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热点微练 30 基因工程的操作程序
(时间：15分钟)
1.(2020·云南昆明“三诊一模”)2020年3月16日，中国科学家陈薇院士团队研制的重组新
冠疫苗通过临床研究注册审评，获批进入临床试验。重组新冠疫苗的制备流程如图。回答
下列问题。
(1)步骤②需要 作为原料。步骤③需要的工具酶主要是 。
(2)被用作载体的Ad5应具有的特点是 (答出1点即可)。
(3)步骤④是 。
(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为 ，刺激机体产
生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临
床试验的志愿者需要满足的条件之一是 (填“有”或“无”)SARS－CoV－2感染
史 ， 理 由 是
。
(5)为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，需进一步试验，请写出试验思路：
。
答案 (1)脱氧核苷酸 Taq酶 (2)能自我复制(或有一个或多个限制酶切割位点、有标记基
因位点、对受体细胞无害) (3)基因表达载体的构建 (4)抗原 无 有SARS－CoV－2感
染史的志愿者血清中存在一定量的相应抗体，会对试验结果产生干扰 (5)给不同组志愿者
分别注射不同剂量的疫苗，一段时间后采集血样并检测相应抗体的水平
解析 (1)步骤②为逆转录过程，合成的产物是cDNA，因此需要脱氧核苷酸作为原料。步
骤③为利用PCR技术扩增获得S蛋白基因的过程，该过程需要的酶是 Taq酶(耐高温的
DNA聚合酶)。(2)Ad5作为载体应具有的特点是能自我复制、有多个限制酶切割位点、有标记基因、在宿主细胞中可以存活并表达、对宿主细胞无害等。(3)步骤④为构建目的基因
表达载体的过程，即重组新冠疫苗的过程。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指
导合成的S蛋白可作为抗原，刺激机体产生特异性免疫过程，使机体免疫系统产生能与之
相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的
志愿者需要满足无SARS－CoV－2感染史的条件，即未感染过新冠病毒的志愿者，因为感
染过新冠病毒的人体内含有相应的记忆细胞，若注射疫苗，则会出现二次免疫的特征，即
体内的记忆细胞会迅速增殖分化，产生大量的浆细胞，浆细胞合成并分泌大量的抗体，从
而导致无法检测出该疫苗的真正效果。(5)实验目的为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的
免疫效果，根据实验目的可知，该实验的自变量为疫苗的注射剂量，因变量为抗体产生量
因此设计实验如下：将同性别且年龄相当的志愿者随机分成若干组，然后给不同组别的志
愿者注射不同剂量的疫苗，一段时间之后，检测志愿者体内的抗体产生量，作好记录并进
行比较、分析，从而得出结论。
2.(2020·山东等级考试二模，23)大肠杆菌β半乳糖苷酶(Z酶)可催化底物(Xgal)水解产生蓝色
物质。在pUC18质粒中，lacZ′ 编码Z酶氨基端的一个片段(称为α肽)，该质粒结构及限制
酶识别位点如图甲所示。已知α肽、缺失α肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存
在时就会表现出Z酶活性。利用图乙中的DNA片段与pUC18质粒进行基因工程操作。
(1)限制酶能催化双链DNA分子中 (填化学键名称)的断裂。本实验可使用限制酶
处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段，再通过DNA连接酶连接，获得含目的基因的重组
质粒。
(2)用重组质粒转化大肠杆菌，然后将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的固体培养基上进行培
养，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有 ，在该培养基上不能生
长。从功能上划分，该培养基属于 培养基。
(3)当上述培养基中含有Xgal时，生长出的菌落有蓝色和白色两种类型，其中含有重组质粒
的大肠杆菌的菌落颜色为 ，这是因为_________________________________
________________________________________________________________________。为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌
中Z酶基因应满足的条件是______________________________________。
答案 (1)磷酸二酯键 SalⅠ
(2)氨苄青霉素抗性 选择
(3)白色 目的基因与质粒连接后使lacZ′ 被破坏，不能合成α肽 编码α肽的DNA序列缺
失，其他序列正常
解析 (1)限制酶能催化双链DNA分子中特定部位磷酸二酯键的断裂，将DNA断开。从图
中可知，酶HindⅢ可破坏目的基因，而质粒和目的基因两侧都有酶 SalⅠ识别位点，因此
本实验可使用限制酶SalⅠ处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段。
(2)重组质粒上有氨苄青霉素抗性基因，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具
有氨苄青霉素抗性，在含氨苄青霉素培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于选
择培养基，选择了含重组质粒的大肠杆菌。
(3)从图中可知，重组质粒是用酶SalⅠ分别处理过的质粒和目的基因片段形成的，重组质
粒的lacZ′基因被破坏，不能合成β半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(Xgal)水解产生蓝色物
质，故呈菌落白色。已知α肽、缺失α肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时
就会表现出Z酶活性，为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作
为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是编码α肽的DNA序列缺失，其他序列正
常。
3.(2021·福建福州适应性练习)乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是
番茄细胞内合成乙烯的两个关键酶。利用反义基因技术(原理如图1)，可以抑制这两个基因
的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合
成酶基因的反义基因表达载体的结构示意图。
图1 反义基因技术图2 反义基因表达载体
(1)图2中的2A11为特异性启动子，则2A11应在番茄的 (填器官名称)中表达。
(2)从番茄成熟果实中提取 作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC
合成酶基因，对它们进行拼接构成融合基因并扩增。
(3)合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成
酶基因两端含SacⅠ和Xba Ⅰ的酶切位点，用限制酶 对上述两个基因进行切割后，
再 将 它 们 拼 接 成 融 合 基 因 ， 相 应 的 Ti 质 粒 和 融 合 基 因 均 使 用 限 制 酶
进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。
(4)为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因 (填“正向”或“反向”)插入
启动子2A11的下游即可构成反义融合基因。
(5)在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时， (填“能”或“不能”)用放射性
物质标记的ACC氧化(合成)酶基因片段作探针进行检测，理由是
。
答案 (1)果实 (2)RNA (3)Xba Ⅰ BamH Ⅰ和Sac Ⅰ (4)反向 (5)不能 番茄细胞内
本来就存在ACC氧化(合成)酶基因，能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交
解析 (1)番茄食用的是果实，因此，启动子2A11应在番茄的果实中表达。(2)从番茄成熟
果实中提取RNA作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。(3)
使用限制酶Xba Ⅰ对合成出的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因进行切割后，两种基因
有相同的黏性末端，可将二者拼接形成融合基因。相应的 Ti质粒和融合基因均使用限制酶
BamH Ⅰ和Sac Ⅰ进行切割，然后再连接，可以确保融合基因能够插入载体中。(4)为了
实现图1中反义基因的效果，应将融合基因反向插入启动子2A11的下游。(5)番茄细胞内
本来就存在ACC氧化(合成)酶基因，能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交，因此，
不能用放射性物质标记的ACC氧化(合成)酶基因作为探针进行检测。
4.(2021·辽宁锦州联合校期末)通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：
(1)人体接种乙型肝炎疫苗后，该疫苗可作为 刺激机体发生特异性免疫反应。乙型
肝炎疫苗先后需要接种多次，其目的是 。
(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，则可以推测出相应目的基因的核苷酸序
列 ， 但 推 测 出 的 目 的 基 因 核 苷 酸 序 列 并 不 是 唯 一 的 ， 其 原 因 是
。
(3)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，这一
过程中需要的工具酶主要有 。构建的基因表达载体中，编码乙
型肝炎病毒表面抗原的基因应该位于 之间。
(4)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞时，使该基因在酵母菌细胞中得以
稳定遗传的关键是 。
答案 (1)抗原 使人体产生更多的抗体和记忆细胞 (2)决定氨基酸的密码子具有简并性
(或决定一种氨基酸的密码子往往不是只有一种) (3)限制酶和DNA连接酶 启动子和终止
子 (4)确保编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上
解析 (1)乙型肝炎疫苗可作为抗原引起人体产生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗需先后接
种多次的目的是使人体产生更多的抗体和记忆细胞，以发挥最大的免疫效果。(2)由于
mRNA上的密码子具有简并性，根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的核苷酸序列不
是唯一的，所以推测出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在构建基因表达载体过程中，
需要用限制酶切割目的基因片段与载体，再用 DNA连接酶把目的基因与载体连接起来。
构建的基因表达载体中，启动子和终止子分别是基因表达中转录起始和终止的调控序列，
目的基因需要插在启动子和终止子之间。(4)真核细胞分裂时细胞质DNA随机分配，应将
目的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上，以确保目的基因在酵母菌细胞中稳定遗传。
