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[高中生物一轮复习讲义 选修1]
第 31 讲 微生物的培养与应用
考点一 培养基及微生物的纯化培养技术
1．培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(1)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及
特殊营养物质的要求。
(2)种类
①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。
②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。
③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。
④下表为某微生物培养基的成分举例
KH PO NaHPO MgSO ·7H O 葡萄糖 尿素 琼脂 HO
2 4 2 4 4 2 2
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 1 000 mL
该培养基中可以为微生物提供碳源的是葡萄糖，此培养基为固体培养基，因此培养基中加入了琼脂。
2．无菌技术：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。常用方法如下图：
3．大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
①计算
②称量
③溶化
④灭菌
⑤倒平板(2)纯化大肠杆菌
①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的
菌种。
②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。
③常用的微生物接种方法有两种
a．平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到
培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落。
b．稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固
体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而
能在培养基表面形成单个的菌落。
微生物的接种方法
(1)平板划线法：几种划线方法示意图
(2)稀释涂布平板法：10倍系列稀释操作。
①将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。
②进行梯度稀释时，从菌液开始，每次从前一试管中取1 mL 溶液注入到下一试管中混匀。(如图丙)
③进行涂布平板操作。(如图丁)
④纯化微生物的接种方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
操作较麻烦，平板干燥效果不
缺点 不能计数
好，容易蔓延
适用范围 适用于好氧菌 适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
4．菌种的保存方法
(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需pH不同。
(4)认清不同生物需要的营养物质不同
①微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。
②在人和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。
③在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳三类。
2．培养基的成分
营养物质 含义 作用 主要来源
构成生物体的物质，异养生物
无机物：CO2、NaHCO3；有机物：
碳源 能提供碳元素的物质 糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼
的能源物质
等
合成蛋白质、核酸以及含氮代
无机物：N2、NH3、氨盐、硝酸盐；
氮源 能提供氮元素的物质 有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨
谢产物
等
生长必不可少的微量有
生长因子 酶和核酸的成分 维生素、氨基酸、碱基等
机物
细胞生命活动必不可少 不仅是良好的溶剂，还是结
水 培养基、大气、代谢产物
的物质 构物质
提供除碳、氮元素以外 细胞内的组成成分，生理调
无机盐 的各种重要元素，包括 节物质；某些化能自养型细 培养基、大气
某些大量元素 菌的能源；酶的激活剂
3．培养基的分类
种类 特点 应用
液体培养基 不加凝固剂 工业生产
物理性质 微生物的分离、鉴定、
固体培养基 加凝固剂
活菌计数、保藏
天然培养基 含化学成分不明的天然物质 工业生产
化学成分 培养基成分明确或用一定化学
合成培养基 分类、鉴定
物质配制
添加某物质，抑制杂菌生长，
选择培养基 培养分离出
促进所需微生物生长
用途
特定微生物鉴别 根据微生物的代谢特点，在培
鉴别微生物
培养基 养基中加入某种指示剂
4．平板划线操作的注意事项
(1)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要对接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍
需灼烧接种环，每次灼烧目的不同：
①第一次操作目的是杀死接种环上原有的微生物。
②每次划线之间操作目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次
划线的末端，使每次划线菌种数目减少。
③划线结束操作目的是杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(2)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(3)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐
减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(4)划线时最后一区不要与第一区相连。
(5)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
考点二 微生物的筛选和计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无
机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。
①统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1 个活菌。为了保证结果准确，
一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释
倍数。
③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。
用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ，这是因为当两个或多个细胞在一起时，
平板上观察到的只是一个菌落。
(3)实验流程：①土壤取样→富含有机质的土壤表层土
↓
②样品的稀释→通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、
适于计数的平板
↓
③接种→用稀释涂布平板法接种
↓
细菌：30～37 ℃培养1～2天
④培养放线菌：25～28 ℃培养5～7天
霉菌：25～28 ℃培养3～4天
↓
⑤观察→根据菌落的特征区分微生物
↓
⑥计数→统计菌落的数目
↓
⑦计算→根据公式“每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M[C 代表某一稀释度下平板上生长的平均
菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数]”进行计算。
用显微镜直接计数法计数：血细胞计数板法
①结构：常用的是1 mm×1 mm×0.1 mm方格的计数板(如图)。每个计数板上有两个计数室，每个计数
室上刻有9个大方格，其中只有中间的大方格为计数室，大方格的长和宽各为 1 mm，深度为0.1 mm，其
容积为0.1 mm3；大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格，即大方格是由400个小方格组成。
②操作：将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的菌液，滴于盖
玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，充满计数室。
③计数：在显微镜下计数4～5个中方格内的菌体数，求出每个小方格所含有的细菌的平均数，按照以
下公式计算：每毫升原液含有的菌数＝每小格平均细菌数×400×104×原液被稀释倍数。
2．分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C 酶、 C 酶和葡萄糖苷酶。
1 X
②作用
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
土壤取样：富含纤维素的环境
↓
选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
梯度稀释：制备系列稀释液
↓
涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落
3．筛选微生物的两个实例比较
比较项目 土壤中分解尿素的细菌的分离 分解纤维素的微生物的分离
利用以尿素为唯一氮源的选择培养基进 利用富含纤维素的选择培养基进行选
方法
行选择培养 择培养
因为培养基中含有丰富的纤维素，因
只有分解尿素的细菌能够合成脲酶，才
原理 此能够分解纤维素的微生物具有更多
能在以尿素为唯一氮源的培养基上生长
的生存机会而大量繁殖
刚果红染色法，菌落周围出现不变红
在培养基中加入酚红指示剂，指示剂变
鉴定 的透明圈的菌落为分解纤维素的微生
红说明菌落中的菌体为分解尿素的细菌
物的菌落
4．微生物两种计数方法的比较
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长 利用特定细菌计数板或血细
的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活 胞计数板，在显微镜下计算
原理
菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出 一定容积的样品中微生物的
样品中大约含有多少活菌 数量
每克样品中的菌落数：(C÷V)×M
每毫升原液所含细菌数：每
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；
公式 小格平均细菌数×400×10
V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；
000×稀释倍数
M：稀释倍数
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察
缺点 不能区分细胞死活
到的只是一个菌落
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
稀释涂布平板法计数微生物的注意问题
用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在 30～300的平板进行计数。解题时易出现以下误
解：
(1)只得到1个菌落数在30～300的平板①是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶
发因素的影响。(2)得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：
①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”
之间，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。
②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。
可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合
“菌落数在30～300的平板”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。
考点三 微生物的筛选与鉴别
1．纤维素酶
(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，它包括C 酶、C 酶和葡萄糖苷酶。
1 X
(2)作用
2．菌种筛选
(1)方法：刚果红染色法。
(2)原理
纤维素分解菌
↓
刚果红
纤维素酶
→红色复合物――→红色消失、出现透明圈
纤维素
即：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3．筛选流程
土壤取样：富含纤维素的环境
↓
选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量
↓
梯度稀释
↓
涂布平板：将样品涂布于含CR的鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈
4．微生物的鉴别方法
(1)菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等
特征进行鉴别。
(2)指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红
说明该种微生物能够分解尿素。
(3)染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解
纤维素的微生物。5．筛选微生物的三种方法
(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌
落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。
(3)鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。
6．选择培养基四种常见制备方法或实例1．如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：
(1)图甲是利用________法进行微生物接种，图乙是利用________法进行微生物接种。这两种方法所用
的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精
消毒。
(2)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？
________________________________________________________________________
________________________________。
(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？___________________________。
(4)如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填“图甲”或“图乙”)。
2．牛奶是微生物生长的良好培养基。牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物。为检测消毒
前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取 1 mL生牛奶稀释液至盛有9
mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：
(1)巴氏消毒的方法是_____________________________________________________，使用这种方法对
生鲜牛奶进行消毒的好处是________。
(2)取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是下图中的________。
(3)图中所示方法为稀释培养法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法
培养设置了3个培养皿，菌落数分别为 35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为
________个，运用这种方法统计的结果往往较实际值________(填“偏大”或“偏小”)，原因是
_______________________________________________________________________。(4)从生牛奶取样培养得到的菌落中，混有各种杂菌，从中检测大肠杆菌的方法是在培养基中加入
________，菌落具有______________________特征的可以认定为大肠杆菌。
3．莠去津是一种含氮农药，在土壤中不易降解，为修复被其污染的土壤，可按下面程序选育能降解莠去
津的细菌(目的菌)。请据图回答：(已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明)
(1)由图推断，从A瓶到C瓶液体培养的过程称为________，目的是______________。
(2)在将C瓶菌种接种到固体培养基之前通常要进行________，将菌种接种到固体培养基的方法有平板
划线法和________法，从图中看本实验采用的是________(填“前者”或“后者”)。
(3)一段时间后，培养基出现无透明圈和有透明圈两种菌落，我们筛选的目的菌是________菌落中的细
菌，该菌落生长所需的氮元素主要来源于________。
(4)为弄清固体培养基中的非目的菌来自C瓶菌种还是培养基，应如何设置对照组？____________。
4．高温淀粉酶在大规模工业生产中是极为重要的酶制剂。研究者从热泉中筛选出了能高效产生高温淀粉
酶的嗜热菌。其筛选过程如图所示。
(1)进行①过程的目的是________嗜热菌培养液；②过程所使用的接种方法是________。
(2)Ⅰ、Ⅱ号培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是________；对培养基常用________方法
进行灭菌。对于空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能________，如果要
检测灭菌是否彻底，可以采用的方法是：将灭菌过的培养基在适宜的温度下放置一段时间，
________________。
(3)部分嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈；
应挑出透明圈________(填“大”或“小”)的菌落，接种到Ⅱ号培养基。
5．欲从土壤中筛选出能产生脲酶的微生物并予以纯化计数，采用了如图所示的基本操作流程。请回答下
列问题：
(1)取得土样后应先用________(填试剂)对土壤进行梯度稀释，然后将稀释液涂布在平面培养基上，这
种选择培养基在营养组成上的重要特点是__________________。在这样的培养基上长出的细菌________(填
“一定”或“不一定”)都能产生脲酶。若在平板中加入酚红，目的菌落出现的变化是__________________。(2)若要对相应微生物进行计数，一个稀释度应涂布2到3个平板，并计算________。若稀释度不够高，
所得的数据与实际值比较应________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。经涂布获得的菌落可以采用平板
划线法进一步纯化，每次划线后接种环必须________，才能再次用于划线。获得的纯化菌种可以保存在试
管中，塞上棉塞或盖上封口膜，不能密封，原因是______________________。
6．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中
含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的
主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基
________(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用________________法。
(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于
________________________________________________________________________；
使用法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是
________________________________________________________________________。
(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
________________________________________________________________________。
