. 你是否获得了某一稀释度下菌落数 不同种类的微生物，往往需要不同的培 为30〜300的平板？在这一稀释度下，是否 养温度和培养时间。细菌一般在30〜37 ℃ 至少有2个平板的菌落数接近？ 的温度下培养1〜2 d。本实验中，我们可 3. 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌 以每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数 数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如 目稳定时的记录作为结果。 果差异很大，可能是什么原因引起的？ 一般来说，在相同的培养条件下，同种 进一步探究 微生物表现出稳定的菌落特征。请仔细观察 本活动只是初步筛选了能分解尿素的 你所分离到的菌落，最好以表格的形式将不 细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生 同菌落的特征（如形状、大小和颜色等）记 物化学的方法。你可以查阅相关资料，进一 录下来。 步设计实验来鉴定自己分离的菌种。 第2节 微生物的培养技术及应用 19到社会中去 活菌计数技术广泛应用于食品卫生、水源污染度的检验和土壤含菌量的测定等方面。如果你 感兴趣，可以从下列项目中选做一个，并走访相关部门或企业，了解它们是如何进行检测的。 1．空气中微生物总数的检测； 2．水中细菌总数的检测； 3．牛奶中细菌的分离与计数； 4．土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数。 练习与应用 一、概念检测 利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微 1．研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的 生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒 培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油 精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一 降解菌。判断下列相关表述是否正确。 种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红 （1）这种培养基是一种选择培养基。 （ ） 色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等 （2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修 发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加 复土壤。 （ ） 入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而 （3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染 当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形 的土壤中更容易分离到石油降解菌。 （ ） 成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如 2．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌 下图所示）。请回答下列问题。 数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品 中的活菌数，原因是 （ ） A．菌落中的细菌数目是固定的 B．平板上的一个菌落就是一个细菌 C．通过此方法统计的菌落数与活菌的实际 数目相同 D．平板上的一个菌落一般来源于样品稀释 液中的一个活菌 几种纤维素分解菌在刚果红 培养基上形成的透明圈 二、拓展应用 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请 1．反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器 你给出详细的实验方案。 官—瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解 许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从 菌？为什么？ 瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经 2．地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿 过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素 吨，其中40%〜60%能被土壤中某些微生物分解 分解菌。请你评价这一做法。 20 第1章 发酵工程与生物学有关的职业 发酵工程制药工 如果你走进现代生物制药厂的发酵生产 4．检测发酵生产过程中培养物的无菌情 车间，你听不到轰鸣的机器声，但会看到在 况，操作发酵罐、裂解罐等设备及控制仪表， 无菌或经过消毒处理的车间里，身着干净工 调节和控制发酵、酶解等过程中的各种参数 作服的制药工，在发酵罐和各种仪表前观察 并及时处理异常情况； 和操作着，生产人类所需要的药物。 5．操作相关设备，分离、提取、浓缩发 根据《中华人民共和国职业分类大典 酵液和酶裂解液等中的有效药用成分，再通 （2015年版）》，发酵工程制药工是操作发酵、 过除菌、过滤和结晶等步骤精制原料药品。 灭菌和分离等设备，进行菌种培育、产物发 随着生物技术的发展和生物工程各领域 酵、提取精制和抗生素酶裂解，制成发酵工 之间的交叉渗透，未来可能对发酵工程制药 程药品的人员。该职业又分为抗生素酶裂解 工提出更高的要求。例如，他们不仅要能培 工、制药菌种培育工、制药灭菌发酵工和制 养微生物，还要会用相关技术培养动植物细 药发酵液提取精制工等。发酵工程制药工一 胞，生产一些人类生物活性因子、疫苗等； 般需要具备大专以上学历，掌握微生物学、 或者能够利用基因工程技术构建和选育稳定、 生物化学、药学和生物工程学等专业知识。 高产的生产菌种等。 他们的主要工作包括以下几个方面： 制药产业是关系国计民生的重要产业， 1．根据不同微生物的营养需求，使用 随着人民群众日益增长的健康需求，我国已 配料罐、输送泵等设备或器皿配制适宜的培 成为全球药品消费增速最快的国家之一。作 养基； 为现代生物制药领域发展的生力军，发酵工 2．使用高压蒸汽灭菌锅、灭菌柜等，对 程制药工正在被越来越多的人熟知和尊重， 培养基、器皿和设备等进行消毒和灭菌； 他们也将在这一工作岗位上实现自己的人生 3．培养、制备、复壮、选育、鉴定和保 价值，为健康中国作出贡献。 藏生产菌种； 发酵工程制药工正在发酵生产车间工作 第2节 微生物的培养技术及应用 21第 3 节 发酵工程及其应用 从社会中来 青霉素是世界上第一个应用于临床的抗生素。早期科 学家只能从青霉菌中提取少量青霉素，它的价格贵如金。 随着高产菌种的选育、发酵技术的发展等，青霉素步入了 产业化生产的道路。如今，1瓶规格160万单位的青霉素注 射剂的价格只要1元左右。那么，在工业上，青霉素究竟 是怎样生产的呢？ 青霉素 本节聚焦 随着人们对发酵原理的认识，微生物纯培养技术的建 ● 什么是发酵工程？ 立，以及密闭式发酵罐的成功设计，人们能够在严格控制 ● 发酵工程的一般流程是什么？ 的环境条件下大规模生产发酵产品，发酵工程逐步形成。 ● 发酵工程在生产上有哪些重要 发酵工程与农业、食品工业、医药工业及其他工业生产有 的价值？ 着密切的联系。那么，发酵工程的基本环节是什么？应用 发酵工程能够生产哪些产品呢？ 发酵工程的基本环节 发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的 配制、灭菌，接种，发酵，产品的分离、提纯等方面（图1-9）。 选育菌种 扩大培养 某镇特产一种美酒，以下是 对该镇环境的描述：四面环山，地 势低洼，气候炎热，具有独特的微 性状优良的菌种可以从自然界中筛 工业发酵罐的体积一般 生物种群，因为与外界的空气对 选出来，也可以通过诱变育种或基 为几十立方米到几百立 流循环较缓慢，所以微生物种群 因工程育种获得。生产柠檬酸就需 方米，接入的菌种总体 要筛选产酸量高的黑曲霉。在啤酒 积需要几立方米到几十 较稳定。这对你理解发酵工程中 生产中，使用基因工程改造的啤酒 立方米。所以，在发酵 菌种选育的重要性有什么启示？ 酵母，可以加速发酵过程，缩短生 之前还需要对菌种进行 产周期。 扩大培养。 图1-9 发酵工程的基本环节和发酵罐示意图 22 第1章 发酵工程获得产品 电动机 排气管 pH计 如果发酵产品是微生物细胞本身， 培养物或营养 可在发酵结束之后，采用过滤、沉 物质的加入口 淀等方法将菌体分离和干燥，即 观察孔 可得到产品。如果产品是代谢物， 取样管 冷却水排出口 可根据产物的性质采取适当的提 取、分离和纯化措施来获得产品。 冷却夹层 分离、 发酵液 提纯产物 温度传感器 搅拌叶轮 和控制装置 这是发酵工程的中心环节。在发 生物传感器装置 酵过程中，要随时检测培养液中 冷却水进入口 的微生物数量、产物浓度等，以 了解发酵进程。还要及时添加必 需的营养组分，要严格控制温度、 空气入口 pH和溶解氧等发酵条件。环境 阀门 条件不仅会影响微生物的生长繁 殖，而且会影响微生物代谢物的 放料管 形成。例如，谷氨酸的发酵生产： 在中性和弱碱性条件下会积累谷 发酵罐内 发酵罐示意图 氨酸；在酸性条件下则容易形成 发酵 谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。 现代发酵工程使用的大型发酵罐 发酵工程中所用的菌种大多是单 在菌种确定之 均有计算机控制系统，能对发酵 一菌种。一旦有杂菌污染，可能 后，要选择原料 过程中的温度、pH、溶解氧、罐 导致产量大大下降。例如，在青 制备培养基。在 压、通气量、搅拌、泡沫和营养 霉素生产过程中如果污染了杂 生产实践中，培 等进行监测和控制；还可以进行 菌，某些杂菌会分泌青霉素酶将 养基的配方要经 反馈控制，使发酵全过程处于最 青霉素分解掉。因此，培养基和 过反复试验才能 佳状态。 发酵设备都必须经过严格的灭菌。 确定。 接种 灭菌 配制培养基 思考·讨论 发酵工程基本环节分析 结合图1-9，分析和讨论以下问题。 3．在产物分离和提纯方面，发酵工程与 1．微生物菌种资源丰富，选择发酵工程 传统发酵技术相比有哪些改进之处？ 用的菌种时需要考虑哪些因素？ 4．在进行发酵生产时，排出的气体和废 2．怎样对发酵条件进行调控以满足微生 弃培养液等能直接排放到外界环境中吗？为 物的生长需要？ 什么？ 第3节 发酵工程及其应用 23发酵工程的应用 发酵工程以其生产条件温和、原料来源丰富且价格低 廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理等特点， 在食品工业、医药工业和农牧业等许多领域得到了广泛的 应用，形成了规模庞大的发酵工业。 在食品工业上的应用 食品工业是微生物最早开发和应用的领域。一直以来， 与发酵有关的食品工业的产量和产值都居于发酵工业的首 位。在我们的日常生活中，利用发酵工程生产的食品以及 与食品有关的产品比比皆是，主要包括以下三个方面。 第一，生产传统的发酵产品。例如，以大豆为主要原料， 利用产生蛋白酶的霉菌（如黑曲霉），将原料中的蛋白质 水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制成的酱油 产品；以谷物或水果等为原料，利用酿酒酵母发酵生产的 各种酒类。发酵工程使这些产品的产量和质量明显提高。 思考·讨论 啤酒的工业化生产流程 我国是世界上啤酒的生产和消费大国。 都在主发酵阶段完成。主发酵结束后，发酵 啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成 液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下 的，其工业化生产流程如下图所示。其中发 储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄 酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。酵母 清、成熟的啤酒。发酵的温度和发酵的时间 菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成 随啤酒品种和口味要求的不同而有所差异。 糖化罐 大麦 水 1 发芽 2 焙烤 3 碾磨 4 糖化 大麦种子发芽，释放 加热杀死种子胚但不使 将干燥的麦芽碾磨 淀粉分解，形成糖浆。 淀粉酶。 淀粉酶失活。 成麦芽粉。 24 第1章 发酵工程第二，生产各种各样的食品添加剂。随着生活水平的 提高，人们对食品的需求越来越多样化，食品添加剂应运 而生，它不仅可以增加食品的营养，改善食品的口味、色 泽和品质，有时还可以延长食品的保存期。许多食品添加 剂都能通过发酵工程生产（表1-2）。例如，柠檬酸是一种 广泛应用的食品酸度调节剂（图1-10），它可以通过黑曲 霉的发酵制得；由谷氨酸棒状杆菌发酵可以得到谷氨酸， 谷氨酸经过一系列处理就能制成味精。 表1-2 常用的几类食品添加剂 添加剂类型 举例 酸度调节剂 L-苹果酸、柠檬酸、乳酸 图1-10 添加了柠檬酸的饮料 增味剂 5'-肌苷酸二钠、谷氨酸钠 着色剂 β-胡萝卜素、红曲黄色素 增稠剂 黄原胶、β-环状糊精、结冷胶 防腐剂 乳酸链球菌素、溶菌酶 讨论 不添加食品添加剂、不进行过滤和消毒处理 1. 与传统的手工发酵相比，在下面啤 等。有人认为饮用“精酿”啤酒比饮用“工业” 酒的发酵生产过程中，哪些工程手段使啤酒 啤酒更健康，你怎么看待这个问题？“精酿” 的产量和质量明显提高？ 啤酒是小规模酿造产品，发酵时间长、产量 2. 现在市面上流行一种“精酿”啤酒， 低和价格高，却依然有着市场需求，我们如 它的制作工艺与普通啤酒有所不同，如一般 何辩证地看待大规模生产与小规模制作？ 糖浆 啤酒花 冷却 过滤 装瓶 储存罐 装罐 5 蒸煮 6 发酵 7 消毒 8 终止 产生风味组分，终止酶的进 酵母菌将糖转化为 杀死啤酒中的大多数微 过滤、调节、分装啤酒进行出售。 一步作用，并对糖浆灭菌。 酒精和CO。 生物，延长它的保存期。 2 第3节 发酵工程及其应用 25第三，生产酶制剂。在食品工业中，我们还会经常用到 一些酶制剂，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶 请你回忆一下自己做过的生 物学实验，想一想曾经使用过哪 和脂肪酶等。目前，已有50多种酶制剂成功用于食品的直接 些酶制剂。 生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口 味、延长食品储存期和提高产品产量等方面。这些酶制剂除 少数由动植物生产外，绝大多数也是通过发酵工程生产的。 在医药工业上的应用 青霉素的发现和产业化生产推动了发酵工程在医药领 域的应用和发展。之后，发酵工程逐步扩展到了其他抗生 素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等的生产领域。 近些年来，基因工程、蛋白质工程等的广泛应用给发 知识链接 酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。人们可以采用基 有关基因工程和蛋白质工程 因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获 的内容，见本书第3章。 得具有某种药物生产能力的微生物；或者直接对菌种进行 改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。有些过去 主要靠从生物器官、组织、细胞或尿液中提取，因受到原 料限制无法推广使用的药物，就是通过这种方法得以大量 生产和使用的。例如，生长激素释放抑制激素能够抑制生 长激素的不适宜分泌，可用于治疗肢端肥大症。最初临床 上使用的这种激素是从羊脑中提取的，50万个羊脑才能提 取5 mg，远远不能满足需要。后来利用经过基因改造的微 生物进行发酵生产，从7.5 L培养液中就能得到5 mg的生长激 素释放抑制激素，这也使得其价格降为原来的几百分之一。 未来甚至还可能用微生物来生产过去只能从植物中分离提取 的紫杉醇、青蒿素前体等化合物。此外，科学家还利用基因 工程，将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物 细胞，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。例如，一种生 产乙型肝炎疫苗的方法就是将乙型肝炎病毒的抗原基因转入 酵母菌，再通过发酵生产（图1-11）。 在农牧业上的应用 图1-11 重组乙型肝炎疫苗 从自然界选育出优良菌株，再通过发酵工程大规模发 酵生产制成的活菌或其代谢物产品等正应用于现代农牧业 的很多方面。 26 第1章 发酵工程第一，生产微生物肥料。微生物肥料利用了微生物在 代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥 力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、 固氮菌肥等（图1-12）。有的微生物肥料还可以抑制土壤 中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。 第二，生产微生物农药。与传统的化学农药不同，微生物 农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。例如，苏云金 杆菌可以用来防治80多种农林虫害；利用白僵菌可以防治玉 米螟、松毛虫等虫害；一种放线菌产生的抗生素—井冈霉素 图1-12 微生物肥料 可以用于防治水稻枯纹病。微生物农药作为生物防治的重要手 段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。 第三，生产微生物饲料。研究表明，微生物含有丰富 异想天开 的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60%〜80%， 而且细菌生长繁殖速度很快。因此，许多国家以淀粉或纤 单 细胞蛋白不仅含有丰 维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得 富的蛋白质，还含有糖类、脂质 了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白。用酵母菌等生产的 和维生素等物质，以后我老牛是不 单细胞蛋白可以作为食品添加剂；用单细胞蛋白制成的微 是吃点微生物菌体就可以健康 地活下去呢？ 生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提 高。另外，在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品 质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。 在其他方面的应用 随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发 酵生产酒精、乙烯等能源物质已取得成功。像这样的发酵 原料的改变推动着发酵工业迅速发展，对解决资源短缺与 环境污染问题具有重要意义。 自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在 各种极端恶劣的环境（如高温、高压、高盐和低温等环境） 中正常生活，对它们的研究已成为国际热点，其中一些极 端微生物已应用于生产实践。例如，嗜热菌、嗜盐菌可以 用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。 发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决 粮食、环境、健康和能源等方面的重大问题上，作出了越来越 大的贡献。截至2015年，我国生物发酵产业年总产值近2 900 亿元，产品总量位居世界第一。我国是名副其实的发酵大国。 第3节 发酵工程及其应用 27到社会中去 1．列出你昨天一天的食谱，看看哪些食品是直接由微生物发酵生产的，哪些食品中添 加了经发酵生产的食品添加剂。 2．当地是否有发酵生产企业？如果有，请进行以下调查活动。 （1）咨询当地政府管理部门，了解以下信息：这些企业的年产值是多少？占当地（市/ 县）地区生产总值的比例是多少？这些企业提供了多少就业岗位？ （2）你的家人和朋友是否有正在从事发酵工业生产的？如果有，请向他们咨询以下问 题：他们所在公司目前生产哪些发酵产品？经济效益如何？该行业目前遇到的主要困难是什 么？要解决这些困难，对发酵技术提出了哪些新要求？ 练习与应用 一、概念检测 合成两个产物。如何改造青霉素生产菌使其只生 与传统发酵技术相比，发酵工程的产品种类 产青霉素，或者只生产头孢霉素呢？ 更加丰富，产量和质量明显提高。判断下列相关 2．通过微生物发酵，可以将粮食（如玉米、 表述是否正确。 小麦等）及各种植物纤维加工成燃料乙醇；将燃料 （1）发酵工程与传统发酵技术最大的区别就 乙醇和普通汽油按一定比例混配，就形成了目前在 是前者可以利用微生物来进行发酵。 （ ） 我国多地广泛使用的乙醇汽油。乙醇汽油的环保性 （2）发酵工程的产品主要包括微生物的代谢 令人称道。调查显示，使用乙醇汽油与使用普通汽 物、酶及菌体本身。 （ ） 油相比，排放到空气中的NO、CO等均有不同程 2 （3）在发酵工程的发酵环节中，发酵条件变 度下降。有人认为燃料乙醇“可再生”；但也有人 化不仅会影响微生物的生长繁殖，也会影响微生 认为，生产燃料乙醇需要消耗大量粮食，会增加粮 物的代谢途径。 （ ） 食短缺的风险。请你尝试通过查阅资料，评估这一 （4）通过发酵工程可以从微生物细胞中提取 风险，并说明在生产时应如何规避这一风险。 单细胞蛋白。 （ ） 糖类 二、拓展应用 发酵 作物 1．在青霉素的发酵生产过程中，人们遇到 了两个问题。请你运用所学知识或查阅资料，并 发挥想象力，提出解决这些问题的思路。 乙醇 （1）青霉素发酵是高耗氧过程，如何能够 自然界 保证在发酵过程中给微生物持续高效地供氧呢？ 光合 （提示：血红蛋白具有携带O 的能力） 作用 2 （2）在发酵过程中，总有头孢霉素产生。人 们通过对青霉素生产菌代谢途径的研究发现，在 CO 2 青霉素与头孢霉素的合成过程中，它们有一个共 同的前体，这个前体经过两种不同酶的作用分别 汽车 28 第1章 发酵工程本章小结 理解概念 ● 发酵是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过 微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。人们可以通过传 统发酵技术或发酵工程来进行发酵生产。传统发酵以混合菌种的 固体发酵和半固体发酵为主。发酵工程一般包括菌种的选育和培 养、产物的分离和提纯等环节。 ● 获得微生物纯培养物是发酵工程的重要基础，它通过纯培 养来实现。进行纯培养时，人们需要按照微生物对营养物质的不 同需求配制培养基；还需要防止杂菌污染，无菌技术围绕这一点 展开，主要包括消毒和灭菌。 ● 获得微生物纯培养物的常用方法有平板划线法和稀释涂布 平板法。有时，还需要借助选择培养基才能有目的地分离某种微 生物。 ● 发酵工程在农业、食品工业、医药工业及其他工业生产上 有重要的应用价值。 发展素养 通过本章的学习，应在以下几方面得到发展。 ● 尝试运用传统发酵技术制作发酵食品。 ● 认同我国有历史悠久的传统发酵技术，它促进了丰富多彩的 饮食文化的形成。 ● 认同发酵工程是在传统发酵技术的基础上发展起来的，它 实现了发酵食品、药物等的工业化生产，极大地改善了人们的 生活。 29复习与提高 1．某化工厂为了处理排出污水中的一种有害 学过的有关微生物培养的知识对此冰激凌进行检测。 的、难以降解的有机化合物A，其研究团队用化合物 经过一番资料查阅，他们提出了如下实验设计思路。 A、磷酸盐、镁盐和微量元素等配制了培养基，成功 立即去卖冰激凌的小店再买一个同样品牌的 地筛选出能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。 同种冰激凌；配制伊红—亚甲蓝琼脂培养基（该 实验的主要步骤如下图所示，请分析回答问题。 培养基可用来鉴别大肠杆菌，生长在此培养基上 的大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽）、灭 污水池中污泥样品 初选 菌、倒平板；取10 mL刚融化的冰激凌作为原液， 候选菌 然后进行梯度稀释，稀释倍数为1×10〜1×105； 接种 取每个浓度的冰激凌液各0.1 mL，用涂布平板法 进行接种，每个浓度涂3个平板，一共培养18个 重 复 平板；在适宜温度下培养48 h，统计菌落数目。 多 次 （1）请你从下面几个角度对这三位同学的思 ， 直 路进行评议。 至 振荡培养若干天后， 获 1 他们只打算对一个冰激凌进行检测，理 得 测定各瓶中化合物A的含量 目 由是：两个人吃过冰激凌后，都拉肚子了，所以 的 选择 接种 菌 再检测一个就足以说明问题。你同意这样的观点 接种 吗？为什么？ 接种 2 有没有必要对冰激凌原液进行梯度稀释？ 固体培养基 为什么？【提示：我国卫生部门规定了饮用水标 准，1 mL自来水检出的菌落总数不可以超过100个 （37 ℃培养48 h），不得检出总大肠菌群】 （1）在培养基中加入化合物A的目的是 3 他们认为，在用该方法统计菌落数目时不 ，这种培养基属于 培养基。 需要设计对照组，所以只准备培养18个平板。你 （2）培养若干天后，应选择培养瓶中化合物 认为在这项检测中是否需要对照组？为什么？ A含量 的培养液，接入新的培养液中连 （2）下图所示为4种菌落分布图，一般不能 续培养，使目的菌的数量 。 由涂布平板法得到的是 。 （3）若要研究目的菌的生长规律，可挑取单个 菌落进行液体培养，再采用 方法进行计 数。请你预测目的菌的种群数量会发生怎样的变化。 （4）将目的菌用于环境保护实践时，还有哪 A B C D 些问题需要解决？ （3）在完善实验设计思路后，三位同学进行 （5）有人提出，可以通过改造细菌的基因来 了实验。培养结果显示，除了深紫色菌落，还有 获得能够降解化合物A的细菌，请分析这种方法 其他菌落存在，这说明了什么？如果以菌落数代 是否可行。 表样品中的大肠杆菌数量，则统计结果比实际值 2．某个高温日，某校三位高中学生相约去吃 是偏大还是偏小？为什么？ 冰激凌，之后两人都出现腹泻现象，于是他们怀疑 （4）如果实验结果显示，检测的冰激凌中大 冰激凌中的大肠杆菌含量超标。老师建议他们利用 肠杆菌含量超标了。接下来他们应该做什么？ 30 第1章 发酵工程第 2 章 细胞工程 照片中两只可爱的小猴，分别叫“中中”和“华华”，它 们诞生于2017年，一出生就轰动了全世界，这是我国科学家 的研究成果。你知道它们是如何培育出来的吗？在这之前， 科学家培育了胚胎细胞克隆猴，你知道两者有什么不同吗？ 其实，自1996年首个体细胞克隆动物多莉羊（Dolly）诞生以来， 人类已经成功克隆了马、牛和猪等大型家畜，但为什么体细 胞克隆猴的诞生能轰动世界呢？ 上面这些成果的取得都有赖于细胞工程的发展，培育克 隆动物只是细胞工程的一个方面。近年来，细胞工程领域成 果迭出，方兴未艾。 细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发 育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞 或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组 织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。 第1节 传统发酵技术的应用 31科 技科探技索探之索路之 路 细胞细工胞程工的程发的展发历展程历程 19741年97，4年土，壤土农壤杆农菌杆的菌Ti的质T粒i质被粒发被现发。现之。之 后，后该，质该粒质应粒用应于用植于物植分物子分生子物生学物领学域领，域， 促进促了进植了物植细物胞细工胞程工与程分与子分生子物生学物技学术技的术的 紧密紧结密合结。合。 1971年197，1年卡，尔卡森尔（森P. S（. PC. aSrl. sCona，rl s1o9n4，4 —1924041—7）2017） 诱导诱烟导草烟种草间种原间生原质生体质融体合融，合获，得获了得第了一第一 株体株细体胞细种胞间种杂间种杂植种株植。株。 19641年96，4年古，哈（古S哈. （GuSh. aG，u1h9a3，81—93280—07）20等07）在等在 培养培毛养曼毛陀曼罗陀的罗花的药花时药，首时，次首得次到得了到由了花由花 药中药的中花的粉花粒粉发粒育发而育来而的来胚的。胚。 19601年96，0年科，金科（金E. （C.E C. oCc.k Cinogc，kin1g9，31—19）31用—）用 真菌真的菌纤的维纤素维酶素分酶解分番解茄番根茄的根细的胞细壁胞，壁成，成 功获功得获了得原了生原质生体质。体。 19581年95，8年斯，图斯尔图德尔（德F. （C. FS. tCew. Sartdew， a1r9d0，4 1—90 4— 1993）19等93）发等现发胡现萝胡卜萝的卜体的细体胞细可胞以可分以化分为化为 胚，为胚细，胞为全细能胞性全理能论性提理供论了提强供有了力强的有支力持的。支持。 动物动细物胞细工胞程工（程含（胚含胎胚工胎程工）程） 19021年90，2年哈，伯哈兰伯特兰（特G. （HaGb.e Hrlaanbdetr，lan1d8t5，4—1854— 1945）194提5）出提了出细了胞细全胞能全性能的性理的论理，论但，相但关相关 18901年89，0年希，普希（普W.（ HWea.p He，ea1p8e5，5—1815952—9）1929） 的实的验实尝验试尝没试有没成有功成。功。 将安将哥安拉哥兔拉的兔胚的胎胚移胎入移比入利比时利兔时的兔输的输 卵管卵内管，内得，到得了到两了只两安只哥安拉哥兔拉，兔这，是这是 世界世上界胚上胎胚移胎植移成植功成的功首的例首。例。 植物植细物胞细工胞程工程 32 第2章 细胞工程20172年01,7我年国,我科国学科家学首家次首培次育培了育体了细体胞细胞 克隆克猴隆。猴。 20142年01，4年世，界世上界第上一第个一用个单用细单胞细基胞因基组因组 测序测进序行进遗行传遗病传筛病查筛的查试的管试婴管儿婴在儿我在国我国 诞生诞。生。 20062年00，6年山，中山伸中弥（伸S弥. Y（aSm. aYnaamkaa，n1a9k6a，2—19）62—） 等获等得获了得诱了导诱多导能多干能细干胞细。胞我。国我科国学科学 家用家这用种这细种胞细培胞育培出育了小出鼠了小。鼠。 19811年98，1年埃，文埃斯文（M斯.（ J. MEv. aJn. sE，va1n9s4，1—19）41—） 等成等功成分功离分和离培和养培了养小了鼠小的鼠胚的胎胚干胎细干胞细。胞。 19961年99，6年世，界世上界第上一第只一体只细体胞细克胞隆克羊隆羊 多莉多在莉英在国英诞国生诞。生随。后随多后种多克种隆克动隆物动物 相继相问继世问。世。 19781年97，8年小，鼠小的鼠桑的葚桑胚葚被胚成被功成分功割分。割。 次年次，年科，学科家学分家割分绵割羊绵胚羊胎胚获胎得获了得同了同 卵羔卵羊羔。羊。 19751年97，5年米，尔米斯尔坦（斯C坦. （MCil.s tMeiinls，t1e9in2，71—927— 2002）200和2）科和勒科（G勒. （KGöh. lKerö，h1l9er4，61—94169—95）1995） 等创等立创了立单了克单隆克抗隆体抗技体术技。术。 19581年95，8年格，登格（登J. G（uJr.d Gonu，rdo1n9，331—93）3—用）用 19591年95，9年试，管试家管兔家诞兔生诞。生之。后之，后多，种多种 非洲非爪洲蟾爪进蟾行进体行细体胞细核胞移核植移实植验实，验成，功成功 试管试动管物动相物继相出继生出。生。 培育培出育性出成性熟成个熟体个。体同。一同时一期时，期我，国我科国科 学家学童家第童周第（周19（021—90129—791）97等9）开等展开了展了 19071年90，7年哈，里哈森里（森R. （G.R H. aGrr. iHsoanr，ris1o8n7，0—1870— 鱼类鱼细类胞细核胞移核植移工植作工。作。 1959）195用9）一用滴一淋滴巴淋液巴成液功成培功养培了养蝌了蚪蝌的蚪的 神经神元经，元首，创首了创动了物动组物织组体织外体培外养培法养。法。 19511年95，1年张，明张觉明（觉19（081—90189—911）99等1）发等发 现了现哺了乳哺动乳物动精物子精的子获的能获现能象现。象。 科技探索之路 33第 1 节 植物细胞工程 从社会中来 “其茅葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨 夫开也，凝情瀼露，万态千妍，薰风自来，四坐芬郁，岂非真 兰室乎！岂非有国香乎！”这是我国历史上第一部兰谱— 《金漳兰谱》的跋文中对兰花的一段描述。从古至今，我国人民 都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢养兰花。但是， 兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株 繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然 繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快 速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？ 国画作品—兰 一 植物细胞工程的基本技术 本节聚焦 ● 植物细胞工程的理论基础是 人工栽培的植物，无论是绚丽多姿的花草，还是碧绿 什么？ 参天的大树，大多都是通过播种或扦插实现繁殖的。其实 ● 什么是植物组织培养技术和植 在一定条件下，利用它们的一片花瓣、一粒花粉，甚至一 物体细胞杂交技术？ 个细胞，同样可以繁殖出新的植株。这是为什么呢？我们 ● 怎样进行菊花的组织培养？ 知道，细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或 分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。但是， 在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全 能性，比如，芽原基的细胞只能发育为芽，叶原基的细胞 只能发育为叶。这是因为在特定的时间和空间条件下，细 胞中的基因会选择性地表达。 植物组织培养技术 高度分化的植物组织的细胞，如叶片和花瓣的细胞还 能不能在适宜的条件下表现出全能性呢？科学家通过长期探 34 第2章 细胞工程索，得出了肯定的答案。那么，科学家是如何做到的呢？这 离不开植物细胞工程中的基本技术—植物组织培养。 植物组织培养（plant tissue culture）是指将离体的植 物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给 予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术（图2-1）。 这些离体培养的植物器官、组织或细胞被称为外植体。下 面我们通过“菊花的组织培养”实验来了解这一技术。 移栽成活 接种外植体 诱导生芽 诱导生根 诱导愈伤组织 图2-1 植物组织培养流程图 探究·实践 菊花的组织培养 植物细胞一般具有全能性。在一定的激 2．了解生长素和细胞分裂素的浓度、 素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞 用量的比例对菊花愈伤组织形成和分化的 可以经过脱分化，即失去其特有的结构和功 影响。 能，转变成未分化的细胞，进而形成不定形 3．尝试进行植物组织培养。 的薄壁组织团块，这称为愈伤组织。愈伤组 材料用具 织能重新分化成芽、根等器官，该过程称为 1．材料：幼嫩的菊花茎段、培养基、 再分化。植物激素中生长素和细胞分裂素是 体积分数为70%的酒精、质量分数为5%左 启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素， 右的次氯酸钠溶液和无菌水等。各种培养基 它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发 的配制参见本书附录1。 育方向。将愈伤组织接种到含有特定激素的 2．用具： 50 mL锥形瓶（或植物组织 培养基上，就可以诱导其再分化成胚状体， 培养瓶）、烧杯、酒精灯、超净工作台（或 长出芽和根，进而发育成完整的植株。 接种箱）、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、封口 目的要求 膜、滤纸、标签、消毒用酒精棉球、培养 1．了解植物组织培养的基本原理。 皿、解剖刀和镊子等。 第1节 植物细胞工程 35方法步骤 1．用酒精擦拭双手和超净工 2．将消过毒的外植体置 3．在酒精灯火焰旁， 作台台面。将流水充分冲洗后的外植 于无菌的培养皿中，用无菌滤 将外植体的1/3〜1/2插 体（幼嫩的茎段）用酒精消毒30 s， 纸吸去表面的水分。用解剖刀 入诱导愈伤组织的培养基 然后立即用无菌水清洗2〜3次； 将外植体切成0.5〜1 cm长的 中。用封口膜或瓶盖封盖 再用次氯酸钠溶液处理30 min后， 小段。 瓶口，并在培养瓶上做好 立即用无菌水清洗2〜3次。 标记。 注意 结果分析与评价 1．实验中使用的培养基和所有的器械 1．接种3〜4 d后，检查外植体的生长 都要灭菌。接种操作必须在酒精灯火焰旁进 情况，统计有多少外植体被污染，有多少能 行，并且每次使用后的器械都要灭菌。 正常生长，并分析它们被污染的原因。 2．接种时注意外植体的方向，不要倒插。 2．你培养出愈伤组织了吗？如果培养 3．诱导愈伤组织期间一般不需要光照， 出来了，从刚接种的外植体到长出愈伤组织 在后续的培养过程中，每日需要给予适当时 经历了多少天？这些愈伤组织进一步分化出 间和强度的光照。 芽和根了吗？ 植物体细胞杂交技术 20世纪60年代，科学家尝试将番茄和马铃薯杂交，希 望培育出一种地上结番茄、地下长马铃薯的“超级作物” （图2-2）。但是，两种生物之间存在着天然的生殖隔离， 用传统的有性杂交的方法很难得到杂种后代。经过长期实 验，科学家采用体细胞杂交的方法得到了“番茄—马铃薯” 杂种植株，但这种植株并没有在地上结番茄、地下长马铃 薯。那么，科学家是怎样得到杂种植株的呢？ 图2-2 番茄—马铃薯（想象图） 我们知道，植物细胞外面有一层细胞壁，这层细胞壁 36 第2章 细胞工程4．将接种了外植体 5．培养15〜20 d后，将 6．移栽前先打开封口膜或瓶 的锥形瓶或植物组织培养 生长良好的愈伤组织转接到 盖，让试管苗在培养箱内生长几日。 瓶置于18〜22 ℃的培养 诱导生芽的培养基上。长出芽 用流水清洗掉根部的培养基后，将 箱中培养。在培养过程中， 后，再将其转接到诱导生根的 幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩 定期观察和记录愈伤组织 培养基上，进一步诱导形成试 等环境中，待其长壮后再移栽入土。 的生长情况。 管苗。 每天观察并记录幼苗的生长情况， 适时浇水、施肥，直至开花。 3．观察外植体的分化情况，填好结果 物，尝试进行组织培养。 记录表，并及时分析结果。 2．如果你对植物激素的作用感兴趣， 4．你培育的幼苗移栽到露地后，能够 可以在查阅资料的基础上，探究生长素与细 正常生长吗？ 胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影 进一步探究 响。例如，你可以设计对照实验，分别探究 1．一般来说，容易进行无性繁殖的植 不加任何植物激素，生长素用量与细胞分裂 物也容易进行组织培养，如芦荟、秋海棠 素用量的比值为1、比值大于1以及比值小于 和月季等，你可以从中挑选一种你喜欢的植 1时，对实验结果的影响。 阻碍着细胞间的杂交。因此，在进行体细胞杂交之前，必 须先利用纤维素酶和果胶酶去除这层细胞壁，获得原生质 体（图2-3）。杂交过程中的一个关键环节，是原生质体间 的融合，这必须要借助一定的技术手段才能实现。人工诱 导原生质体融合的方法基本可以分为两大类—物理法和 化学法。物理法包括电融合法、离心法等；化学法包括聚 图2-3 光学显微镜下的烟草叶 乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+—高pH融合法等。融合后 肉细胞原生质体（放大 得到的杂种细胞再经过诱导可形成愈伤组织，并可进一步 约200倍） 第1节 植物细胞工程 37A细胞 A原生质体 正在融合的原生质体 B细胞 B原生质体 愈伤组织 杂种植株 移栽后的植株 再生出细胞壁 图2-4 植物体细胞杂交技术流程图 发育成完整的杂种植株（图2-4）。 由此可见，植物体细胞杂交（plant somatic hybridiza- tion）是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成 杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。利用这 项技术，科学家培育出了白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃 麦草等杂种植株。我国科学家还在木本植物的体细胞杂交 方面取得了不少成果，培育出了多种柑橘属不同种间的杂 种植株。植物体细胞杂交技术在打破生殖隔离，实现远缘 杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。 练习与应用 一、概念检测 A．进行a处理时能用胰蛋白酶 1．下图是利用甲、乙两种植物的各自优势， B．b是诱导融合后得到的杂种细胞 通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植 C．c是培养后得到的具有耐盐性状的幼芽 株的实验流程图。下列相关叙述错误的是 （ ） D．进行d选择时要将植株种在高盐环境中 2．科学家在制备原生质体时，有时使用蜗 甲植物细胞 a 甲原生质体 PEG 牛消化道提取液来降解植物细胞的细胞壁。据此 b 乙植物细胞 处理 乙原生质体 诱导 分析，蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分？ 细胞分裂 二、拓展应用 “番茄—马铃薯”杂种植株没有如科学家所 d 用钠盐浓度为0.6%的 目的植株 c 愈伤组织 想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是 选择 固体培养基培养 为什么？ 38 第2章 细胞工程二 植物细胞工程的应用 植物细胞工程在农业、医药工业等方面有着广泛的应 本节聚焦 用，并且取得了显著的社会效益和经济效益。 ● 植物细胞工程在生产实践中有哪 些应用？ ● 植物细胞工程应用于生产实践的 植物繁殖的新途径 主要优势是什么？ 快速繁殖 20世纪60年代，荷兰科学家成功地利用组织培养技术来 培育兰花。目前，荷兰的兰花生产已经发展成为举世闻名的 兰花产业，每年为荷兰创造了巨额的外汇收入。在我国，组 织培养技术也已经广泛应用于兰花种苗的规模化繁殖，这使 得名贵兰花的价格大幅下降，普通百姓也能购买和观赏。 以上这种用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术， 被人们形象地称为植物的快速繁殖技术，也叫作微型繁殖 相关信息 技术。它不仅可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖，还 铁皮石斛，兰科石斛属植物， 可以保持优良品种的遗传特性。一些优良的观赏植物、经 茎直立、圆柱形，花期3—6月， 济林木、无性繁殖作物和濒危植物等都实现了利用快速繁 生于海拔1 600 m左右的山地半 殖技术来提供苗木。甘蔗、桉树和铁皮石斛等试管苗的生 阴湿的岩石上。铁皮石斛富含某 产，已形成一定规模（图2-5）。 些糖类和生物碱，可以用来提取 药物。 图2-5 铁皮石斛的产业化育苗 第1节 植物细胞工程 39作物脱毒 马铃薯、草莓和香蕉等通常是用无性繁殖的方式进行繁 殖的，它们感染的病毒很容易传给后代。病毒在作物体内逐 年积累，就会导致作物产量降低，品质变差。早在20世纪 50年代，科学家就发现植物顶端分生区附近（如茎尖）的 病毒极少，甚至无病毒。因此，切取一定大小的茎尖进行组 织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。 目前采用茎尖组织培养技术脱去病毒，已在马铃薯、 草莓、大蒜、甘蔗、菠萝和香蕉等许多作物上获得成功。 人们用组织培养技术培育出的脱毒马铃薯，要比未脱毒的 图2-6 脱毒马铃薯田和被病 马铃薯增产50%以上（图2-6）；脱毒草莓的产量和品质也 毒感染的未脱毒的马 明显优于没有脱毒的草莓。 铃薯叶片（左上） 作物新品种的培育 单倍体育种 常规选育出一个可以稳定遗传的作物优良品种，一般 要经过5〜6年的连续筛选。而单倍体育种可以先通过花药 （或花粉）培养获得单倍体植株，然后经过诱导染色体加 倍，当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株， 这极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力 （图2-7）。单倍体育种已成为作物育种的一条有效途径。 此外，由于大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体， 染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现，因此它也 花药 花粉 是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。在单 倍体育种领域，我国科学家作出了突出贡献，早在1974年 离体培养 就成功地培育出世界上第一个单倍体作物新品种—单育 1号烟草；后来，把单倍体育种与常规育种结合起来，育 人工诱导 染色体加倍 选择 单倍体 纯合二倍体 优良品种 图2-7 玉米单倍体育种流程示意图 40 第2章 细胞工程成了水稻、玉米、油菜、甘蓝和甜椒等作物的新品种。 突变体的利用 在植物的组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断 增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素（如射 线、化学物质等）的影响而产生突变。从产生突变的个体中 可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。 20世纪70年代以来，世界各国的科学家用这种方法已经 筛选到抗病、抗盐、高产以及蛋白质含量高的突变体，有些 品种已经用于生产，如抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的烟草等。 细胞产物的工厂化生产 相关信息 植物代谢会产生一些一般认为不是植物基本的生命活动 初生代谢是生物生长和生存 所必需的产物—次生代谢物。次生代谢物是一类小分子有机 所必需的代谢活动，因此在整个 化合物（如酚类、萜类和含氮化合物等），在植物抗病、抗虫 生命过程中它一直进行着。初生 等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。 代谢物有糖类、脂质、蛋白质和 由于植物细胞的次生代谢物含量很低，从植物组织提 核酸等。次生代谢不是生物生长 所必需的，一般在特定的组织或 取会大量破坏植物资源，有些产物又不能或难以通过化学合 器官中，并在一定的环境和时间 成途径得到，因此人们期望利用植物细胞培养来获得目标产 条件下才进行。 物，这个过程就是细胞产物的工厂化生产。植物细胞培养是 指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖 的技术（图2-8）。它不占用耕地，几乎不受季节、天气等 的限制，因此对于社会、经济、环境保护具有重要意义。 紫草宁是从紫草细胞中提取的一种药物和色素，具有 抗菌、消炎和抗肿瘤等活性。20世纪80年代，利用植物细 胞培养生产的紫草宁投入市场，成为世界上首例药用植物细 胞工程产品。紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种次生 代谢物，具有高抗癌活性，现在已被广泛用于乳腺癌等癌症 的治疗。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中 提取，但野生红豆杉是濒危植物，这种方法不利于对它们 的保护。我国科学家经过多年研究，筛选出了高产紫杉醇 的细胞。目前，我国在人参、三七等植物细胞的大规模培 养领域也取得了很大的进展。以人参为例，我国科学家早 图2-8 一种用于植物细胞培养 在1963年就成功地培育了人参的组织；后来又实现了利用 的反应器 人参细胞培养来生产人参中重要的活性成分——人参皂苷。 第1节 植物细胞工程 41到社会中去 市场上有一种叫作“手指植物”的工艺品受到很多人的欢迎。这些 “手指植物”通常培育在装有彩色固体培养基的小玻璃瓶中，只要保证 充足的光照和适宜的温度，不需要额外补充水分或营养 物质，它们就能在玻璃瓶中生长三四个月之久。学习 了本节课之后，你也可以尝试制作“手指植 物”。如果有商店正在出售这种植物，你 还可以做个市场调查，了解它们的销售 情况和经济效益，分析它们为什么受 欢迎，并写出调查报告。 练习与应用 一、概念检测 呢？请你提出相关实验的设计思路。 1．运用植物细胞工程技术可以培育单倍体 2．甜叶菊是一种菊科植物，植株中所含甜 植株和进行细胞产物的工厂化生产。判断下列相 菊糖的甜度是蔗糖的300倍左右，而它的热量却 关表述是否正确。 很低，所以它逐渐成为一些用糖行业欢迎的新糖 （1）用花药培养得到单倍体植株需要用到植 源。甜叶菊的种子小，发芽率低，种子繁殖遗传 物组织培养技术。 （ ） 性状不稳定；而扦插植株的根系弱，且需要原始 （2）细胞产物的工厂化生产主要是利用促进 材料多，这些都会限制甜叶菊的生产。假如你是 细胞生长的培养条件，提高了单个细胞中次生代 某甜叶菊生产公司的项目负责人，该公司当前运 谢物的含量。 （ ） 行状况良好，但一直未能解决种子发芽率低的问 2．生产中培育香蕉脱毒苗常用的方法是（ ） 题。为了提高公司的甜叶菊繁育效率，你应该如 A．人工诱导基因突变 何作出决策，并请说出理由。 B．选择优良品种进行杂交 C．进行远缘植物体细胞杂交 D．取茎尖分生组织进行组织培养 二、拓展应用 1．紫色非甜玉米（基因型为AASuSu）和 白色甜玉米（基因型为aasusu）杂交（Su和su代 表一对等位基因），得到的F（AaSusu）再进行 1 自交，F 会有紫色甜玉米的表型产生。如果运用 2 常规育种方法，应该如何筛选出纯合的紫色甜 玉米？如果利用花药培养的技术，又应该怎样做 甜叶菊 42 第2章 细胞工程第 2 节 动物细胞工程 从社会中来 在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人 的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健 康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免 疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能 通过细胞培养构建的人造皮肤 不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？ 动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细 本节聚焦 胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养（animal ● 动物细胞培养需要哪些基本 条件？ cell culture）是动物细胞工程的基础。 ● 动物细胞培养的基本操作过程 是什么？ 一 动物细胞培养 ● 怎样客观分析干细胞在临床上 的应用所产生的效益与风险？ 人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产等，都 离不开动物细胞培养。动物细胞培养是指从动物体中取出 相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条 件下，让这些细胞生长和增殖的技术。那么，动物细胞 培养需要哪些必要的条件？培养的过程又是怎样的呢？ 动物细胞培养的条件 我们知道，动物体内的细胞之所以能够维持正常的 生命活动，有些细胞还能不断增殖，是因为机体给这些 细胞提供了适宜的条件，包括充足的营养、稳定的内环 境等。在体外培养动物细胞，也需要满足类似的条件。 一般来说，动物细胞培养需要满足以下条件（图2-9）。 ● 无菌、无毒的环境 糖类、氨基酸、无机 动物细胞培养 营养条件 其他条件 ● 适宜的温度、pH和渗透压 盐、维生素…… 所需的基本条件 ● 适宜的气体环境 图2-9 动物细胞培养需要满足的条件 第2节 动物细胞工程 43营养 细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需 要的各种营养物质。将细胞所需的营养物质按种类和所需 量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对 细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成 培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。培养动物 细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。 无菌、无毒的环境 在体外培养细胞时，必须保证环境 是无菌、无毒的，即需要对培养液和所有培养用具进行灭菌 处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换， 以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。 温度、pH和渗透压 维持细胞生存必须有适宜的温 度。哺乳动物细胞培养的温度多以（36.5±0.5） ℃为宜。 多数动物细胞生存的适宜pH为7.2〜7.4。此外，渗透压也 是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。 气体环境 动物细胞培养所需气体主要有O 和CO。 2 2 O 是细胞代谢所必需的，CO 的主要作用是维持培养液的 2 2 pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶（图 2-10），并将它们置于含有95%空气和5%CO 的混合气体的 图2-10 培养皿（上）和 2 培养瓶（下） CO 培养箱中进行培养。 2 动物细胞培养的过程 在从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起， 彼此限制了生长和增殖。因此，在进行细胞培养时，首先要 进行动物细胞培养时常用胰 对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰 蛋白酶分散细胞，这说明细胞间 蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细 的物质主要是什么成分？用胃蛋 胞。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放 白酶行吗？ 入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。体外培养的动 物细胞可以分为两大类：一类细胞能够悬浮在培养液中生长 增殖；另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大 多数细胞属于这种类型（图2-11），这类细胞往往贴附在培 养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。悬浮培养的细胞会 因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏 图2-11 单层贴壁的猪输卵管 等因素而分裂受阻。贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素 上皮细胞 的影响外，还会发生接触抑制现象，即当贴壁细胞分裂生长 44 第2章 细胞工程到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。这时就需要 对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。人们通常将分瓶之 前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培 养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。在进行传代培养时， 悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰 蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。 之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养（图2-12）。 取动物组织 放入CO 2 培养箱中培养 转入培养液中进行 制成细胞悬液 原代培养 用机械的方法，或用 胰蛋白酶、胶原蛋白 酶等处理的方法，将 组织分散成单个细胞 放入CO 2 传代培养 培养箱中培养 图2-12 动物细胞培养过程示意图 思考·讨论 有关动物细胞培养的问题 1．幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比 2．动物细胞培养与植物组织培养有什么 较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比 相同和不同之处？ 较，哪些细胞更易于培养？为什么？ 第2节 动物细胞工程 45干细胞培养及其应用 干细胞（stem cell）的培养成功是动物细胞培养领域重大 的成就之一，干细胞的应用前景吸引着众多科学家投入到相 关研究中。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细 胞。干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器 官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。 胚胎干细胞（embryonic stem cell，简称ES细胞）存在 于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的 细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能 图2-13 电镜下的胚胎干细胞 （图2-13）。自1981年科学家首次分离得到小鼠的ES细胞后， （照片经后期人工上色 目前科学家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明 处理，放大约1 500倍） 了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞 等细胞。成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨 髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精 原干细胞等。一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能 分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。 造血干细胞是发现最早、研究最多、应用也最为成熟的一类 成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。 有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官 的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应 用。例如，将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人 的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗 或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重 要手段；神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾 病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）方面有重要的应用价值。 相关信息 胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因 科学家已尝试采用多种方 而限制了它在医学上的应用。2006年，科学家通过体外诱 法来制备iPS细胞，包括借助载 导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将 体将特定基因导入细胞中，直接 它称为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，简称 将特定蛋白导入细胞中或者用小 iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。现 分子化合物等来诱导形成iPS细 在，用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的 胞。iPS细胞最初是由成纤维细 研究也取得了新进展。因为诱导过程无须破坏胚胎，而 胞转化而来的，后来发现已分化 的T细胞、B细胞等也能被诱导 且iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病 为iPS细胞。 人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以科学家 普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞（图2-14）。 46 第2章 细胞工程转入相关因子 细胞发生转化 取成纤维细胞等 病人 神经元 iPS细胞 血细胞 胰岛细胞 移植 分化 肠上皮细胞 肝细胞 心肌细胞 图2-14 iPS细胞用于治疗人类疾病示意图 干细胞的研究正在如火如荼地开展。虽然将干细胞用于 临床治疗还面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险，但 是我们相信，随着理论和技术的不断完善，干细胞将在再生 医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。 练习与应用 一、概念检测 D．由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药 1．判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。 的测试中发挥重要作用 （1）培养环境中需要O ，不需要CO 。 （ ） 2 2 （2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 （ ） 二、拓展应用 （3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机 现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请 盐、维生素和动物血清。 （ ） 你从以下两个方面来查阅资料进行思考。 （4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理， （1）由于诱导产生iPS细胞、促使其分化都 分瓶后才能继续增殖。 （ ） 需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗 2．干细胞有着广泛的应用前景。下列相关 只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病 叙述错误的是 （ ） 发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞 A．干细胞是从胚胎中分离提取的细胞 用于紧急情况，应该提前采取什么措施？ B．造血干细胞可以分化为各种血细胞 （2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞 C．不同类型的干细胞，它们的分化潜能是 的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又 有差别的 可能带来哪些问题？ 第2节 动物细胞工程 47二 动物细胞融合技术与单克隆抗体 本节聚焦 我们知道，运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同种 ● 什么是动物细胞融合技术？ 植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有 ● 单克隆抗体是如何制备的？在 没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同 临床上有哪些应用？ 细胞的优势于一身的动物细胞呢？ 动物细胞融合技术 动物细胞融合技术（cell fusion technique）就是使两个或 多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交 细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。 相关信息 动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同。 灭活是指用物理或化学手段 诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和 使病毒或细菌失去感染能力，但 灭活病毒诱导法等。 并不破坏它们的抗原结构。灭活 细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成 病毒诱导细胞融合的原理是：病 为可能。人们可以按照预先的设计使不同细胞融合，至今， 毒表面含有的糖蛋白和一些酶能 种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已 够与细胞膜上的糖蛋白发生作用， 获得了成功。目前，这一技术已经成为研究细胞遗传、细 使细胞互相凝聚，细胞膜上的 蛋白质分子和脂质分子重新排布， 胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是利 细胞膜打开，细胞发生融合。 用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤（hybridoma）技 术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。 用特定的抗原对小鼠进行免疫，并 用特定的选择培养基进行筛选：在该培 从该小鼠的脾中得到能产生特定抗 养基上，未融合的亲本细胞和融合的具 体的B淋巴细胞。 有同种核的细胞都会死亡，只有融合的 杂交瘤细胞才能生长。 多种杂交细胞 多种B淋巴细胞 注射特定的抗原 诱导融合 培养骨髓瘤细胞 将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合 骨髓瘤细胞 48 第2章 细胞工程单克隆抗体及其应用 早期人们为了获得抗体，就向动物体内反复注射某种抗 原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。用 19世纪30年代，科学家曾 这种方法制备的抗体不仅产量低、纯度低，而且特异性差。 在患肺结核、天花和麻疹等疾病 的病人的病理组织中观察到多核 为了解决这一难题，科学家进行了多年的研究和探索。他 细胞。如何解释这一现象？ 们发现，哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的B淋巴 细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原 体，从而抑制病原体的增殖等。动物体内产生的特异性抗体 的种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性 抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B 淋巴细胞，形成细胞群。遗憾的是，在体外培养条件下，一 个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，怎样解决这一问题呢？ 1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人 工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的 实验方案。他们想到，如果把一种B淋巴细胞与能在体外大 量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增 殖，产生足够数量的特定抗体。根据该设想，通过实验，他 图2-15 用96孔板培养和筛选 们得到了单克隆抗体（图2-15、图2-16）。由于这一贡献， 杂交瘤细胞（每一个孔 米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。 中尽量只接种一个杂 交瘤细胞） 对上述经选择培养的杂交瘤 将抗体检测呈阳性的杂交瘤细 从细胞培养液或小鼠 细胞进行克隆化培养和抗体 胞在体外条件下大规模培养， 腹水中获取大量的单 检测，经多次筛选，就可获 或注射到小鼠腹腔内增殖。 克隆抗体。 得足够数量的能分泌所需抗 体的细胞。 体外培养 抗体检测呈阳性的杂 单克隆抗体 交瘤细胞（分泌的抗 体能与特定抗原结合） 杂交瘤细胞（既能迅速大量增殖， 注射到小鼠腹腔内 又能产生抗体） 图2-16 米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的示意图 第2节 动物细胞工程 49思考·讨论 单克隆抗体的应用 资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克 没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对 隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊 健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上 娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断 的应用。抗体—药物偶联物（antibody-drug 方法提前了10 d左右，可以避免孕妇在不知 conjugate，ADC）通过将细胞毒素与能特异 道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不 性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了 利影响。该方法检测的准确率在90%以上。 对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗 资料2 使用高效的细胞毒素类药物进 体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组 行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素 成，它的作用机制如下图所示。 ADC被细胞吞噬 抗体 5 2 药物 接头 1 ADC 4 3 释放药物 细胞凋亡 溶酶体裂解 ADC的作用机制示意图 讨论 1．ADC 的抗体和药物各具有什么 临床应用上各具有什么优势？ 作用？ 4．单克隆抗体在临床上还有哪些应 2．除了细胞毒素，还有哪些物质理论 用？你可以课后搜集资料，然后以“单克隆 上可以作为ADC偶联的药物？ 抗体在临床上的应用”为主题，出一期黑板 3．单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在 报或制作电子板报宣传相关知识。 单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原 发生特异性结合，并且可以大量制备，因此被广泛用作诊断试 剂，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。例 如，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像 的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。除前面介绍 的单克隆抗体可以运载药物外，单克隆抗体自身也能用于治 疗疾病。在医药领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。 2015年，全球销售额排名前十位的药物中，单克隆抗体药物就 有5种。同年，我国的单克隆抗体药物市场规模已达72亿元。 50 第2章 细胞工程练习与应用 一、概念检测 B．体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对 1．下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂 SARS病毒的单克隆抗体 交比较的叙述，错误的是 （ ） C．将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合， A．它们的原理都涉及细胞膜的流动性 经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞 B．都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合 D．将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体 C．融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞 内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体 D．前者主要是为了获得细胞产品，后者主 要是为了获得杂种植株 二、拓展应用 2．科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗 假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这 原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的 种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思 是 （ ） 路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关 A．利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同 SARS病毒 学交流。 与生物学有关的职业 细胞培养工程师 你听说过海拉（HeLa）细胞吗？它是世 才能保证培养的细胞不被污染；需要仔细观 界上最著名的一种人体细胞——宫颈癌细胞， 察细胞的生长情况，及时调整它们的生长状 是1951年从一位患宫颈癌的美国病人身上分 态；对于一些具有致病性的细胞，他们更不 离出来的。该病人已经去世，但是海拉细胞 能掉以轻心，既要保护好自身的安全，也要 直到今天还在被用于科学研究。海拉细胞得 防止它们传播扩散。细胞培养工程师为许多 到广泛应用，除与它自身的特性有关外，还 重要的科学研究成果作出了基础性的贡献， 离不开细胞培养工程师所做的重要工作。 生物技术产业的迅猛发展更是离不开他们的 细胞培养工程师是从事细胞分离、培养、 辛勤劳动，你喜欢这个职业吗？ 冻存、复苏和生物学检测等工作的专业人员。 例如，海拉细胞被送往世界各地的实验室， 往往要经历长距离、长时间的运输，而细胞 在体外的存活需要极其严格的环境条件，这 就需要细胞培养工程师的操作。他们先将细 胞收集和冻存起来，使它们在低温状态下运 输；到达目的地后，再将这些细胞复苏和传 代培养；同时，他们还要通过检测一系列的 指标来评估细胞的生长状态。 细胞培养工程师最可贵的品质是认真和 细致。他们需要做好每一步消毒和灭菌工作， 细胞培养工程师在工作 第2节 动物细胞工程 51三 动物体细胞核移植技术和克隆动物 本节聚焦 “（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫 ● 什么是动物细胞核移植技术？ 一声‘变！’即变作三二百个小猴，周围攒簇。”这是《西 ● 动物体细胞核移植的基本过程 游记》中的一段描述，展示了中华先贤的想象力。毫毛来 是什么？ 自体细胞，我们能用体细胞“变”出猴来吗？ ● 体细胞核移植技术的应用前景 通过前面的章引言，我们知道，这其实已经在某种程 有哪些？ ● 怎样理性看待体细胞核移植技 度上得到了实现。核移植（nuclear transplantation）相当于 术存在的问题？ 孙悟空施的“魔法”，科学家通过它成功培育了克隆猴等 克隆动物。动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞 核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成 相关信息 新胚胎，继而发育成动物个体的技术。 减数分裂Ⅱ中期（MⅡ期） 哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核 卵母细胞中的“核”其实是纺锤 移植（图2-17）。由于动物胚胎细胞分化程度低，表现全 体—染色体复合物。文中所说的 能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十 “去核”是去除该复合物。 分困难，因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞 核移植。而在动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体 细胞核移植非常困难。主要原因一方面是供体细胞的细胞 核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态， 这导致了胚胎发育率低；另一方面是对非人灵长类动物胚 胎进行操作的技术尚不完善。我国科学家经过多年努力， 攻克了这些障碍，终于成功获得了体细胞克隆猴。 图2-17 我国自主培育的体细胞克隆牛 体细胞核移植的过程 应用体细胞核移植技术，我国已成功地克隆了牛、羊、 猪和猴等多种哺乳动物。下面以克隆高产奶牛为例，来说 明体细胞核移植的大致过程（图2-18）。 52 第2章 细胞工程从屠宰场收集牛卵巢，采集卵母 细胞（左边照片为研究人员正在 使用设备从牛的卵巢采集卵母细 胞），在体外培养到MⅡ期 高产奶牛（供体） 从供体高产奶牛身体的 某一部位（如耳）上取 体细胞,进行培养 通过显微操作去核。 将供体细胞注入去核的卵 母细胞。 通过电融合法使两细胞融 合， 供体核进入卵母细胞， 形成重构胚。 用物理或化学方法（如电刺激、Ca2+载体、 相关信息 乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚， 重构胚是指人工重新构建 使其完成细胞分裂和发育进程 的胚胎，具有发育成完整个体的 能力。 生出与供体奶牛遗传 将胚胎移入受体 物质基本相同的犊牛 （代孕）母牛体内 图2-18 体细胞核移植流程图 第2节 动物细胞工程 53思考·讨论 有关体细胞核移植的问题 结合图2-18及前面所学知识，思考并 育的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了 讨论以下问题。 100 %的复制吗？为什么？ 1．在将体细胞的核移植到卵母细胞之前， 3．体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相 为什么必须先对卵母细胞进行去核操作？ 比，有什么相似或不同之处？请你预测它们应 2．你认为用上述体细胞核移植技术培 用前景的差异。 体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题 体细胞核移植技术在畜牧业、医药卫生以及其他领域 相关信息 有着广泛的应用前景。在畜牧生产中，利用体细胞核移植技 目前动物细胞核移植技术中 术，可以加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。在医 普遍使用的去核方法是显微操作 法。也有人采用梯度离心、紫外 药卫生领域，通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移 线短时间照射和化学物质处理等 植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许 方法。这些方法是在没有穿透卵 多珍贵的医用蛋白；在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的 母细胞透明带的情况下去核或使 细胞、组织或器官可以用于异种移植；以患者作为供体培育 其中的DNA变性。 的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、 组织或器官，将它们移植给患者时可以避免发生免疫排斥反 应。此外，研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及 衰老过程；克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之 间的对比来分析致病基因；克隆特定疾病模型的动物，还能 为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。在保 护濒危物种方面，该技术有望增加濒危物种的存活数量。 尽管通过体细胞核移植技术已经获得了多种克隆动物， 但该技术的成功率仍然非常低，各个技术环节也有待进一步 改进。相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后，需要 与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的 理论研究相结合。此外，一些研究者指出，绝大多数克隆动 物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如 体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。 总之，体细胞核移植技术的研究仍在继续深入，人类对克隆 技术的应用还有许多问题需要解决。期待在不远的将来，克 隆技术能更好地造福于人类。 54 第2章 细胞工程到社会中去 我国科学家已成功地克隆了牛、羊和猪等多种哺乳动物，这些研究成果目前已经转化为 生产力了吗？请你查阅书籍、专利文献等，了解以下信息：哪些成果已经在生产实践上得以 应用，其经济价值如何？哪些成果还没有在生产实践中得到推广，其限制因素是什么？ 练习与应用 一、概念检测 二、拓展应用 1．假设世界上最后一头野驴刚死亡，以下 1．大熊猫是我国的国宝。尽管我国政府采 使它“复生”的方案中可行的是 （ ） 取了许多保护措施，但由于大熊猫的繁殖能力低， A．将野驴的基因导入家驴的受精卵中，培 幼仔成活率也低，它的数量仍然非常少。有科学 育出新个体 家尝试采用体细胞核移植技术来克隆大熊猫。请 B．将野驴的体细胞取出，利用组织培养培 你结合本节所学内容并搜集相关资料了解这方面 育出新个体 的研究进展。也有人不赞成进行克隆大熊猫的研 C．将野驴的体细胞两两融合，再经组织培 究，认为保护大熊猫的最好措施就是保护现有大 养培育出新个体 熊猫及其生存环境，对此你有什么看法？ D．将野驴的体细胞核移植到家驴的去核卵 2．2003年，世界上第一只用体细胞克隆的动 母细胞中，经孕育培育出新个体 物—多莉，因患有严重的肺部疾病被实施了安乐 2．2017年，某国批准了首例使用细胞核移 死。它只活了7岁，而普通绵羊的平均寿命在12岁 植技术培育“三亲婴儿”的申请。其培育过程可 左右。多莉的死亡引发了关于克隆动物是否早衰的 选用如下技术路线。 争论。一些研究者认为，克隆动物的端粒比较短， 基因表达不正常，早衰是一种必然现象。另一些研 去核 究者则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前 核移植 捐献者卵母细胞 体外培养 发现的早衰迹象是在克隆过程中的一些技术问题造 取核 成的；或者克隆动物在发育过程中出现了变异，早 MⅡ期 精子 母亲卵母细胞 衰只是偶然现象。请你搜集资料，寻找支持各方观 卵母细胞 点的研究证据。你也可以调查克隆动物存在的其他 体外受精 问题，并说明科学家是如何解决这些问题的。 “三亲婴儿” 受精卵 据图分析下列叙述错误的是 （ ） A．该技术涉及动物细胞培养、细胞核移植 等操作 B．该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因 传递给后代 C．卵母细胞捐献者携带的红绿色盲基因能 够遗传给“三亲婴儿” D．“三亲婴儿”同时拥有自己父亲、母亲及 卵母细胞捐献者的部分基因 晚年时期的多莉（标本） 第2节 动物细胞工程 55第 3 节 胚胎工程 从社会中来 我国对奶类的总需求量很大，但与奶业发达的国家相 比，我国奶牛的单产水平还存在一定差距。奶牛品种是影 响产奶量的主要因素之一，而引进一头成年奶牛往往需要 数万元，高昂的价格使得靠大量引进优良品种来提高产量 不太可行。能不能让引进的良种奶牛快速、大量繁殖呢？ 遗憾的是，牛的生育率很低，一头母牛一胎一般只产一头 犊牛，一生生育四五次。如何解决这个难题呢？ 良种荷斯坦奶牛 胚胎工程的迅猛发展让人们大量繁殖优良家畜品种的愿 望，正在成为现实。 胚胎工程（embryo engineering）是指对生殖细胞、受 精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得 的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需 求。胚胎工程技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。 一 胚胎工程的理论基础 本节聚焦 ● 胚胎形成经过了哪些过程？ 胚胎工程的许多技术，实际上是在体外条件下，对动 ● 受精和早期胚胎发育的基本过 物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。因此， 程是怎样的？ 了解哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律十分重要。 受精 相关信息 受精（fertilization）是精子与卵子结合形成合子（即 使精子获能的方法有直接 受精卵）的过程，包括受精前的准备阶段和受精阶段。在 利用雌性动物的生殖道使精子 自然条件下，哺乳动物的受精在输卵管内完成。 获能；将精子培养在人工配制 准备阶段1—精子获能 的获能液中使其获能等。获能 科学研究发现，刚刚排出的精子不能立即与卵子受精， 液的成分因动物种类不同而有 必须在雌性动物的生殖道发生相应的生理变化后，才能获得 所差异，常见的有效成分有肝 素、Ca2+载体等。 受精能力，这一生理现象称为“精子获能”（capacitation）。 56 第2章 细胞工程通过对精子获能机制的研究，科学家找到了使精子（图 2-19）在体外获能的方法，实现了各种哺乳动物精子在体外 条件下的获能，为体外受精技术的建立奠定了重要基础。 透明带 头 卵细胞膜 颈 核 线粒体鞘 第一极体 尾 精子穿越卵细胞膜外的结构 （如透明带等） 牛 猪 绵羊 马 精子接触 卵细胞膜 图2-19 成熟精子和几种主要家畜的精子示意图 准备阶段2—卵子的准备 卵子一般在排出2〜3 h后才能被精子穿入。动物排出的 卵子成熟程度不同，有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等； 雄原核 有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等。但它们都要在输卵 第一极体 管内进一步成熟，到MⅡ期时，才具备与精子受精的能力。 雌原核 放出第二极体 精子入卵后形成雄原核；同时 受精阶段 卵子完成减数分裂Ⅱ，释放第 获能后的精子与卵子相遇时，首先它释放出多种酶， 二极体后，形成雌原核 以溶解卵细胞膜外的一些结构，同时借助自身的运动接触 卵细胞膜。在精子触及卵细胞膜的瞬间，卵细胞膜外的透 明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带。 然后，精子入卵。精子入卵后，卵细胞膜也会立即发生生 雌、雄原核靠近 理反应，拒绝其他精子再进入卵内。 精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个 新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的核，叫作 雄原核。与此同时，精子入卵后被激活的卵子完成减数分 裂Ⅱ，排出第二极体后，形成雌原核。 核膜消失，第一 雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜 次卵裂即将开始 消失。这个含有两个染色体组的合子就是受精卵。受精过 程结束后，受精卵的发育也就开始了（图2-20）。 图2-20 哺乳动物受精过程示意图 第3节 胚胎工程 57胚胎早期发育 相关信息 受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，开始发育。 胚胎发育早期，有一段时间是在透明带内进行分裂，细胞 多数哺乳动物的第一极体不 进行减数分裂Ⅱ，因而不会形成 的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，这种受精卵 两个第二极体。在实际胚胎工程 的早期分裂称为卵裂。 操作中，常以观察到两个极体或 根据胚胎形态的变化，可将早期发育的胚胎分为以下 者雌、雄原核作为受精的标志。 几个阶段（图2-21）。 桑葚胚 当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团， 形似桑葚时，这时的胚胎称为桑葚胚。 囊胚 胚胎进一步发育，细胞逐渐分化。聚集在胚胎 一端的细胞形成内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织； 而沿透明带内壁扩展和排列的细胞，称为滋养层细胞，它 们将来发育成胎膜和胎盘。 随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部出现了含有液体 的腔—囊胚腔，这个时期的胚胎叫作囊胚。囊胚进一步 受精卵 扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过 程叫作孵化。孵化非常重要，如果不能正常孵化，胚胎就 无法继续发育。 囊胚孵化后，将发育形成原肠胚。原肠胚表面的细胞层 2细胞 为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层。随着发育的进行， 一部分细胞还会在内、外两个胚层之间形成中胚层。这三个 胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。 4细胞 囊胚腔 内细胞团 滋养层 透明带 8细胞 桑葚胚 囊胚 图2-21 哺乳动物胚胎的早期发育示意图 58 第2章 细胞工程思考·讨论 不同动物受精卵发育的比较 不同动物受精卵发育及其进入子宫的时间有明显的差异。请分析下表，讨论相关问题。 几种动物受精卵发育及其进入子宫的时间表 进入子宫时受精卵的 动物 受精卵发育的时间/ h 发育时间和发育阶段 种类 2细胞 4细胞 8细胞 16细胞 桑葚胚 时间/ d 发育阶段 小鼠 24〜38 38〜50 50〜60 60〜70 68〜80 3 桑葚胚 绵羊 36〜38 42 48 67〜72 96 3〜4 16细胞 猪 21〜51 51〜66 66〜72 90〜110 110〜114 2〜2.5 4〜6细胞 马 24 30〜36 50〜60 72 98〜106 6 囊胚 牛 27〜42 44〜65 46〜90 96〜120 120〜144 4〜5 8〜16细胞 注：马、牛为排卵后时间，其他动物为交配后时间。 讨论 1．表中哪种动物的胚胎在进入子宫时 胎？如果换成牛又该怎样处理？ 发育程度最高？ 3．为什么说关于动物的体内受精和胚 2．将体外培养的小鼠胚胎移植到母鼠 胎发育的研究，会为胚胎工程提供理论基 子宫时，应选择至少发育到什么阶段的胚 础？请结合所学习的内容举例说明。 练习与应用 一、概念检测 的细胞逐渐分化 1．判断下列有关哺乳动物受精的表述是否正确。 D．受精卵早期分裂时，胚胎中细胞数目不 （1）在自然条件下，受精在子宫中完成。（ ） 断增加，但胚胎的总体积并不增加 （2）精子需要获能才能与卵子结合，而卵子 一经排出就具备受精能力。 （ ） 二、拓展应用 （3）精子入卵后，卵细胞膜会发生反应阻止 1．精母细胞在变成精子的过程中，很多结 其他精子入卵。 （ ） 构会消失，而细胞核与线粒体都保留了下来，请 2．下列有关哺乳动物早期胚胎发育的叙述， 尝试用你所了解的哺乳动物受精的相关知识来解 错误的是 （ ） 释这一现象。 A．在桑葚胚阶段，胚胎的内部开始出现含 2．精子在雌性动物的生殖道内是如何获能 有液体的腔 的？除了教材中介绍的，防止多精入卵的机制还 B．胚胎干细胞是一类未分化的细胞，可以 有哪些？感兴趣的话，请通过查阅相关资料或请 从早期胚胎中分离获得 教专家来进行了解。关于受精作用，你还能提出 C．桑葚胚的细胞一般都具有全能性，囊胚 其他问题吗？ 第3节 胚胎工程 59二 胚胎工程技术及其应用 本节聚焦 胚胎工程技术包含的内容很丰富，目前在医学和生产 ● 胚胎工程技术主要包括哪些内 上应用较多的是体外受精、胚胎移植和胚胎分割等，借助 容？它们的原理分别是什么？ 这些技术，可以进一步挖掘动物的繁殖潜力。 ● 胚胎工程在生产实践中有哪些应 用？ 体外受精 你听说过试管牛、试管羊吗？它们是通过人工操作使 卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植 产生的个体。科学家为开发相应的技术，付出了艰苦的努 力。在这个过程中，首先要做的就是体外受精。哺乳动物 的体外受精技术主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和 受精等步骤（图2-22）。采集到的卵母细胞和精子，要分 别在体外进行成熟培养和获能处理，然后才能用于体外 受精。一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子 置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成 受精。 MⅡ期卵母细胞 获能精子 体外受精 卵巢 精子离心处理 新鲜或解 冻的精液 受精卵培养 图2-22 哺乳动物体外受精过程示意图 体外受精技术是提高动物繁殖能力的有效措施，还可 以为胚胎移植提供可用的胚胎。我国体外受精技术的研究 起步于20世纪80年代后期，进展很快，目前已经在羊、 牛、猪和人等生物中取得成功，特别是人和牛的体外受精 技术已达国际先进水平。 60 第2章 细胞工程胚胎移植 胚胎移植（embryo transfer）是指将通过体外受精及其 他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性 动物体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎 的个体称为“供体”（donor），接受胚胎的个体叫“受体” （recipient）。通过任何一项技术（如转基因、核移植和体外 受精等）获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。 在胚胎移植中，牛的胚胎移植技术较为成熟。目前已 实现平均每次处理一头供体奶牛收集到的胚胎，经移植可 产下3〜4头犊牛，由于每年可处理4〜5次，这样，一头 良种母牛一年由代孕母牛生下的后代可达十几头，远远超 过一头良种母牛在自然状态下一生所得的后代数量。羊的 胚胎移植效率比奶牛还要高。 以牛的胚胎移植为例，胚胎移植主要包括供体、受体的 选择和处理，配种或人工授精，胚胎的收集、检查、培养或 保存，胚胎的移植，以及移植后的检查等步骤（图2-23）。 优良供体母牛 受体母牛 （遗传性状优良、生产能力强） （有健康的体质和正常繁殖能力） 进行同期发情处理 超数排卵处理 受体发情 发情配种或人工授精 移植胚胎 优良公牛 收集胚胎并检查 对受体进行妊娠检查 正常繁殖或两三个月 后进行另一次移植 具有优良性状的后代 图2-23 牛胚胎移植示意图 第3节 胚胎工程 61思考·讨论 胚胎移植的生理学基础 结合图2-23，思考与讨论以下问题。 免疫排斥反应？ 1．将检验合格的胚胎移植到任何一个 3．胚胎移植后，经受体孕育的后代，其 受体的子宫内，胚胎都能正常发育吗？如果 遗传特性与供体还是受体保持一致？为什么？ 不能，在胚胎移植前应该对受体进行怎样的 4．胚胎移植实质上是早期胚胎在相同 处理？ 生理环境条件下空间位置的转移。你认为这 2．受体会不会对来自供体的胚胎发生 样的概括正确吗？为什么？ 相关信息 进行胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良个体的繁 殖潜力。在这项技术中，供体的主要职能变为产生具有优良 超数排卵是指应用外源促性 腺激素，诱发卵巢排出比自然情 遗传特性的胚胎，繁重而漫长的妊娠和育仔任务由受体取代， 况下更多的成熟卵子。 这就大大缩短了供体本身的繁殖周期。同时，在对供体施行 超数排卵处理后，可获得多枚胚胎，经移植可得到多个后代， 这使供体的后代数是自然繁殖的十几倍到几十倍。在我国， 家兔、绵羊、牛和马等动物的胚胎移植都获得了成功。牛、 羊的胚胎移植在部分地区已进入生产应用阶段，这些成果大 大促进了我国畜牧业的发展。胚胎移植作为胚胎工程的最终 技术环节，还将推动胚胎工程其他技术的研究和应用。 胚胎分割 早期胚胎细胞具有很强的分裂能力，并保持着细胞全 能性，能不能将一个胚胎分割成几份，从而提高胚胎的利 用率？基于这样的设想，胚胎分割技术逐渐发展成熟。 胚胎分割（embryo splitting）是指采用机械方法将早期胚 胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或 多胎的技术。来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因 此胚胎分割可以看作动物无性繁殖或克隆的方法之一。 胚胎分割所需要的主要仪器设备为体视显微镜和显微 操作仪（图2-24）。在进行胚胎分割时，应选择发育良好、 形态正常的桑葚胚或囊胚，将它移入盛有操作液的培养皿 中，然后在显微镜下用分割针或分割刀分割。在分割囊胚 图2-24 体视显微镜（上）和 显微操作仪（下） 阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割。对于不同发 62 第2章 细胞工程育阶段的胚胎，分割的具体操作不完全相同。分割后的胚 胎可以直接移植给受体，或经体外培养后，再移植给受体。 经过30多年的发展，胚胎分割技术日趋成熟。这项技 术可以促进优良动物品种的繁殖，产生的遗传性状相同的 后代是进行遗传学研究的宝贵材料。此外，在胚胎移植前， 进行性别鉴定、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、 动物繁育健康后代具有重要意义（图2-25）。 取样滋养层 分割针 做DNA分析， 鉴定性别 已知性别胚胎 囊胚腔 在显微镜下切割胚胎 透明带 胚胎移植 滋养层 二分胚 内细胞团 分割针 内细胞团 图2-25 牛胚胎性别鉴定和分割示意图 资料卡 胚胎分割的发展简史 1978年，科学家将小鼠的桑葚胚一分 等。实践证明，采用胚胎分割技术产生同卵 为二，获得了成功。1979年，科学家分割 多胚的可能性是有限的，分割次数越多，分 绵羊胚胎获得了同卵羔羊。20世纪80年代 割后胚胎成活的概率越小。目前，仍然以二 后，人们建立了系统的胚胎分割方法，并相 分胚胎的分割和移植效率最高，这成为提高 继得到1/4和1/8分割胚胎的后代。我国的胚 家畜胚胎利用率的手段之一。 胎工程专家也进行了分割胚胎移植的实验研 究，成功地对小鼠、家兔、绵羊、山羊和牛 等动物进行了分割胚胎移植，并将二分胚胎 分割技术应用到牛和羊的胚胎移植中。 尽管胚胎分割技术已经在多种动物中 取得成功，但仍存在一些问题，如刚出生 的动物体重偏低，毛色和斑纹可能存在差异 应用胚胎分割技术获得的三卵六羔羊 第3节 胚胎工程 63到社会中去 荷斯坦奶牛的产奶量很高。某良种公司引进了纯种荷斯坦奶牛，并用胚胎分割技术繁育 了良种荷斯坦奶牛群体。如果你是一名科技专栏的记者，现在需要写一篇关于用胚胎分割技 术繁育良种奶牛的报道，请写出你准备向胚胎工程专家提出的三个问题，然后与其他同学交 换问题，再以访谈录的形式回答他提出的问题（可通过查阅网络、书籍上的资料或向专家请 教等方式解决自己回答不出的问题）。 练习与应用 一、概念检测 （1）请将图中括号内的内容补充完整。 1．体外受精和胚胎移植都是在医学和农业 （2）为了获得数量较多的卵母细胞，可以对 生产上应用较多的胚胎工程技术。判断下列相关 雌性杜泊羊进行怎样的处理？ 表述是否正确。 （3）在进行体外受精操作之前，还要对获得 （1）采集来的卵母细胞和精子可以直接用于 的卵母细胞和精子进行怎样的处理？ 体外受精。 （ ） （2）经胚胎移植产生的后代，其遗传特性与 二、拓展应用 受体保持一致。 （ ） 北方白犀牛曾经广泛分布于非洲中部等地， （3）进行胚胎移植前，要对供体和受体进行 但由于猖獗的盗猎和自然栖息地的丧失，它们的 免疫检查，以防止发生免疫排斥反应。 （ ） 数量不断减少。2018年3月，世界上最后一头雄 2．杜泊羊以其生长速度快、肉质好等优点， 性北方白犀牛死亡，该物种仅剩下两头雌性。在 成为受广大消费者喜欢的绵羊品种。科研工作者 此之前，研究人员设法保存了北方白犀牛的精子。 通过胚胎工程快速繁殖杜泊羊的流程如下图所示。 请回答下列问题。 （1）我们可以使用哪些现代生物技术来人工 采集 雌性杜泊羊 卵母细胞 繁育北方白犀牛？运用这些技术一定能繁育成功 体外受精 受精卵 吗？请说出你的理由。 采集 雄性杜泊羊 精子 （2）如果繁育成功，这样人工繁育的种群与 （ ） 野生种群相比，有什么区别？ 分娩 当地普通 （ ） （3）如果繁育不成功，这一物种将永远从地 杜泊羊 早期胚胎 绵羊 球上消失，从中我们能得到怎样的教训？ 北方白犀牛 64 第2章 细胞工程本章小结 理解概念 ● 细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生 物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平 上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或 其产品的一门综合性的生物工程，包括植物细胞工程和动物 细胞工程等。 ● 植物细胞工程的基本技术有植物组织培养技术、植物 体细胞杂交技术等。植物组织培养是指将离体的植物器官、 组织或细胞等培养在培养基上，给予适宜的培养条件，诱导 其形成完整植株的技术。植物体细胞杂交是指将不同来源的 植物体细胞在一定条件下融合成杂种细胞，进而培育成新植 物体的技术。利用植物细胞工程，可以快速繁殖优良品种、 培育作物新品种、进行作物脱毒和细胞产物的工厂化生产等， 有效提高生产效率。 ● 动物细胞工程常用的技术有动物细胞培养、动物细胞 融合和动物细胞核移植等。动物细胞培养是动物细胞工程的 基础；动物细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术；利 用动物细胞核移植技术可以培育克隆动物。在克隆动物的培 育过程中，还需要用到胚胎移植技术，它属于胚胎工程的范 畴。哺乳动物在自然条件下受精和早期胚胎发育的规律是胚 胎工程重要的理论基础。胚胎工程技术还包括体外受精、胚 胎分割等。 发展素养 通过本章的学习，应在以下几方面得到发展。 ● 认同细胞工程的发展是一代又一代科学家经过长时间 探索的结果，其中我国科学家发挥了重要作用。 ● 尝试运用植物组织培养技术培育菊花或其他植物幼苗。 ● 认同细胞工程在农业生产、医疗卫生等方面发挥了重 要作用。 ● 能够运用生物学基本概念和原理，对日常生活中与干 细胞、克隆动物和胚胎分割等有关的议题进行科学分析和 判断。 65复习与提高 1．若下图表示细胞工程操作中的某些过程， 织再分化形成的芽和苗中均有青蒿素； 请回答下列问题。 （5）四倍体黄花蒿体内青蒿素的含量比二倍 体高38%，但四倍体植株比二倍体植株矮小很多。 3．在章首页中介绍的体细胞克隆猴的培育过 A 程中，我国科学家经过多年的反复试验，可以在 10 s之内对卵母细胞进行去核操作，在15 s之内 C 将体细胞注入去核的卵母细胞里。有评论者认为： 该研究的研究者利用“聪明的化学方法和操作技 B 巧”，攻克了多年来导致体细胞克隆猴失败的障 碍。培育克隆猴的流程如下图所示，请结合图回 （1）如果A、B分别是白菜和甘蓝的原生质 答问题。 体，则C细胞再生出细胞壁后需要通过什么技术 用灭活的仙台 取出 病毒短暂处理 才能发育成杂种植株“白菜—甘蓝”？若白菜和甘 胎猴 体细胞 蓝杂交产生了子代，该子代是否可育？为什么？ （2）若该图表示抗丙肝病毒的单克隆抗体制备 采集 去核 去核卵 母猴 卵母细胞 过程中的一环，A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细 母细胞 胞表示什么？符合要求的C细胞应具有哪些特点？ Kdm4d的 融 培 合 养 （3）如果A、B分别是取自优良奶牛的卵细 mRNA 胞和精子，在进行体外受精时，一般要把A细胞 注入 培养到什么时期？B细胞则要经过什么处理才能 克隆 生出 代孕 胚胎移植 重构胚 小猴 母猴 与A细胞结合为受精卵？ 2．2015年10月，我国科学家屠呦呦因发现 处理 TSA 青蒿素可以有效降低疟疾患者的死亡率而获得了 诺贝尔生理学或医学奖。青蒿素类药物的市场需 （1）研究人员在将胎猴的体细胞注入去核的 求很大，请你根据所学内容及以下信息，提出一 卵母细胞前，用灭活的仙台病毒进行了短暂处理。 条提高青蒿素类药物产量的研究思路。 在此过程中，灭活的仙台病毒所起的作用是什么？ （1）青蒿素的衍生物—双氢青蒿素也是很 （2）为了调节相关基因的表达，提高胚胎的 好的抗疟疾药物，并且它的药物活性比青蒿素的 发育率和妊娠率，研究人员将组蛋白去甲基化酶 高很多； Kdm4d的mRNA注入了重构胚，同时用组蛋白脱 （2）青蒿素是从黄花蒿中提取的，在黄花蒿 乙酰酶抑制剂TSA处理了它。这两种物质发挥作 产生青蒿素的代谢过程中，某些酶（如FPS酶） 用的机制是什么？ 起决定性作用； （3）评论者所说的培育过程中用到的“聪明 （3）野生黄花蒿在生长过程中，处于花蕾期 的化学方法和操作技巧”，你认为具体体现在什 时体内青蒿素含量最高； 么地方？ （4）研究人员在对黄花蒿进行组织培养时， （4）你认为体细胞克隆猴的成功培育有什么 发现它的愈伤组织中没有青蒿素，但是由愈伤组 意义？ 66 第2章 细胞工程第 3 章 基因工程 我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常 会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以 使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。 大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和 环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种， 这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫 棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培 育不出抗虫棉，基因工程却可以呢？基因工程是如何进行操作 的？它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？ 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合 人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操 作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进 行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。科 技科探技索探之索路之 路 基因基工因程工是程在是生在物生化物学化、学分、子分生子物生学物和学微和生微生 物学物等学学等科学的科基的础基上础发上展发起展来起的来，的正，是正这是些这学些科学科 基因基工因程工的程诞的生诞和生发和展发展 的基的础基理础论理和论相和关相技关术技的术发的展发催展生催了生基了因基工因程工。程。 19581年95，8年梅，塞梅尔塞森尔 森 19441年94，4 年艾，弗艾里弗 里 （M.（ MMes. eMlsoense, l1so9n3,0 —19）30—） （O.（ AOv.e Aryv，e1r8y，771—877— 和斯和塔斯尔（塔F尔. W（. FS. tWah. lS, tahl, 1955）19等55）人等通人过通肺过炎肺炎 1929—19）29用—）实用验实证验明证明 链球链菌球的菌转的化转实化验实，验， 19611年96，1年尼，伦尼伯伦格伯 格 了D了NAD的NA半的保半留保复留复 不仅不证仅明证了明遗了传遗物传物 （M.（ WM. . NWir. eNnbireerngb, erg, 制。制几。乎几同乎一同时一期时期 质是质DN是AD，N还A，证还明证明 19271—92270—10）201和0）马和 马 确立确的立中的心中法心则法阐则阐 了DN了AD可NA以可在以同在种同种 太（J太. （H.J .M Ha.t tMhaaetit,h aei, 明了明遗了传遗信传息信流息动流动 生物生的物不的同不个同体个之体间之 间 19291—9）29—破）译破了译第了第 的方的向方。向。 限制限酶制产酶品产品 转移转。移。 一个一编个码编氨码基氨酸基的酸的 密码密子码。子截。至截19至661966 19701年97，0科年，学科家学在家细在菌细中菌中 年，6年4个，6密4个码密子码均子均 发现发了现第了一第个一限个制限性制内性切内切 被成被功成破功译破。译。 核酸核酶（酸简酶（称简限称制限酶）制。酶）。 19501年95，0年埃，德埃曼德（P曼. （EdPm. Eand，man， 19161—91169—771）97发7）明发了明一了种一测种测 定氨定基氨酸基序酸列序的列方的法方。2法年。后2年，后，19531年95，3年沃，森沃（J森. D（.J W. Da.t sWona,t son, 桑格桑（F格. S（anF.g eSra，n 1g9e1r，8 —1921801—3）20首13）首19281—9）28—和）克和里克克里（F克. （CrFi.c kC, rick, 次完次成完了成对了胰对岛胰素岛氨素基氨酸基序酸列序列19161—91260—04）200建4）立建了立D了NAD双NA双 的测的定测。定。 螺旋螺结旋构结模构型模并型提并出提了出遗了传遗传 20世2纪0世70纪年7代0年初代，初多，种多种 物质物自质我自复我制复的制假的说假。说。 19671年96，7年科，学科家学家 限制限酶制、D酶N、AD连NA接连酶接和酶和 发现发，现在，细在菌细拟菌拟 逆转逆录转酶录被酶相被继相发继现发。现。 核D核NAD之NA外之的外质的质 这些这发些现发为现D为NAD的NA切的切 粒有粒自有我自复我制复能制能 割、割连、接连以接及以功及能功基能因基因 力，并力，可并以可在以细在菌细菌 的获的得获创得造创了造条了件条。件。 细胞细间胞转间移转。移。 DNAD双N螺A双旋螺结旋构结模构型模型 上述上仅述是仅按是照按时照间时顺间序顺简序要简提要及提基及因基工因程工相程关相关 基础基理础论理的论突的破突和破技和术技的术创的新创。新有。些有你些已你经已学经习学过习，过， 更多更的多将的在将本在章本中章展中开展。开科。学科提学供提对供自对然自界然的界说的明说，明， 技术技将术科将学科原学理原应理用应于用认于识认自识然自、然造、福造人福类人的类实的践实，践， 工程工则程综则合综运合用运多用种多技种术技来术生来产生人产类人所类需所要需的要产的品产。品。 科学科、学技、术技、术工、程工和程社和会社的会互的动互，动不，断不调断整调着整人着类人类 与自与然自界然的界关的系关，系推，动推着动文着明文的明进的步进。步。 68 第3章 基因工程19821年98，2年第，一第个一基个因基工因工 19771年97，7年桑，格桑等格科等学科家学家 程药程物药—物—重组重人组胰人岛胰岛 发明发了明DN了AD序NA列序分列析分的析的 素被素批被准批上准市上。市基。因基工因工 方法方，法为，基为因基序因列序图列的图的 19721年97，2年伯，格伯（P格. （BePr.g B, erg, 程药程物药成物为成世为界世各界国各研国研 绘制绘提制供提了供可了能可。能此。后此，后， 19261—9）26首—）先首在先体在外体进外行进行 究和究投和资投开资发开的发热的点热。点。 DNAD合NA成合仪成的仪问的世问为世体为体 了DN了AD改NA造改的造研的究研，究成，成 外合外成合DN成AD提N供A提了方供便了。方便。 功地功构地建构了建第了一第个一体个外体外 重组重DN组AD分N子A分。子。 19831年98，3年科，学科家学采家采 用农用杆农菌杆转菌化转法化培法培 育出育世出界世上界第上一第例一例 转基转因基烟因草烟。草此。后此，后， 基因基工因程工进程入进了入迅了迅 速发速展发的展阶的段阶。段。 19841年98，4年我，国我科国学科家学朱家作朱言作言 （194（1—19）41领—）导领的导团的队团培队育培出育世出界世界 上第上一第条一转条基转因基鱼因。鱼。 19731年97，3年科，学科家学证家明证质明粒质粒 可以可作以为作基为因基工因程工的程载的体载，体， 19851年98，5年穆，里穆斯里 斯 构建构重建组重DN组AD，N导A入，导受入体受细体细 （K. （MKu.l lMis,u 1ll9i4s,4 —1944— 胞，胞使，外使源外基源因基在因原在核原细核胞细胞 2019）201等9）人等发人明发明 中成中功成表功达表，达并，实并现实物现种物间种间 PCR，PC为R，获为取获目取的目的 的基的因基交因流交。流至。此至，此基，因基工因工 基因基提因供提了供有了效有效 程正程式正问式世问。世。 朱作朱言作（言左（一左）一研）究研小究组小在组工在作工作 手段。手段。 19901年99，0年人，类人基类因基因 组计组划计启划动启。2动00。32003 年，年该，计该划计的划测的序测序 任务任顺务利顺完利成完。成。 21世2纪1世以纪来以，来科，学科家学发家明发明 了多了种多高种通高量通测量序测技序术技，术， 可以可实以现实低现成低本成测本定测大定量大量 核酸核序酸列序，列加，速加了速人们了人对们对 基因基组因序组列序的列了的解了。解。 20132年01，3年华，人华科人学科家学张家锋张（1锋98（2—19）82及—）其及团其队团首队次首报次报 道利道用利最用新最的新基的因基组因编组辑编技辑术技—术—CRISCPRRI（ SP成R（ 簇成规簇规 律间律隔间短隔回短文回重文复重）复技）术技编术辑编了辑哺了乳哺动乳物动基物因基组因。组该。该 技术技可术以可实以现实对现特对定特基定因基的因定的点定插点入插、入敲、除敲或除替或换替。换。 高通高量通基量因基测因序测仪序仪 科技探索之路 69第 1 节 重组 DNA 技术的基本工具 从社会中来 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这 种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计， 用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木 瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2 nm，对如此微小的分子进 行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工 具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些 “分子工具”各具有什么特征呢？ 转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右） 本节聚焦 “工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因番木瓜 ● 重组DNA技术所需的三种基 时，首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切 本工具是什么？它们的作用分 割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入番木 别是什么？ 瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。实现这一精确的操作 ● 基因工程载体需要具备什么 过程至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的 条件？ “分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针” 和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输 车”。科学家正是靠这三种必需的工具（图3-1），才使培 育转基因番木瓜这一奇妙构想变成了现实。 “分子运输车” “分子手术刀” “分子缝合针” 图3-1 重组DNA技术所需的三种基本工具示意图 70 第3章 基因工程限制性内切核酸酶—“分子手术刀” 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶（restriction endonuclease），简称限制酶（restriction enzyme）。这类 你能根据所掌握的知识，推 酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今分离的限制 测限制酶存在于原核生物中的主 要作用是什么吗？ 酶有数千种，许多已经被商业化生产。它们能够识别双链 DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位 的磷酸二酯键（图3-2）断开。 3' 5' T A 磷酸二酯键 G C A T G C T A 5' 3' 图3-2 双链DNA的结构和磷酸二酯键的位置示意图 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如， EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少 数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组 成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有 两种形式—黏性末端和平末端（图3-3）。当限制酶在它 识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA分子的两条 链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序 列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 EcoRⅠ （在G与A之间切割） 5' 3' 3' 5' 黏性末端 中轴线 5' 3' SmaⅠ （在G与C之间切割） 3' 5' 平末端 中轴线 图3-3 限制酶切割DNA分子产生两种不同末端的示意图（箭头表示酶的切割位置） 第1节 重组DNA技术的基本工具 71资料卡 限制酶名字的由来 限制酶是如何命名的呢？是用生物属 酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型 名的头一个字母与种加词的头两个字母，组 菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果 成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是 它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一 从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制 种限制酶，则进一步表示成EcoRⅠ。 DNA连接酶—“分子缝合针” 将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA DNA连接酶与DNA聚合酶 连接酶来完成的。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现 是一回事吗？为什么？ 了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，称之为DNA连 接酶（DNA ligase）。在基因工程操作中，DNA连接酶主要有 两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coli DNA连 接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4 DNA连 接酶。这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复 被限制酶切开的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别。 E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接 起来，不能连接具有平末端的DNA片段。而T4 DNA连接酶 既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝 合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。 基因进入受体细胞的载体—“分子运输车” 怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒 （plasmid）作为载体（vector），将基因送入细胞。质粒是一种 拟核DNA 质粒 裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核 DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质 粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA 片段（基因）插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体 大肠杆菌细胞 细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上， 目的基因 插入位点 随受体DNA同步复制。在基因工程操作中，真正被用作载 氨苄青霉素 抗性基因 体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这 复制原点 些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄 图3-4 大肠杆菌及质粒结构模式图 青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选（图3-4）。 72 第3章 基因工程在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动 植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式 以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。这些 基因工程载体，相当于一种运输工具，因此将它们比喻为 “分子运输车”。 思考·讨论 重组DNA分子 请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列： 5' -ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC- 3' 3' -TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG- 5' 5' -TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC- 3' 3' -AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG- 5' 请你根据图3-3中的相关信息找到两 讨论 条片段上EcoRⅠ的识别序列和切割位点。 1．剪刀和透明胶条分别代表哪种“分 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全 子工具”？ 部切开后，将从下面那条DNA链上切下的 2．你制作的黏性末端的碱基能不能互 片段重组到上面那条DNA链的切口处，并 补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？ 用透明胶条将切口粘连起来。 3．你插入的DNA片段能称得上一个基 因吗？ 到社会中去 随着生物技术的飞速发展，生产和销售“分子工具” 的公司大量涌现。感兴趣的话，你可以登录这些公司的网 站，查询和了解相关产品的特点、价格和使用说明等。有 些这样的公司已成功上市，你还可以通过分析公司的股票 价格走势，大致了解公司的经营状况以及投资者目前对该 行业的认可程度。 基因工程操作的部分用品 第1节 重组DNA技术的基本工具 73探究·实践 DNA的粗提取与鉴定 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理 胺试剂的配制方法参见本书附录 2。 和化学性质方面存在差异，可以利用这些 2．用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研 差异，选用适当的物理或化学方法对它们进 钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、 行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些 酒精灯、陶土网、三脚架、火柴、刀 蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初 片和天平等。 步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的 方法步骤 NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 1．称取约30 g洋葱， 的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯 切碎，然后放入研钵中，倒 胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作 入10 mL 研磨液，充分研磨。 为鉴定DNA的试剂。 2．在漏斗中垫上纱布，将 研磨洋葱 目的要求 洋葱研磨液过滤到烧杯中，在 1．了解DNA的物理和化学性质，理解 4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也 DNA粗提取和鉴定的原理。 可以直接将洋葱研磨液倒入塑料离心管 2．学会DNA粗提取的方法以及用二苯 中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取 胺试剂对DNA进行鉴定。 上清液放入烧杯中。 材料用具 3．在上清液中加入体积相等的、预 1．材料：新鲜洋葱（也可以选择香 冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置 蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提 2〜3 min，溶液中出现的白色丝状物就是 取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、 粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌， 体积分数为95%的酒精、2 mol/L的NaCl溶 卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或 液、二苯胺试剂和蒸馏水等。研磨液和二苯 者将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min 练习与应用 一、概念检测 体细胞的载体可以是 （ ） 1．DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种 A．大肠杆菌的质粒 工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ） B．切割DNA分子的酶 A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 C．DNA片段的黏性末端 B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末 D．用来识别特定基因的DNA探针 端，形成磷酸二酯键 C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片 二、拓展应用 段，重新形成磷酸二酯键 1．想一想，为什么限制酶不切割细菌本身 D．只能连接双链DNA片段互补的黏性末 的DNA分子？ 端，不能连接双链DNA片段的平末端 2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片 2．在重组DNA技术中，将外源基因送入受 段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶 74 第3章 基因工程鉴定DNA 用冷却的酒精析出DNA 的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉 鉴定结果 淀物（粗提取的DNA）晾干。 4．取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L 2．你能分析出粗提取的DNA中可能含 的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于 有哪些杂质吗？ 其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两 3．与其他同学提取的DNA进行比较， 支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合 看看实验结果有何不同，分析产生差异的 均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待 原因。 试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的 进一步探究 变化。 本实验只是对DNA进行了粗提取，请 结果分析与评价 查阅资料，了解实验室提取纯度较高的 1．你提取出白色丝状物或沉淀物了 DNA的一种方法，并与本实验中所使用的 吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 方法进行比较，总结两种方法的异同。 Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限 EcoR Ⅴ 5' -GATATC- 3' 制酶的识别序列和切割位点如下。 3' -CTATAG- 5' SpeⅠ 5' -ACTAGT- 3' 3' -TGATCA- 5' XhoⅠ 5' -CTCGAG- 3' 3' -GAGCTC- 5' HindⅢ 5' -AAGCTT- 3' 3' -TTCGAA- 5' （1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段 能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相 XbaⅠ 5' -TCTAGA- 3' 连接？为什么？ 3' -AGATCT- 5' （2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性 末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 第1节 重组DNA技术的基本工具 75第 2 节 基因工程的基本操作程序 从社会中来 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因 抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品 种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会 经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制 转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与 是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 非转基因抗虫棉（右） 本节聚焦 培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛 ● 基因工程的基本操作程序主要 选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 包括哪几个步骤？ 胞、目的基因的检测与鉴定。 ● 基因工程操作的每一步涉及的 技术和方法有哪些？ 第一步：目的基因的筛选与获取 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或 获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要， 目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生 物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。 苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）通过产生苏云金 杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消 化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀 虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫 害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的目的 基因—Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。 那么，如何筛选目的基因呢？ 筛选合适的目的基因 在浩瀚的“基因海洋”中找到所需要的目的基因往往 不容易，从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 是较为有效的方法之一。在培育转基因抗虫棉之前，用苏 云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多 76 第3章 基因工程年历史。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有 关。科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的 相关信息 表达产物—Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。因此，Bt 当Bt抗虫蛋白被分解为多 基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的 随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、 特异性受体结合，导致细胞膜穿 孔，最后造成害虫死亡。Bt抗 序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的 虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱 结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基 性环境中才能表现出毒性，而人 因提供了更多的机会和可能。 和牲畜的胃液呈酸性，肠道细 明确了目的基因后，该怎么获得它呢？ 胞也没有特异性受体。因此，Bt 抗虫蛋白不会对人畜产生上述 利用PCR获取和扩增目的基因 影响。 获取目的基因的方法有多种。在我国首批具有较高抗 虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了 目的基因。现在，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半 保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与 反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 （表3-1）。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆 里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。 表3-1 DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的 相关信息 引物 3'端开始连接脱氧核苷酸 真核细胞和细菌的DNA聚 PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提 合酶都需要Mg2+激活。因此， PCR反应缓冲溶液中一般要添 供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱 加Mg2+。 氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使 引 物 是 一 小 段 能与DNA DNA复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因DNA 母链的一段碱基序列互补配对 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然 的短单链核酸。用于PCR的引 后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸， 物长度通常为20〜30个核苷酸。 第2节 基因工程的基本操作程序 77即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。 由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因 而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形 式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。每次循环一 般可以分为变性、复性和延伸三步（图3-5）。 DNA模板 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 引物 待扩增的DNA片段 变性 当温度超过90 ℃时，双链 复性 当温度下降到50 ℃左右 延伸 当温度上升到72 ℃左右 DNA解聚为单链。 时，两种引物通过碱基互补配对 时，溶液中的4种脱氧核苷酸在 与两条单链DNA结合。 耐高温的DNA聚合酶的作用下， 根据碱基互补配对原则合成新的 DNA链。 图3-5 PCR反应过程示意图 （注：示意图中的引物长度和待扩增的DNA片段的长度均短于实际长度。） 78 第3章 基因工程用PCR可以扩增mRNA吗？ 第一轮循环的产物作为第二轮反 第二轮循环的产物作为第三轮反 应的模板，经过变性、复性和延 应的模板，经过变性、复性和延 伸三步产生第二轮循环的产物。 伸三步产生第三轮循环的产物。 上述过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成， 完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 第2节 基因工程的基本操作程序 79第二步：基因表达载体的构建 获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受 体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因 能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体。这一 步是培育转基因抗虫棉的核心工作。 将生物的所有DNA直接导 基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因 入受体细胞不是更简便吗？如果 外，它还必须有启动子（promoter）、终止子（terminator） 这么做，效果会怎样？ 等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因 的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结 合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达 出人类需要的蛋白质。有时为了满足应用需要，会在载体 中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或 抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使 转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一 段有特殊序列结构的DNA片段。 在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限 制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或 能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段； 再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处， 限制酶切割位点 这样就形成了一个重组DNA分子（图3-6）。 启动子 终止子 目的基因 复制原点 质粒 限制酶切割位点 标记基因 限制酶 限制酶 获取目的基因 连接酶 重组DNA分子 图3-6 基因表达载体构建模式图 第三步：将目的基因导入受体细胞 构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入 80 第3章 基因工程受体细胞。我国科学家采用他们独创的一种方法—花粉 管通道法，将Bt基因导入了棉花细胞。花粉管通道法有 多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的 DNA 溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间 内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基 因借助花粉管通道进入胚囊。除此之外，将目的基因导入 植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。 资料卡 农杆菌转化法 转化（transformation）是指目的基因进 的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的 入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和 转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 表达的过程。 根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能 所区别。例如，可以将新鲜的从叶片上取下的圆 在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而 形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞， 对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细 并再生成植株；可以将花序直接浸没在含有农 胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将 杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得 Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到 种子，再进行筛选、鉴定等。随着转化方法的突 被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色 破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植 体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目 物也取得了成功。 T-DNA 目的基因 Ti质粒 将目的基因插入 染色体DNA中 构建表达载体 含目的基因的 重组Ti质粒 转入农杆菌 导入植物细胞 含重组Ti质粒的农杆菌 植物细胞 表现出新性状的植株 农杆菌转化法示意图 第2节 基因工程的基本操作程序 81第四步：目的基因的检测与鉴定 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗 传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基 因抗虫棉是否培育成功的一步。 首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测棉 花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录 出了mRNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进 行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。 其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通 过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了 棉花抗虫特性以及抗性的程度。 上述培育转基因抗虫棉的四个步骤，其实就反映了基 因工程的基本操作程序（图3-7）。 获取质粒、噬 用限制酶切割载体 检测和鉴定目 菌体等载体 和含有目的基因的 将含有目的基因 的基因是否稳 DNA片段,然后用 的表达载体导入 定维持和表达 筛选和获取目 DNA连接酶连接， 受体细胞 其遗传特性 的基因 构建基因表达载体 图3-7 基因工程的基本操作流程图 在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文 库来获取目的基因，并且由于不同转基因产品所需要的目的 基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基 因表达载体的构建方法不是千篇一律的，将目的基因导入受 体细胞的方法也不是完全相同的。例如，将目的基因导入动 物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入 动物的受精卵中（图3-8），这个受精卵将发育成为具有新 性状的动物。在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细 胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 目前，基因工程已经步入产业化发展阶段，具有巨大 的生产力和发展潜力，我们在充满信心和期待的同时，还 要严格规范操作流程，科学、客观地评估风险，只有这样， 图3-8 研究人员正在进行显微 注射操作 才能让基因工程永葆生机。 82 第3章 基因工程到社会中去 转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农 药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫 对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能。 请你查阅资料，了解以下问题。 1．在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？ 2．科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃 虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？ 练习与应用 一、概念检测 A．PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 1．研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp B．变性过程中双链DNA的解开不需要解 整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番 旋酶 茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关 C．复性过程中引物与模板链的结合遵循碱 表述是否正确。 基互补配对原则 （1） afp基因是培育抗冻番茄用到的目的 D．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 基因。 （ ） 4种核糖核苷酸 （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、 DNA连接酶和核酸酶。 （ ） 二、拓展应用 （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因， 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗 就代表抗冻番茄培育成功。 （ ） 性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有 2．利用PCR既可以快速扩增特定基因，也 4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们 可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误 的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植 的是 （ ） 株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 第2节 基因工程的基本操作程序 83探究·实践 DNA 片段的扩增及电泳鉴定 利用PCR可以在体外进行DNA片段的 目的要求 扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通 1．了解PCR和电泳鉴定的基本原理。 过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 2．尝试进行PCR的基本操作并用电泳 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的 鉴定PCR的产物。 仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 材料用具 DNA分子具有可解离的基团，在一定 PCR仪、微量离心管、微量移液器、一 的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电 次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪、电 荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着 泳槽等）、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2 与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就 种引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、扩增 是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电 缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓 泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率 冲液、琼脂糖和核酸染料等。相关试剂的配 与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等 方参见本书附录 3。 有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以 在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 调节旋钮 推动杆 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 总容积为0.2 mL（左） 琼脂糖凝胶电泳装置 和0.5 mL（右）的微 微量移液器 量离心管 PCR反应体系的配方 方法步骤 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL 1．用微量移液器按照右栏中的配方或 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等 1 μL PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次 量混合液 加入各组分。 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL HO 28〜33 μL 2 1〜5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1〜2 U 模板DNA 5〜10 μL 总体积 50 μL PCR加样操作 注：模板DNA的用量为1 pg〜1 μg。 84 第3章 基因工程2．待所有的组分都加入后，盖严离心 9．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之 管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离 间的距离来设定电压，一般为1〜5 V/cm。待 心约10 s，使反应液集中在管的底部。 指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 3．参照下表的参数，设置好PCR仪的 10．取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 循环程序。将装有反应液的微量离心管放入 PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94 ℃，5 min — — 30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min 最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min 4．根据待分离DNA片段的大小，用电 观察电泳鉴定结果 泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分 注意 数为0.8%〜1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴 1．为避免外源DNA等因素的污染， 或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后， PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏 加入适量的核酸染料混匀。 水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 5．将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具， 2．该实验所需材料可以直接从公司购 并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20 ℃ 6．待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放 子，取出凝胶放入电泳槽内。 在冰块上缓慢融化。 7．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳 3．在向微量离心管中添加反应组分时， 缓冲液没过凝胶1 mm为宜。 每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须 8．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样 更换。 缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液 4．在进行操作时，一定要戴好一次性 器将混合液缓慢注入凝胶 手套。 的加样孔内。留一个加 结果分析与评价 样孔加入指示分子大 1．你是否成功扩增出DNA片段？判 小的标准参照物。 断的依据是什么？ 2．你进行电泳鉴定的结果是几条 条带？如果不止一条条带，请分析产 生这个结果的可能原因。 往凝胶加样孔内加样的操作 第2节 基因工程的基本操作程序 85拓展视野 历史不能忘记中国科学家对PCR 的贡献 PCR从畅想到实现，真的就是穆里斯一 钱嘉韵完成的，是她发现并分离了耐高温的 个人的功劳吗？其实这里也有中国人的贡献。 DNA聚合酶。 1972年，穆里斯在加州大学伯克利分 钱嘉韵是我国台湾的科学家，她是第 校获得有机合成专业博士学位。1979年， 一个报道分离耐高温DNA聚合酶工作的人。 他进入“西特斯”（Cetus）生物技术公司任 1973年，钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提 职，负责合成供实验用的寡核苷酸（短链的 大学生物系，她的导师对在黄石国家公园热泉 DNA分子）。1983年8月，他首次在公司里 中发现的嗜热菌十分好奇，他让钱嘉韵以该菌 做了有关PCR原理的报告，但大家反应冷 作为研究对象。钱嘉韵不负师望，从该菌中成 淡，认为这个原理太简单了，如果可行，早 功地分离了耐高温的DNA聚合酶，并于1976 就有人做了。 年在《细菌学杂志》上以第一作者身份发表 1986年5月，穆里斯经公司主管向沃森 了相关论文。这篇论文在科学界被广泛引用。 推荐，第一次受邀在一次“人类分子生物学” “西特斯”公司的工作人员正是按照钱嘉韵 专题研讨会上做了PCR原理及实验应用的报 等人发明的操作步骤，才成功地分离了这种 告，这形成了先入为主的印象，即PCR是穆 DNA聚合酶，并将其用于PCR。该酶不但专 里斯一人发明的，为此，1993年穆里斯获得 一性和活性优于之前使用的DNA聚合酶，而 了诺贝尔化学奖。然而，将PCR变成真正成 且它使PCR变得十分简捷，大大降低了成本。 熟技术的“临门一脚”，则是由中国科学家 自此，PCR被逐渐推广应用。 美国黄石国家公园的热泉 86 第3章 基因工程第 3 节 基因工程的应用 胰岛素是治疗糖尿病的特效药物。传统生产胰岛素的 方法是从猪、牛等动物的胰腺中提取。曾经生产供一位糖尿 病病人使用一年的胰岛素，需要上千头牛，生产的成本非常 高。1978年，科学家将编码人胰岛素的基因导入大肠杆菌细 胞中，使大肠杆菌表达重组人胰岛素。我国拥有自主知识产 权的基因工程药物—重组人胰岛素已经研制成功并得到广 泛应用。除了生产胰岛素，基因工程还有哪些应用呢？ 重组人胰岛素注射液 基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发 本节聚焦 展，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面，展示出广阔 ● 基因工程的应用有哪些？ ● 怎样理性地看待基因工程在生 的前景。 产和生活中的应用？ 基因工程在农牧业方面的应用 基因工程在农牧业中的应用发展迅速。1996—2017年，全 世界转基因作物的种植面积增加了一百多倍，从1.7×106 hm2 发展到1.898×108 hm2（图3-9）。2016年世界范围的统计 数据表明，转基因作物的种植使化学杀虫剂施用量减少了 8.2%，作物产量增加了6.6×108t，增加经济收益近1.3万亿 元。美国是世界上转基因作物种植面积最大的国家，转基 因棉花、大豆、玉米的种植面积占相关作物种植面积的比 例都超过了90%。2017年，我国转基因作物的种植面积位 居世界第八位，商业化种植的转基因作物有棉花和番木瓜。 在转基因动物方面，近些年几乎每年都有令人瞩目的 图3-9 1996—2017年，全世界转 研究成果报道，有些成果正在进入实用化和商业化开发的 基因作物种植面积变化 阶段。2015年11月，第一种用于食用的转基因动物—转 基因大西洋鲑（俗称“三文鱼”）在美国获得批准上市。 目前，基因工程技术已被广泛用于改良动植物品种、 提高作物和畜产品的产量等方面。 第3节 基因工程的应用 87 物作因基转界世全 ）2mh 601×（/积面植种 从社会中来 200 189.8 100 1.7 0 1996 2017 年份转基因抗虫植物 从某些生物中分离出具有抗 虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性 的作物，是目前防治作物虫害的一种发展趋势。已 问世的转基因抗虫植物有转基因抗虫棉花、玉米、 大豆、水稻（图3-10）和马铃薯等。 图3-10 转基因抗虫水稻（绿色植株）与 对照（被害虫侵害的黄色植株） 转基因抗病植物 许多栽培作物由于自身缺少 抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出抗病 的新品种。科学家将来源于某些病毒、真菌等的抗 病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物，如 转基因抗病毒甜椒（图3-11）、番木瓜和烟草等。 图3-11 转基因 抗病毒甜椒 转基因抗除草剂植物 杂草常常危害农业生产， 而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作 物，导致作物减产。将降解或抵抗某种除草剂的基 因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。这 样在喷洒除草剂时，田间杂草会被杀死而作物不会 受到损伤。目前已经获得转基因抗除草剂玉米（图 3-12）、大豆（图3-13）、油菜和甜菜等。 图3-12 施用除草剂后的转基因抗除草剂玉米田 图3-13 种植转基因抗除草剂大豆的农田 88 第3章 基因工程改良植物的品质 随着生活水平的提高，人们 越来越关注植物的营养价值、观赏价值等，利用转 基因技术可以改良这些品质。例如，将某种必需氨 基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提 高这种氨基酸的含量，科学家培育的某种转基因玉 米中赖氨酸的含量比对照高30%。我国科学家成功 地将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中， 使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了它 的观赏价值（图3-14）。 图3-14 转基因矮牵牛 提高动物的生长速率 由于外源生长激素基因 的表达可以使转基因动物生长得更快，因此科学家 将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。 例如，我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼， 在同等养殖条件下，转基因鲤鱼的生长速率比非转 基因鲤鱼提高了42%〜115%（图3-15）。 图3-15 转生长激素基因的鲤鱼（下） 与非转基因鲤鱼（上） 改善畜产品的品质 有些人由于乳糖酶分泌少， 不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹 泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。我国约有1/3的 成年人对乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家 将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组， 使获得的转基因牛分泌的乳汁中， 乳糖的含量大大降低，而其他营 养成分不受影响。 第第33节节 基基因因工工程程的的应应用用 8899基因工程在医药卫生领域的应用 对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够 生产药物，是目前基因工程取得实际应用成果非常多的领 域。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等，它们 可以用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖 尿病和类风湿关节炎等。我国生产的重组人干扰素、血小 图3-16 我国生产的部分基因 工程药物 板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因 工程药物均已投放市场（图3-16）。 资料卡 干扰素 干扰素是一种具有干扰病毒复制作用 炎、慢性丙型肝炎等。 的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感 染性疾病。此外，干扰素对治疗乳腺癌、淋 巴癌、多发骨髓瘤和某些白血病等也有一定 的疗效。传统生产干扰素的方法是从人血液 中的白细胞内提取，每300 L血液只能提取 出1 mg干扰素。1980—1982年，科学家用基 因工程方法从大肠杆菌及酵母菌细胞内获得 了干扰素，从1 kg培养物中可以得到20〜40 mg 干扰素。1993年，我国批准生产重组人干扰 素α-1b，它是我国批准生产的第一个基因 以侯云德院士（右）为首的研究人员，成功研制出 工程药物，目前主要用于治疗慢性乙型肝 我国第一个基因工程药物—重组人干扰素α-1b 利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药物。 科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子 等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动 物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入 泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称 为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已经 在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、 血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。 基因工程技术还可能使建立移植器官工厂的设想成为 现实。目前，人体移植器官短缺是一个世界性难题。为此， 90 第3章 基因工程人们不得不把目光移向寻求可替代的移植器官。由于猪的 内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似，而且与灵长 类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得 多，是否可以用猪的器官来解决人类器官移植的来源问题 呢？实现这一目标的最大难题是免疫排斥。目前，科学家正 尝试利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是 在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定 基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技 术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 基因工程在食品工业方面的应用 利用基因工程菌除了可以生产药物，还能生产食品工 业用酶、氨基酸和维生素等。例如，阿斯巴甜是一种普遍 使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种 相关信息 氨基酸就可以通过基因工程实现大规模生产。 用基因工程的方法，使外源 奶酪是一种被广泛食用的发酵奶制品。大多数奶酪的 基因得到高效表达的菌类一般称 生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质。传统的制备 为基因工程菌。 凝乳酶的方法是通过杀死未断奶的小牛，然后将它的第四胃 的黏膜取出来进行提取。随着人口的增长和人们饮食需求的 变化，单纯依靠宰杀小牛来获得凝乳酶的方法已不能满足日 益增长的市场需求。于是，科学家将编码牛凝乳酶的基因 导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业 发酵批量生产凝乳酶。用这种方法生产的凝乳酶已于1990 年投入市场，截至2008年，它已占据市场份额的80%以上。 加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品要用到的 脂肪酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术 大量生产。相比从天然产物中提取的酶，用基因工程技术 获得的工业用酶的纯度更高，而且它的生产成本显著降低， 生产效率较高。 基因工程使人们更容易培育出具有优良性状的动植物 品种，获得很多过去难以得到的生物制品，甚至还能培育 出可以降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染， 利用经过基因改造的微生物来生产能源……未来，期待基 因工程带给我们更多的惊喜。 第3节 基因工程的应用 91到社会中去 转基因技术自诞生以来，发展迅速，研发对象已涵盖至少35科、200多种的植物，涉及 大豆、玉米和棉花等重要作物，以及牧草、花卉和林木等。请调查： 1．目前我国批准发放了哪些转基因作物的生产应用安全证书和进口安全证书？ 2．你或你的亲朋好友在日常生活中使用的生物产品，哪些在生产过程中用到了转基因技术？ 练习与应用 一、概念检测 的DNA片段和Ti质粒，构建重组Ti质粒； 1．将大肠杆菌的质粒连接上人生长激素的 2 将重组Ti质粒转入农杆菌中； 基因后，重新导入大肠杆菌的细胞内，再通过发 3 利用含有重组Ti质粒的农杆菌侵染 酵工程就能大量生产人生长激素。下列相关叙述 细胞，再通过培育得到转基因植株； 正确的是 （ ） 4 用草甘膦同时喷洒转基因植株和对照组植株。 A．转录生长激素基因需要解旋酶和DNA连 结果：对照组植株死亡，转基因植株存活， 接酶 但也受到了影响。 B．发酵产生的生长激素属于大肠杆菌的初 结论： 。 生代谢物 （2）请思考并回答下列问题。 C．大肠杆菌获得的能产生人生长激素的变 1 在该实验中，对照组是怎样设计的？ 异可以遗传 2 如果增加转入的外源EPSP合酶基因的数 D．大肠杆菌质粒标记基因中腺嘌呤和尿嘧 量，转基因矮牵牛对草甘膦的抗性是否会增强？ 啶的含量相等 请你给出进一步探究的思路。 2．基因工程应用广泛，成果丰硕。下列不 2．下图是某同学画的两幅基因工程卡通图。 属于基因工程应用的是 （ ） 一幅是一头能进行光合作用的奶牛，一幅是一株 A．培育青霉菌并从中提取青霉素 能同时结出多种蔬菜和水果的植物。请你像这位 B．利用乳腺生物反应器生产药物 同学一样，展开想象的翅膀，畅想基因工程的未 C．制造一种能降解石油的“超级细菌” 来，并用图画、文字或用音乐创作等表达出来。 D．制造一种能产生干扰素的基因工程菌 二、拓展应用 1．除草剂的有效成分草甘膦能够专一地抑 制EPSP合酶的活性，从而使植物体内多种代谢途 径受到影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性， 它在除掉杂草的同时也会使作物受损。解决这个 问题的方法之一就是培育抗草甘膦的作物。 （1）下面是探究“转入外源EPSP合酶基因 能否使矮牵牛抗草甘膦”的流程，请补充完整。 1 用 等处理含有目的基因 92 第3章 基因工程第 4 节 蛋白质工程的原理和应用 从社会中来 你见过用细菌画画吗？右图是用发出不同颜色荧光的 细菌“画”的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为 在它们的体内导入了荧光蛋白的基因。 最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过 改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内 生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。 那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？ 用细菌“画”的画 对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现 本节聚焦 的。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物 ● 蛋白质工程的基本原理是什么？ 功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有 ● 蛋白质工程已有哪些实际的应用？ 蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活 的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基 因工程，是涉及多学科的综合科技工程。 随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展， 蛋白质工程取得了很大的进展。目前，它已成为研究蛋白 质结构和功能的重要手段，并将广泛应用于农业、医药工 业和其他工业生产中。 蛋白质工程崛起的缘由 为什么要进行蛋白质工程的研究呢？我们知道，将一 种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本 不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状，这就是基因工 你知道人类蛋白质组计划吗？ 程的实质。基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋 它与蛋白质工程有什么关系？我国 白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的， 科学家承担了什么任务？ 它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完 全符合人类生产和生活的需要。例如，玉米中赖氨酸的含 量比较低，原因是赖氨酸合成过程中的两种关键酶—天 第4节 蛋白质工程的原理和应用 93冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖 氨酸浓度的影响较大。赖氨酸达到一定浓度就会抑制这两 种酶的活性，所以赖氨酸含量很难提高。如果我们将天 冬氨酸激酶中第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶 二羧酸合成酶中第104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以 使玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍。 蛋白质工程的基本原理 蛋白质工程是怎样进行的呢？蛋白质工程的目标是根 据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设 学科交叉 计改造。由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进 蛋白质工程经常要借助计 行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。 算机来建立蛋白质的三维结构 我们知道，天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进 模型；要制备蛋白质晶体，然 后通过X射线衍射技术，分析 行的：基因→表达（转录和翻译）→形成具有特定氨基酸 晶体的结构；要用到基因的定 序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功 点突变技术来进行碱基的替换。 能。而蛋白质工程却与之相反，它的基本思路是：从预期 的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的 氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因） 或合成新的基因→获得所需要的蛋白质（图3-17）。 设计 推测 改造或合成 预期功能 目的基因 生物功能 行使 折叠 翻译 转录 蛋白质 多肽链 mRNA （三维结构） 图3-17 蛋白质工程的基本思路 思考·讨论 蛋白质工程基本思路的应用 某多肽链的一段氨基酸序列是： 讨论 1．怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷 酸序列？请把相应的碱基序列写出来。 苯丙 …… 丙氨酸 色氨酸 赖氨酸 谷氨酸 …… 氨酸 2．确定目的基因的碱基序列后，怎样才 能合成或改造目的基因？ 94 第3章 基因工程蛋白质工程的应用 异想天开 蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人的前景。研 能不能根据人类需要的蛋白 发速效胰岛素类似物就是生动的实例。天然胰岛素制剂容 质的结构，设计相应的基因，导 易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一 入合适的宿主细胞中，让宿主细 个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。 胞生产人类所需要的蛋白质食 品呢？ 因此，科学家希望对胰岛素进行改造，从而降低它的聚合 作用。研究人员通过解析人胰岛素的晶体结构发现，人胰 岛素由A链和B链构成，其中B链的第20〜29位氨基酸是 胰岛素分子相互作用形成多聚体的关键区域，改变这个区域 氨基酸的组成就有可能降低胰岛素分子间的作用力。目前， 科学家已通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改 造，使B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖 氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，由此研发 出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。 在医药工业方面，利用蛋白质工程研发药物并不少见。 蛋白质食品的工厂化生产想象图 例如，如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，在 一定条件下，可以延长保存时间；小鼠单克隆抗体会使人产 生免疫反应，从而导致它的治疗效果大大降低，科学家将小 鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的抗体上，经过这样 改造的抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。在其他工业 方面，蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业 用酶。例如，枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此 常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。迄今为止，利用蛋白质 工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些 符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价 值。在农业方面，科学家正在尝试改造某些参与调控光合作 用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量；还 有科学家利用蛋白质工程的思路来设计优良微生物农药，通 过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。 蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质 发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往 十分复杂（图3-18）。科学家要设计出更加符合人类需要的 蛋白质，还需要不断地攻坚克难。我们相信，随着科学技术 图3-18 由计算机建立的血红蛋白 的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。 三维结构模型 第4节 蛋白质工程的原理和应用 95到社会中去 酶制剂在食品工业、医药工业等方面都有广泛的应用。现在，酶制剂的生产已经形成一 个市场可观的新兴产业。蛋白质工程的应用又为酶制剂产业的发展提供了强大助力。请查阅 资料，了解我国酶制剂产业发展的现状和趋势，分析蛋白质工程在酶制剂产业中的作用。 练习与应用 一、概念检测 疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第 1．蛋白质工程可以说是基因工程的延伸。判 47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在这 断下列相关表述是否正确。 项替换研究中，目前可行的直接操作对象是 （ ） （1）基因工程需要在分子水平对基因进行操 A．基因 B．氨基酸 作，蛋白质工程不需要对基因进行操作。 （ ） C．多肽链 D．蛋白质 （2）蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有 氨基酸序列。 （ ） 二、拓展应用 （3）蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳 T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在 定性。 （ ） 温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的 2．蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的 耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一 结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到 些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关 的目的是 （ ） 基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变 A．分析蛋白质的三维结构 为半胱氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半 B．研究蛋白质的氨基酸组成 胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热 C．获取编码蛋白质的基因序列信息 性得到了提高。这项工作属于什么工程的范畴？ D．改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满 在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根 足人类的需求 本原因是什么？如果要将该研究成果应用到生产 3．水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治 实践，还需要做哪些方面的工作？ 课外实践 基于网络数据分析基因和蛋白质的序列信息 科研数据共享能够提高科研工作者的 DNA序列和蛋白质序列）进行相似性比较， 工作效率。GenBank是目前国际上广泛使用 或将某个序列与序列数据库中的序列进行快 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 速比对分析的工具。 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用 请你尝试在GenBank中检索几种生物的 这个数据库，我们可以便捷地检索到基因 某个基因和蛋白质的序列信息（如人、猪、 和蛋白质的序列信息。BLAST（Basic Local 牛胰岛素的基因和蛋白质的序列信息）。然 Alignment Search Tool，基本局部比对搜索 后，用BLAST进行比对，并初步分析它们 工具）是一种能对两个或多个序列（包括 之间的差异。 96 第3章 基因工程本章小结 理解概念 ● 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术， 赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的 生物类型和生物产品。 ● 基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶、 DNA 连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括： 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因 导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 ● 基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面有广 阔的应用前景。 ● 蛋白质工程是基因工程的延伸，是指以蛋白质分子的 结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成 基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足 人类生产和生活的需求。蛋白质工程在农业、医药工业及其 他工业生产中有很大的应用价值。 发展素养 通过本章的学习，应在以下两个方面得到发展。 ● 能够基于基因工程应用的事实，运用基因工程的原理， 参与有关推广和应用基因工程产品等社会行为的讨论，理性 地作出个人决策。 ● 认同基因工程给现代农牧业、食品及医药等行业带来 了深刻的变化，产生了巨大的社会效益和经济效益。 97复习与提高 1．某动物体内含有研究者感兴趣的目的基 因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质？ 因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保 （3）选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行 存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、 实验有哪些优势？ LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作 （4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什 步骤如下图所示。 么颜色？为什么？ 2． 科 学 家 将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 LacZ基因 基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中， AmpR 然后在培养ES细胞的培养基上培养这些细胞。 基因 酶切位点 2〜3周后，这些细胞显示出ES细胞的形态、具 质粒 2 用限制酶处理 有活跃的分裂能力，它们就是iPS细胞。请回答 质粒和含有目的 1 获取质粒和含有目 下列问题。 基因的DNA片段 的基因的DNA片段 （1）在这个实验过程中，逆转录病毒的作用 是什么？ 3 连接质粒 （2）如何证明iPS细胞的产生不是由于培养 目的基因 和目的基因 基的作用？ 含有目的基因 的动物细胞 （3）如果要了解Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 基因在诱导产生iPS细胞时，每个基因作用的相 对大小，该如何进行实验？请你给出实验设计的 思路。 （4）若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS 4 将连接产物 细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给 导入大肠杆菌 该病人治病，这是否会引起免疫排斥反应？为什 大肠杆菌 么？iPS细胞具有分裂活性，用它进行治疗时可 能存在什么风险？ 5 在添加了青霉素、X - gal 3．水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需 等成分的培养基上培养大肠杆 要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少 菌，直到形成菌落 施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他 们提出了以下两种方案。 方案一 把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻 根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而 减少氮肥的施用量。 其中一个细菌的纯培养物 方案二 直接将固氮相关基因导入水稻细胞 注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X - gal 中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。 氮，这样就可以免施氮肥了。 请根据以上信息回答下列问题。 （1）请评估这两种方案哪种更容易实现。 （1）在第2步中，应怎样选择限制酶？ （2）如果两个方案都实现的话，你认为哪种 （2）在第3步中，为了使质粒DNA与目的基 更值得推广？请说出你的理由。 98 第3章 基因工程第 4 章 生物技术的安全性与伦理问题 当你去超市购买食品时，看到有的包装袋上有转基因的 标识，你会如何选择？有人说，人类已经成功地克隆了非人 灵长类动物，下一步就是克隆人了，你支持克隆人吗？生物 武器曾经给我国人民带来了深重的苦难，现在生物武器的威 胁依然存在，我们该如何面对……这一系列问题让我们看到 了，生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，会引起人们 对它安全性的关注，也会与伦理道德发生碰撞，带来新的伦 理困惑与挑战。 在人类社会中，伦，是指人与人之间的关系； 理，是道德和规则。伦理特指人与人之间的道德 准则。科技探索之路 生物技术发展与社会进步 1953年，当沃森、克里克构建的DNA双螺 旋结构模型，成功地将生命本质还原到分子水平 来认识时，人类就庄严地宣告生命科学进入了分 没问题！ 子生物学时代。20世纪70年代以后，以基因工程 有问题？ 为代表的一大批生物技术成果，进入人类的生产 和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大 的作用。今天，人类可以利用分子遗传学等方面 的知识和技术，把改造生命的幻想变成现实，传 统的生命观受到了生命科学新观念的强劲冲击。 与其他科学技术一样，生物技术就像一把“双刃 转基因食品 剑”：它既可以造福人类，也可能在使用不当时 给人类带来潜在的危害。面对生物技术可能产生 的负面影响，公众不可避免地产生了疑虑，再加 上媒体宣传的放大效应，一些公众产生了焦虑的 你会选择转基因食品吗？ 情绪和过激的反应，这反过来又影响到生物技术 的正常发展和应用。 当今世界，国力的竞争主要表现为科学技术的 竞争。为了争夺科学技术的制高点，我们应该积极 地面对这些伦理争论，绝不能一味回避。当然，在 这些争论中，科学家起着至关重要的作用。他们除 了要对自己的科学研究行为负责，还应该对社会负 责，即利用他们特殊的知识背景和权威性，向公众 传播正确的科学知识，以引导公众理性地、负责任 地参加讨论。大多数公众的认识一旦取得共识，便 为什么应当禁止克隆人？ 有了立法的基础。而法律和法规又是规范生物技术 研究、防止生物技术滥用的有力武器。由于我国政 治、经济、宗教信仰和传统伦理道德观念等有别于 西方，因此我国对生物技术制定的法律和法规，必 须要符合自己的国情。这就是我们今天要讨论生物 技术的安全性和伦理问题的原因。 110000 第第44章章 生生物物技技术术的的安安全全性性与与伦伦理理问问题题第 1 节 转基因产品的安全性 从社会中来 2016年，中央一号文件《中共中央国务院关于落实发展新 理念加快农业现代化 实现全面小康目标的若干意见》提出：加 强农业转基因技术研发和监管，在确保安全的基础上慎重推广。 同年8月，国务院印发的《“十三五”国家科技创新规划》指出： “十三五”期间要持续攻克转基因关键核心技术，其中包括建成 规范的生物安全性评价技术体系，确保转基因产品安全。目前， 我国已经逐步建立了与国际接轨并适合我国国情的转基因安全评 价体系，这是世界上最严格的安全评价体系之一。近些年来，转 基因产品的安全性已经成为老百姓普遍关心的问题。那么，转基 因产品真的存在安全性问题吗？我们应该如何看待它呢？ 转基因产品是否安全？ 人们对转基因生物安全性的关注，随着转基因成果的 本节聚焦 不断涌现而与日俱增。 ● 我们日常生活中的转基因产品有 哪些？ ● 怎样基于证据和逻辑，看待转 转基因成果令人叹为观止 基因产品的安全性？ 对微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最广泛 和取得实际应用成果最多的领域，这是因为微生物具有生 理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和 容易进行遗传物质操作等优点。例如，转基因技术已被用 来减少啤酒酵母双乙酰（一种啤酒发酵过程中的产物，它 的浓度过高会影响啤酒的风味和口感）的生成，缩短啤酒 的发酵周期；用基因工程技术构建高产、优质的基因工程 菌来生产氨基酸，是目前工业化生产氨基酸的重要途径； 用基因工程菌生产药物同样引人注目，开发成功的基因工 程药物已经几乎涉及各种类型疾病的治疗。2014年，全世界 包括基因工程药物在内的生物技术药物的销售额达1.2万亿元。 转基因动物也有很多成功的例子。科学家将生长激素 基因、促生长激素释放激素基因等转入动物体内，培育了 第1节 转基因产品的安全性 101一批生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜；将某 些抗病毒的基因导入动物体内，培育了抵抗相应病毒的动 物新品种；建立了某些人类疾病的转基因动物模型，模拟 疾病的发生和发展过程，为研究该疾病的致病机制和开发 治疗药物提供依据，如转基因小鼠1型糖尿病模型、转基 因小鼠原发性高血压模型等。 转基因植物的研究成果同样令人兴奋。目前，科学家 已经培育出了大批具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等 新性状的作物。以转基因耐储藏番茄为例，科学家利用转 基因技术显著抑制番茄中乙烯形成酶的活性和乙烯的生成 图4-1 转基因耐储藏番茄（右上） 量，从而育成了转基因耐储藏番茄（图4-1）。2017年，全 和普通番茄（左下） 世界种植转基因作物的国家已达24个。种植面积排名前十 位的国家为美国、巴西、阿根 、加拿大、印度、巴拉圭、 巴基斯坦、中国、南非和玻利维亚，这些国家转基因作物 的种植面积都超过了1×106 hm2（图4-2）。种植的转基因 作物中大豆和玉米最多，其次是棉花和油菜。我国批准发放 了转基因棉花、番木瓜、水稻和玉米等作物的生产应用安全 证书，但截至2017年，只有转基因棉花和番木瓜获准商业化 种植。我国还批准发放了转基因棉花、大豆、玉米、油菜、 甜菜、番木瓜的进口安全证书，但我国进口的基本上是转基 因棉花的纤维，还有这几种作物在国外的直接加工产品。 80 75 70 60 50.2 50 40 30 23.6 20 相关信息 13.1 11.4 10 3 3 2.8 2.7 1.3 0 在转基因研究工作中，科 美 巴 加 印 巴 巴 中 南 玻 国 西 拿 度 拉 基 国 非 利 学家会采取很多方法防止基因污 大 圭 斯 维 坦 亚 染。例如，我国科学家将来自玉 国家 图4-2 全世界排名前十位的种植转基因作物的国家 米的α-淀粉酶基因与目的基因 种植转基因作物的面积 一起转入植物中，由于α-淀粉 硕果累累的转基因成果在带给人们喜悦的同时，也促使 酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉 人们关注转基因生物的安全性问题。实际上，转基因技术及 失去活性，因而可以防止转基因 花粉的传播。 其应用就是伴随着质疑、担忧甚至反对的声音而不断发展的。 102 第4章 生物技术的安全性与伦理问题 ）2mh 601×（/积面植种物作因基转 阿 根对转基因产品安全性的争论 子曰：“君子和而不同，小人同而不和。”“和而不同” 是指：君子要和睦相处，但不随便附和。 当人们面对原本是自然造就的生命形式被人为改造后 具有了全新特征的现实时，出现激烈的争论是正常的。人 们所生活的国家或社会，政治制度、意识形态、宗教信仰、 经济发展水平、历史背景、传统文化和伦理道德观念等的 差异，决定了人们具有不同的价值观取向，因此对于转基 因技术就会产生不同的见解，特别是在转基因食品的安全 性等方面发生激烈的争论。 辩论会 转基因食品是否安全？ 辩论目的：通过辩论使不同的意见能在 品化的法规和政策。在搜集资料的过程中， 一个共同的平台上“殊途同归”，形成共识， 一定要注意区分谣言与事实，区分事实与观 以正确的态度看待转基因食品的安全性。 点；要舍弃矛盾的、不充分的证据，寻找确 辩论方式：设辩论正反方；或者角色扮 凿的证据。 演，如扮演政府官员、科学家、食品供应商 辩论时的注意事项：要精准地运用证据 和消费者等，扮演者从各自角度出发，发表 为自己辩护；要排除无关因素的影响，有序 不同的意见。 地呈现具有说服力的证据；要进行符合逻辑 辩论前的准备：辩论的正反方或者角色 的推理判断；要避免得出言过其实的结论； 扮演者，分别搜集不同国家或地区转基因生 同时，还要善于洞察对方论证的陷阱和漏 物研发和安全评估、转基因食品销售等方面 洞，如识别论证中的逻辑错误等。辩论时， 的资料，以及我国有关转基因生物研究和商 切忌进行人身攻击。 理性看待转基因技术 转基因作为一项技术本身是中性的，由这项技术研发 出来的产品需要经过一系列的安全性评价，符合相应标准 后才能上市。理性看待转基因技术不是人云亦云，更不是 诋毁科学创新、造谣惑众，而是需要以完备的相关科学知 识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程； 还应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化 等因素的影响；最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻 辑进行思考和辩论。社会舆论导向正确了，往往有利于决 策者作出正确的决策，从而促进科学技术的发展；相反， 第1节 转基因产品的安全性 103社会舆论导向不正确，将可能阻碍科学技术的发展。 农业转基因生物安全管理条例 针对转基因技术的应用，各个国家都制定了符合本 （2001年5月23日中华人民共和国国务院令第304号发布 根据2011年1月8日《国务院令关于废止和修改部分行政法规 的决定》修订 国利益的法规和政策。我国对转基因技术的方针是一贯 根据2017年10月7日《国务院关于修改部分行政法规的决定》 修订） 的、明确的，就是研究上要大胆，坚持自主创新；推广 第一章 总则 第一条 为了加强农业转基因生物安全管理，保障 上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监 人体健康和动植物、微生物安全，保护生态环境，促进 农业转基因生物技术研究，制定本条例。 管。国务院颁布了《农业转基因生物安全管理条例》（图 第二条 在中华人民共和国境内从事农业转基因生 物的研究、试验、生产、加工、经营和进口、出口活动， 必须遵守本条例。 4-3）；国家有关部门制定实施了《农业转基因生物安全 第三条 本条例所称农业转基因生物，是指利用基 因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品 加工的动植物、微生物及其产品，主要包括： 评价管理办法》《农业转基因生物进口安全管理办法》《农 （一）转基因动植物（含种子、种畜禽、水产苗种） 和微生物； （二）转基因动植物、微生物产品； 业转基因生物标识管理办法》《农业转基因生物加工审批 （三）转基因农产品的直接加工品； （四）含有转基因动植物、微生物或者其产品成分 办法》和《进出境转基因产品检验检疫管理办法》。这些 的种子、种畜禽、水产苗种、农药、兽药、肥料和添加 剂等产品。 本条例所称农业转基因生物安全，是指防范农业转 法规的制定既维护了消费者对转基因产品的知情权和选择 基因生物对人类、动植物、微生物和生态环境构成的危 图4-3 《 农业转基1 因生物安全管理 权，又最大程度地保证了转基因技术和已经上市的转基因 条例》节选 产品的安全性。我国还成立了专门的国家农业转基因生物 安全委员会，这是我国农业转基因生物安全管理权威的评 价机构，为保障农业转基因生物安全提供重要的技术支撑。 资料卡 农业转基因生物的标识管理 为了加强对农业转基因生物的标识管 “转基因××”。 理，规范农业转基因生物的销售行为，引导 （2）转基因农产品的直接加工品，标 农业转基因生物的生产和消费，保护消费者 注为“转基因××加工品（制成品）”或者 的知情权，我国对农业转基因生物实行了标 “加工原料为转基因××”。 识制度。标识的标注方法如下（摘自《农业 （3）用农业转基因生物或用含有农业转 转基因生物标识管理办法》）。 基因生物成分的产品加工制成的产品，但最 （1）转基因动植物（含种子、种畜禽、 终销售产品中已不再含有或检测不出转基因 水产苗种）和微生物，转基因动植物、微生 成分的产品，标注为“本产品为转基因×× 物产品，含有转基因动植物、微生物或者其 加工制成，但本产品中已不再含有转基因成分” 产品成分的种子、种畜禽、水产苗种、农 或者标注为“本产品加工原料中有转基因××， 药、兽药、肥料和添加剂等产品，直接标注 但本产品中已不再含有转基因成分”。 104 第4章 生物技术的安全性与伦理问题到社会中去 前面，你已经调查了你或你的亲朋好友在日常生活中使 用转基因产品的情况，请继续围绕以下问题进行调查。 1．这些用转基因技术生产的产品，它们的标识符合国家 的规定吗？ 2．是否有商家利用公众对转基因食品“恐惧”的心理， 把“非转基因”作为推销的噱头？ 请根据两次调查的结果，并结合所学的知识，提出自己 参与转基因知识科普服务的行动计划。 思维训练 评估获取证据的难度 转基因食品是否安全是人们争论的焦 以食用。 点。有人说，一种转基因食品，只有证明它 对某种转基因食品而言，证明它安全 是安全的，才可以食用；有人说， 一种转基 与证明它不安全，哪个获取所需证据的难度 因食品，如果没有证据表明它不安全，就可 大？为什么？ 练习与应用 一、概念检测 B．制定相关的技术规程 1．当面对日常生活中与转基因技术有关的话 C．减少农业转基因技术的研发 题时，我们需要理性地表明观点和参与讨论。下 D．成立国家农业转基因生物安全委员会 列不属于理性看待转基因技术的是 （ ） A．要靠确凿的证据和严谨的逻辑来思考转 二、拓展应用 基因技术的影响 以下内容摘自网络某论坛。 B．只要有证据表明产品有害，就应该禁止 可食用的转基因作物一般具有如下特征： 转基因技术的应用 （1）与传统作物的味道不同，例如，传统的 C．要看到经济、文化和伦理道德观念等的 玉米略带甜味，而现在流行的转基因甜玉米的甜 差异使人们对转基因技术有不同的看法 度非常高，像加了蜜一样； D．要在清晰地了解转基因技术的原理和操 （2）与传统作物的色彩不同，如彩椒、紫薯； 作规程的基础上来讨论转基因技术的相关问题 （3）凡是害虫喜欢吃的作物都是非转基因的， 2．我国为保证转基因产品的安全性，采取 而没有害虫或很少有害虫吃的作物，绝对是转基 的措施不包括 （ ） 因的。 A．颁布相关的法规 请你辨析上述说法的可靠性。 第1节 转基因产品的安全性 105第 2 节 关注生殖性克隆人 从社会中来 克隆人是科幻作品中常见的主题。早在1978年，一本名 为《克隆人》（In his Image: THE CLONING OF A MAN）的书 中就讲述了一个科幻故事。一位富商将自己的体细胞核移植 到一枚去核的卵母细胞中，然后将它在体外发育成的胚胎移 植到母体子宫中，最后得到了一个健康的男婴，这个男婴就 是那位商人的克隆人。那么，在现实社会中，克隆人可能会面 临哪些伦理问题？如果科学家要克隆的人是你，你愿意吗？ 关于克隆人的作品 本节聚焦 克隆羊多莉出生后，世界为之轰动。“克隆”一词也 ● 生殖性克隆人可能面临哪些伦 很快成为家喻户晓的“术语”。就在人们庆贺这一重大科 理问题？ 学研究成果的同时，有人又把克隆人的话题提了出来，因 ● 我国为什么禁止生殖性克隆人？ 为在哺乳动物身上获得成功的克隆技术，理论上可以用在人 的身上。于是舆论哗然，有关克隆人的争论也一直持续至今。 生殖性克隆人面临的伦理问题 生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。 治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器 官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而 达到治疗疾病的目的。两者有着本质的区别。 无论是公众还是专家，对是否应该进行生殖性克隆人 的研究有不同的见解。有人认为，这是一项科学研究，既 然是科学，那就有它自己内在的发展规律，社会应该允许 科学家研究；虽然现在人们的伦理道德观念还不能接受这 一切，但是人的观念是可以改变的。 大多数人对生殖性克隆人的研究持否定态度。有的伦 理学家认为，生殖性克隆人“有违人类尊严”。如果允许 人像产品一样被制造，强制一个人共享另一个人的DNA， 106 第4章 生物技术的安全性与伦理问题将使人类的尊严丧失殆尽。还有伦理学家认为，生殖性克 相关信息 隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人， 什么是人类的尊严？目前没 严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用。 有统一的答案。哲学家认为,生命 很多生物学家认为，克隆技术还不成熟，当年做克隆 是自然赋予人类去雕琢的宝石； 有道德的权利尊严，是人的生命 羊研究时，科学家用数百枚卵构建重构胚，才成功地孕育 存在的最高价值；人类尊严的标 出一只克隆羊。而用其他哺乳动物做克隆实验时，也同样 志是人格的不可侵犯…… 出现了构建重构胚成功率低，胚胎移植到母体子宫后着床 率低、流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题， 正常的个体极少。即使有个体活过了幼年期，它们也有可 知识链接 能较早死亡。多莉在7岁时就因患有严重的肺部疾病被研 通过体细胞核移植技术获 究人员实施了安乐死，而在正常情况下，一只绵羊的寿命 得重构胚的方法，见本书第2章 为10〜15年。可以预见，生殖性克隆人同样会面临所有的 第2节。 这些问题：流产、死胎和畸形儿等，这显然与人类传统的 伦理道德是背道而驰的。 思考·讨论 假如克隆人来了，会带来哪些伦理问题？ 请结合上面的内容，思考并讨论以下 2．克隆人没有“父母”，这对他们的心 问题。 理健康有什么影响？ 1．克隆人与细胞核供体之间是什么关 3．能强制克隆人作为器官移植的供体吗？ 系？以血缘为纽带的人伦关系会因克隆人的到 4．生殖性克隆人的研究还可能带来哪些 来而消亡吗？ 伦理问题？ 我国禁止生殖性克隆人 我国政府对克隆技术在伦理、法律等方面可能造成的 影响非常重视，有关部门多次组织各方面专家召开研讨 会，就有关问题达成共识。2002年2月和9月，在联合国总 部召开的制定《禁止生殖性克隆人国际公约》特委会和工 作组会议上，我国代表团指出，中国政府积极支持制定该 公约，坚决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实 验（图4-4）。 图4-4 我国政府积极支持制定 我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不 《禁止生殖性克隆人国 支持、不接受任何生殖性克隆人实验。原因如下：1 克隆 际公约》 第2节 关注生殖性克隆人 107人只是某些人出于某种目的制造出的“产品”，没有“父 母”，这可能导致他们在心理上受到伤害； 2由于技术问 题，可能孕育出有严重生理缺陷的克隆人； 3克隆人的家 庭地位难以认定，这可能使以血缘为纽带的父子、兄弟和 姐妹等人伦关系消亡；4 生殖性克隆人冲击了现有的一些 有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念；5 生殖性克 隆人是对人类尊严的侵犯；6 生殖性克隆人破坏了人类基 因多样性的天然属性，不利于人类的生存和进化。 相关信息 我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主 《 人胚胎干细胞研究伦理指 张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。为此，我国颁 导原则》规定：利用体外受精、 布了《人类辅助生殖技术管理办法》《人类辅助生殖技术 体细胞核移植等技术获得的囊 规范》和《人类辅助生殖技术和人类精子库伦理原则》； 胚，其体外培养期限自受精或 针对干细胞研究，我国制定了《人胚胎干细胞研究伦理指 核移植开始不得超过14 d；不 导原则》和《干细胞临床研究管理办法（试行）》，以保 得将这样获得的已用于研究的 证干细胞的研究在有关规定下进行，并尊重国际公认的生 人囊胚植入人或任何其他动物 的生殖系统。 命伦理准则，促进我国干细胞研究健康发展。 警惕用新技术研究生殖性克隆人 近些年来，干细胞研究取得了一系列重要进展。继外 既然可以用几种小分子化合 国科学家用4种转录因子诱导人的成纤维细胞转变成iPS细 物将体细胞诱导成iPS细胞，那 胞之后，我国科学家又用4种小分子化合物诱导小鼠的成 么将来人类能否通过服用一些药 纤维细胞转变成了iPS细胞（这种细胞又被称为化学诱导多 物，激发机体再生功能，在体内 能干细胞）。这一技术在一定程度上避免了用特定的转录 实现组织或器官的再生，或者 因子诱导iPS细胞可能带来的致癌风险。目前，科学家已 让机体自我修复损伤的组织或 器官？ 经成功用iPS细胞克隆出了活体小鼠，试想一下：如果将 小鼠的iPS细胞换成人的iPS细胞，不就可以克隆人了吗？ 2016年，一批国外的科学家和企业家聚集在一起， 商议“人类基因组编写计划”，希望合成人类的整个基 因组。该计划的支持者认为这将使培育出用于移植的人 体器官成为可能，还会加速疫苗的研发等。计划一经提 出，就引起了伦理方面的担忧：如果合成出人类的基因 组，就可能造出“无父母”人类或者拥有相同基因组的 “克隆人”…… 108 第4章 生物技术的安全性与伦理问题生殖性克隆人问题带来了巨大的伦理挑战。要知道， 现在生物技术革命的浪潮席卷全球，与这些技术相关的伦 理问题还有很多，如从20世纪90年代开始一直讨论的“设 计试管婴儿”的伦理问题。作为社会的成员，我们应该 有客观、理性地参与这些公众事务和问题讨论的意识和 责任感。 思考·讨论 你支持“设计试管婴儿”吗？ 20世纪90年代中期，有一名19岁的姑 大后脸蛋漂亮、身高标准、智力超群的“完 娘患了白血病，需要进行骨髓移植。然而， 美婴儿”呢？ 她唯一的哥哥的骨髓配型并不适合她，在骨 讨论 髓库中也找不到合适配型的骨髓。她的父母 1．为解决不孕夫妇的生育问题而发明的 通过“设计试管婴儿”（植入前对胚胎进行 试管婴儿技术，与“设计试管婴儿”有什么区别？ 遗传学诊断）生下了一个配型适合她的婴 2．通过“设计试管婴儿”救治自己的孩 儿。在婴儿出生2个月后，医生就抽取婴儿 子，是否合乎伦理？ 骨髓中的造血干细胞移植给她，她得救了。 3．你支持“设计试管婴儿”或“设计完 后来，又有一些父母用这种方法挽救了自己 美婴儿”吗？ 患致命贫血病的孩子。 4．提供骨髓中的造血干细胞并不会对婴 随着基因组编辑技术的发展，科学家可 儿的健康造成损伤，同样捐出部分骨髓救治他 以在体内和体外简单、低成本地对基因进行 人也不会给捐献者的身体健康造成损伤。请上 敲除、插入等，这样就可以有目的地改造特 网或通过其他途径查询：这是为什么？你愿意 定基因。2015年，“设计完美婴儿”一词出 为救人一命而捐献一部分骨髓吗？ 现在大众的视野中。我们是否可以设计出长 到社会中去 我国有关部门专门组建了“国家医学伦理专家委员会”，研究涉及人的生物医学研究中 的重大伦理问题，进行伦理培训和指导等。许多医疗卫生机构、高等院校和科研院所等也设 立了伦理委员会，职责是保护受试者的合法权益、维护受试者的尊严、促进生物医学研究规 范开展和进行伦理审查等。伦理委员会的委员应当从生物医学领域和伦理学、法学、社会学 等领域的专家，以及非本机构的社会人士中遴选产生，人数至少为7人，并且应当有不同性 别的委员，少数民族地区应当考虑少数民族委员。 第2节 关注生殖性克隆人 109下面以人干细胞研究为例，介绍伦理委员会组成。 委员会由7〜9名委员组成，委员遴选依据自愿原则，并具有以下代表： （1）本专业人员（如干细胞与发育生物学专业人员） 2〜3名； （2）相关专业人员（如动物学、医学等专业人员） 2〜3名； （3）法学专业人员1〜2名； （4）伦理学专业人员1〜2名； （5）非本机构的社会人士1〜2名。 请与同学围绕以下问题展开讨论。 （1）伦理委员会为什么需要由这些成员组成？ （2）如果未来你有机会加入伦理委员会，你应该怎样履行自己的职责？ 练习与应用 一、概念检测 D．我国政府不赞成、不允许、不支持、不 1．生殖性克隆和治疗性克隆既有相同点，又 接受任何生殖性克隆人实验 有本质的区别。下列相关叙述错误的是 （ ） A．两者都涉及体细胞核移植技术 二、拓展应用 B．前者为了产生新个体，后者为了治疗疾病 2017年，一个外国科研小组宣布，他们通过 C．前者面临伦理问题，后者不会面临伦理 把人的干细胞注入猪的胚胎中，首次成功培育了 问题 人猪嵌合体胚胎。该胚胎在猪体内发育了3〜4周 D．我国允许生殖性克隆动物，但禁止生殖 后，研究人员终止了妊娠。这项研究的最终目的 性克隆人 是在动物体内培育出可供移植的器官，从而解决 2．下列有关生殖性克隆人的叙述，正确的是 人类器官移植来源不足的问题。 （ ） （1）请你分析研究人员为什么在胚胎发育 A．生殖性克隆人能丰富人类基因的多样性 3〜4周后终止了妊娠。 B．可以运用重组DNA技术进行生殖性克隆 （2）如果未来培育出“人兽嵌合体”，它是 人研究 不是也会面临与克隆人一样的伦理问题？ C．虽然生殖性克隆人存在伦理问题，但克 （3）你认为这样的研究应该受到法律约束， 隆技术已经成熟 还是应该彻底禁止？请说出你的理由。 110 第4章 生物技术的安全性与伦理问题第 3 节 禁止生物武器 从社会中来 2001年秋，恐怖分子把含有炭疽杆菌粉末的信件邮 寄给某国的多个新闻媒体办公室以及两名参议员，结果 导致至少22人被感染（其中5人死亡）的严重后果。有 生物学家指出，这些粉末是“武器级”的，它使整个国 家乃至全世界陷入了一种莫名的恐慌之中。为什么生物 武器让人恐慌呢？ 关于生物武器的作品 生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，例 本节聚焦 如，天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌和炭疽杆菌（图 4-5） ● 生物武器有哪些种类？ 都可以用来制造生物武器。生物武器的致病能力强、攻击 ● 历史上生物武器对人类造成了 哪些严重的威胁与伤害？ 范围广。它可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆 ● 我国对生物武器及其技术和设 虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内， 备的扩散持怎样的立场？ 造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 前事不忘，后事之师 早在第二次世界大战中，侵华日军就组建了从事细菌战 的731部队和100部队，并在我国领土上修建了几十座细菌武 器工厂，大量培养鼠疫、霍乱、伤寒和炭疽等一系列致命的 传染性疾病的病原体。为了检验生产出来的细菌武器的效能， 侵华日军曾用数千名中国人做实验。他们还曾在我国20多个 地区使用了细菌武器，造成几十万老百姓死亡。日本战败投 图4-5 电镜下的炭疽杆菌（照 降时，侵华日军又一次把培养的细菌释放出来，在我国造成 片经后期人工上色处 传染病大流行。他们的种种暴行遭到国际舆论的一致谴责。 理，放大约1 000倍） 第二次世界大战后，在日本细菌战战犯的帮助下，美国 获得了细菌武器。1950年12月至1951年1月，在中国人民 志愿军的打击下，美军从“三八线”南撤。在此过程中，他 们散布了大量的天花病毒，使约3 500人患上天花，约350人 第3节 禁止生物武器 111死亡。1952年初，美军又在志愿军控制区投下了细菌弹，散 布了大量苍蝇、跳蚤等昆虫。经我国军事医学专家鉴定，这 些昆虫带有可引起鼠疫、霍乱、伤寒、痢疾、脑膜炎和回 归热等疾病的10多种致病菌。随后，美军又将细菌战扩大 到我国东北的抚顺、安东、凤城、宽甸和临江等地。在反 细菌战战争中，由于中国人民志愿军采取了一系列有力的 应对措施，才避免了军民的重大伤亡（图4-6）。同时，我 图4-6 志愿军在清理细菌战污 染地（左下为细菌弹） 国政府也向全世界控诉美军使用细菌武器的反人类罪行。 思考·讨论 生物武器危害的特点 结合上文，搜集历史上使用生物武器的资 本质差别？ 料，思考并讨论以下问题。 3．生物武器的杀伤力一定大于常规武 1．从传播的角度来看，与枪炮、导弹 器吗？为什么许多国家禁止研发生物武器而 等常规武器相比，生物武器有什么特点？ 不禁止研发常规武器呢？ 2．生物武器和常规武器的危害有什么 对生物武器的威胁，不能掉以轻心 在报纸上，有时可以看到某些国家以科学研究为名， 进行细菌武器、生化毒剂等的研究和储存，如生产和储存 传染性极强、致死率极高的炭疽杆菌。1980年，世界卫生 组织宣布全球消灭了天花，但是某些国家至今仍然保存着 天花病毒毒株。今天，在年轻人普遍都没有接种天花疫苗的 情况下，如果有人用天花病毒或某些动物的痘病毒作为生物 武器，后果将不堪设想！还有一些恐怖组织或个人在试图寻 相关信息 找各种大规模杀伤性武器，而生物武器相对容易获得，也便 生物安全是指国家有效防 于携带和施放，一旦被他们利用，产生的危害将是极大的。 范和应对危险生物因子及相关 转基因技术出现后，使得利用这一技术制造各种新型 因素威胁，生物技术能够稳定 健康发展，人民生命健康和生 的致病菌成为可能。这些人类从来没有接触过的致病菌，可 态系统相对处于没有危险和不 能让大批受感染者突然发病，而又无药可医，这样施放者 受威胁的状态，生物领域具备 便可以造成敌方公众的极度恐慌，致使受害国一切活动瘫 维护国家安全和持续发展的能 痪，轻而易举地达到不战而胜的目的。例如，有报道称，有 力。做好现代口岸核生化有害 的国家已经研制出新型的鼠痘病毒，由于人类目前还没有找 因子（核放射性物质、生物战 到相应的有效治疗药物来对抗这种病毒，因此感染者必死无 剂、化学毒剂等）的防控工作， 可以有力保障国门生物安全。 疑；在实验室里，有人通过转基因技术把蜡状杆菌改造成像 112 第4章 生物技术的安全性与伦理问题炭疽杆菌一样的致病菌；有人将生物毒素分子的基因与流感 病毒的基因拼接在一起，然后再用基因工程的方法进行批 量生产；也有人对流感病毒基因进行改造，以使具有某种 易感基因的民族感染上这种病毒，而施放国的人却不易感 染。面对一切可能的生物武器威胁，我们绝不能掉以轻心！ 彻底销毁生物武器是全世界爱好和平的人民的共同期 望（图4-7）。1972年4月，苏联、美国、英国分别在其 首都签署了《禁止发展、生产、储存细菌（生物）及毒素 武器和销毁此种武器公约》（简称《禁止生物武器公约》）， 该公约于1975年3月生效。1984年11月，我国也加入了这 图4-7 身穿防生化服的人员在 调查炭疽杆菌的污染 一公约。1998年6月，中美两国元首在关于《禁止生物武 器公约》议定书的联合声明中，重申了在任何情况下不发 展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术 和设备的扩散。2010年，在第65届联合国大会上，我国政 府重申支持《禁止生物武器公约》的宗旨和目标，全面、 严格履行公约义务，支持不断加强公约的约束力，并主张 全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。 到社会中去 第二次世界大战期间，日本侵略者在我国许多地方使用过细菌武器。至今，在我国的浙 江等地还有一些健在的日本细菌战受害者遭受着“烂脚病”等疾病的折磨。请你搜集相关资 料，进一步了解细菌战给我国人民带来的苦难。有条件的学校，可组织学生参观军事博物馆 或抗日战争纪念馆，了解更为具体的情况。 练习与应用 一、概念检测 D．人类从没接触过它们，这可能让大批受 1．生物武器种类多样，下列不太可能用于制 感染者突然发病而又无药可医 造生物武器的是 （ ） A．病毒 B．毒品 二、拓展应用 C．致病菌 D．生化毒剂 在2018年世界卫生组织公布的可能导致全 2．利用转基因技术制造的新型致病菌具有 球公共卫生危机的疾病中，有一种神秘的“X疾 极大的危害性，其原因不包括 （ ） 病（Disease X）”，它是由未知病原体造成的大规 A．人体不会对它们产生免疫反应 模流行性疾病，一旦暴发可能导致数百万人死亡。 B．它们可能具有超强的传染性和致病性 你认为这种未知病原体的来源可能有哪些？如果 C．它们可能使具有某种易感基因的民族感 它被恐怖分子用来制造生物武器，将会带来哪些 染，而施放国的人却不易感染 严重的后果？我们能采取哪些措施防患于未然？ 第3节 禁止生物武器 113本章小结 理解概念 ● 转基因技术给人类带来了琳琅满目的产品，也引发了 社会对转基因产品安全性的关注和争论。 ● 生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体， 它面临很多伦理问题。我国不赞成、不允许、不支持、不接 受任何生殖性克隆人实验。 ● 生物武器的种类包括致病菌、病毒和生化毒剂等，它 曾对人类造成严重的伤害。我国反对生物武器及其技术和设 备的扩散。 发展素养 通过本章的学习，应在以下几方面得到发展。 ● 能够基于对转基因技术和相关政策、法规的了解，理 性地参与对转基因技术及其相关问题的讨论，并向公众普及 转基因的基础知识及国家有关的政策和法规。 ● 关注生殖性克隆人引发的伦理争论，认同我国禁止任 何生殖性克隆人研究，并警惕用新技术研究生殖性克隆人。 ● 认同生物武器给人类特别是我国人民带来过严重伤害， 能够坚决支持我国政府反对生物武器及其技术和设备扩散的 立场，做好应对生物武器可能带来灾难的思想和物质准备。 114 第4章 生物技术的安全性与伦理问题复习与提高 1．科学家在培育转基因植物时，常通过农 成功率最高？为什么？ 杆菌的转化作用使目的基因进入受体细胞。据报 （2）科学家进行第2组和第3组实验的目的 道，有科学家检测了291种没有经过人工转基因 是什么？ 操作的栽培番薯，发现这些番薯都含有农杆菌的 （3）基于该实验数据，如果用克隆羊的方法 部分基因，并且在番薯的根、茎、叶等器官中都 来克隆人，存在的伦理问题是什么？ 检测到了相关基因的表达。但是，科学家在番薯 3．2017年8月，科学家运用基因组编辑技术 的近缘野生种中却没有发现这些基因，于是他们 在人类的早期胚胎中部分修正了与肥厚型心肌病 推测，在人类驯化番薯的过程中，这些“天然” 发生相关的基因MYBPC3的突变。这项研究在攻 转入的农杆菌基因促进了一些性状的产生。这一 克用基因组编辑技术治疗人类遗传病的若干技术 事实，对我们认识有关转基因食品的安全性有什 问题的同时，也引起了一些伦理方面的争论。请 么启示？ 分析回答下列问题。 （1）在治疗遗传病方面，与对成年个体进行基因 组编辑相比，对胚胎进行基因组编辑有什么优势？ （2）对人类胚胎进行基因组编辑会带来哪些 伦理问题？ （3）你认为该不该允许对人类胚胎进行基因 组编辑的相关研究？请说出你的理由。 4．1918年暴发的流感使至少2 000万人丧 生。研究人员从保存的受感染的人体中分离了该 病毒，测得它的基因组序列，然后进行了重新构 番薯 建。重构病毒的传染性是现在流感病毒的39 000 2．科学家用电融合的方法诱导母羊的乳腺 倍。了解重构病毒的致病机制能够帮助我们更好 上皮细胞与另一只羊的去核卵母细胞融合，然后 地抵御流感。但是，也有人担心：该病毒一旦泄 将重构胚移植到代孕母羊的体内，最终培育出了 露，可能会造成新的流感大流行；公布的病毒基 克隆羊多莉。下表是科学家获得的部分实验数据， 因组序列和制造病毒的方法可能被某些不法分子 请仔细阅读并回答问题。 用于犯罪。你认为，这项研究是让我们更安全了， （1）根据实验数据综合评价，哪一组实验的 还是更不安全了？ 融合成功 早期发育成功 移植后成功怀孕母羊数/ 出生并成活 实验组 核供体细胞 细胞数 胚胎数 代孕母羊数 羔羊数 6岁母羊的 1 277 29 1/13 1（多莉） 乳腺上皮细胞 发育到第26天的 2 172 34 4/10 2 胚胎成纤维细胞 发育到第9天的 3 385 90 14/27 4 早期胚胎细胞 第3节 禁止生物武器 111155附录 1 植物组织培养实验常用培养基的配方和配制方法 一、MS培养基的配方（1 L的用量） NH NO （硝酸铵） 1 650 mg KNO （硝酸钾） 1 900 mg 4 3 3 KH PO （磷酸二氢钾） 170 mg MgSO ·7H O（七水合硫酸镁） 370 mg 2 4 4 2 CaCl ·2H O（二水合氯化钙） 440 mg MnSO ·4H O（四水合硫酸锰） 22.3 mg 2 2 4 2 ZnSO ·4H O（四水合硫酸锌） 8.6 mg H BO （硼酸） 6.2 mg 4 2 3 3 KI（碘化钾） 0.83 mg Na MoO ·2H O（二水合钼酸钠） 0.25 mg 2 4 2 CuSO ·5H O（五水合硫酸铜） 0.025 mg CoCl ·6H O（六水合氯化钴） 0.025 mg 4 2 2 2 甘氨酸 2 mg 盐酸硫胺素（维生素B ） 0.1 mg 1 盐酸吡哆醇（维生素B ） 0.5 mg 烟酸 0.5 mg 6 肌醇 100 mg 蔗糖 30 g 琼脂 10 g 螯合铁盐* * 螯合铁盐的配制方法：称取5.57 g FeSO ·7H O（七水合硫酸亚铁）和7.45 g 4 2 Na EDTA（乙二胺四乙酸二钠），溶于1 L蒸馏水中，制成螯合铁盐母液。配制1 L培养基 2 需要取螯合铁盐母液5 mL。 二、配制MS培养基的过程 1．配制各种母液。配制时，无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍（MS培 养基的配方参见上表）。激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1 mg/mL的质量 浓度单独配制成母液。用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量。 2．将称好的琼脂加入 800 mL 蒸馏水中，加热使琼脂熔化，然后加入蔗糖30 g，取 配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，再加蒸馏水定容至 1 000 mL，并调节pH。 诱导菊花愈伤组织的培养基：在MS培养基中加入BA（苄基腺嘌呤）和NAA（萘乙酸）， 质量浓度均为0.5 mg/L。 诱导菊花生芽的培养基：在MS培养基中加入BA和NAA，质量浓度分别为2〜3 mg/L 和0.02〜0.3 mg/L。 诱导菊花生根的培养基：将上述 MS培养基中NHNO、KNO、KHPO、MgSO·7HO和 4 3 3 2 4 4 2 CaCl·2HO的用量减半，并添加NAA或IAA（吲哚乙酸），质量浓度均为0.1 mg/L。 2 2 111166 第4章 生物技术的安全性与伦理问题附录 2 DNA 的粗提取与鉴定实验相关试剂的配制方法 一、研磨液的配制方法 1．将10.1 g Tris（三羟甲基氨基甲烷）加入50 mL蒸馏水中，使其溶解。 2．用2 mol/L的HCl溶液调节pH至8.0。 3．在溶液中加入8.76 g NaCl、37.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）、20 g SDS（十二烷基硫酸钠）， 待药品全部溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL。 二、二苯胺试剂的配制方法 1．称取1.5 g二苯胺，溶于100 mL冰乙酸中。 2．在溶液中加入1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存。 3．临用前，在10 mL的上述溶液中再加入0.1 mL体积分数为0.2%的乙醛溶液。 附录 3 琼脂糖凝胶电泳实验相关试剂的配方 表1 电泳缓冲液的配方 缓冲液 工作液 储存液/L 50× 1× Tris-乙酸盐缓冲液 242 g Tris 40 mmol/L Tris-乙酸盐 （TAE） 57.1 mL 冰乙酸 1 mmol/L EDTA 100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 5× 0.5× Tris-硼酸盐缓冲液 54 g Tris 45 mmol/L Tris-硼酸盐 （TBE） 27.5 g 硼酸 1 mmol/L EDTA 20 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 表2 凝胶载样缓冲液的配方 缓冲液编号 6×载样缓冲液 储存温度 0.25% 溴酚蓝 1 0.25% 二甲苯氰FF 4 ℃ 40%（质量体积比）蔗糖水溶液 0.25% 溴酚蓝 2 4 ℃ 40%（质量体积比）蔗糖水溶液 第3节 禁止生物武器 111177后 记 本册教科书是人民教育出版社课程教材研究所生物课程教材研究开发中心依据教育部 《普通高中生物学课程标准（2017年版）》编写的，经国家教材委员会2019年审查通过。 本册教科书的编写，集中反映了我国十余年来普通高中课程改革的成果，吸取了2004年 版《普通高中课程标准实验教科书 生物》的编写经验，凝聚了参与课改实验的教育专家、学 科专家、教材编写专家、教研人员和一线教师，以及教材设计装帧专家的集体智慧。 我们感谢参加2004年版《普通高中课程标准实验教科书 生物》编写工作的吴成军、 吴兢勤、鲍平秋、石家骥、杨柳、王建军、王重力、刘启宪、董莉、张慧、韩玉平、敖光明、 葛荣朝、吴中红、张忠诚。感谢所有对教科书的编写、出版、试教等提供过帮助与支持的同 仁和社会各界朋友。 本册教科书的执笔者还有谭永平；为本书绘制插图的有松迪科技（北京）有限公司、 北京文鲁文化传媒有限公司、李筱甜；为本书设计排版的为北京奇文云海文化传播有限责任 公司。 本册教科书出版之前，我们通过多种渠道与教科书选用作品（包括照片、画作）的作者 进行了联系，得到了他们的大力支持。对此，我们表示衷心的感谢！ 我们真诚地希望广大教师、学生及家长在使用本册教科书的过程中提出宝贵意见。我们 将集思广益，不断修订，使教科书趋于完善。 联系方式 电话：010-58758866 电子邮箱：jcfk@pep.com.cn 人民教育出版社 课程教材研究所 生 物 课 程 教 材 研 究 开 发 中 心 2019年4月谨向为本书提供照片的单位和人士致谢 东方IC（封面1张，第1页1张，第2页1张，第3页3张，第5页2张，第15页1张，第 16页1张，第21页1张，第22页1张，第37页1张，第39页2张，第43页1张，第44页1张， 第46页1张，第51页1张，第53页1张，第56页1张，第64页1张，第67页1张，第82页 1张，第88页2张，第99页1张，第102页1张，第106页1张，第111页2张）； 视觉中国（第2页1张，第4页1张，第5页1张，第9页1张，第31页1张，第34页 1张，第39页1张，第42页1张，第55页1张，第88页1张，第95页1张，第112页1张，第 115页1张）； 华大基因（“科学家访谈”中2张，第69页1张）； 维基百科（第2页1张，第93页1张）； 《回顾与展望》，中国科学技术出版社（第4页1张，第63页1张）； 北京生物制品研究所有限责任公司（第26页1张）； 长春市朝阳大力生物技术工程设备有限公司（第41页1张）； 全景视觉（第62页2张）； 《光辉的十年》，中国科学技术出版社（第76页2张，第90页1张）； 朱京（第3页1张，第6页1张，第7页1张，第9页2张，第11页1张，第15页1张，第 18页1张，第19页1张，第25页2张，第27页1张，第37页1张，第44页1张，第49页1张，第 73页1张，第74页1张，第75页2张，第84页4张，第85页2张，第90页1张，第104页2张）； 王家太（第36页3张，第37页2张）； 仲乃琴（第40页2张）； 钟渝（第42页2张）； 韩之明（第53页3张）； 史娟（第68页1张）； 朱作言（第69页1张，第89页1张）； 李华平（第70页2张）； 宗标（第86页1张）； 曹琳玲（第87页1张）； 朱祯（第88页1张）。普 通普 ® 高 通 普 通 高 中 教 科 书 中 高 课 程中 标 教 准 科 教 科书 书 生 生物学 物 学 选择性必修 3 PUTONG GAOZHONG JIAOKESHU 选 择 SHENGWUXUE 性 生物技术与工程 必 修 3 生 物 技 术 与 工 程 绿绿色色印印刷刷产产品品 定价： 元 生生物物选选择择性性必必修修33封封面面66..00..iinndddd 11 22002200//66//1166 上上午午1100::4499