分享丨检验检测人必备:高效液相与质谱48个核心知识点速查手册

1.与气相色谱相比，液相色谱不受样品挥发性、热稳定性及相对分子质量的限制，仅需将样品制成溶液即可分析，特别适合分离生物大分子、离子型化合物、不稳定天然产物及高分子化合物。

2.液相色谱的流动相不仅能携带样品沿柱移动，还能与固定相共同与样品分子发生选择性相互作用，为控制分离条件提供额外可变因素；而气相色谱的流动相为惰性气体，仅起运载作用，无亲和力。

具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。

主要包括高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统。

3.流动相使用前必须脱气，常用脱气方法有：低压脱气法（电磁搅拌、水泵抽空，可同时加热或向溶剂吹氮气）、吹氦气脱气法、超声波脱气法等。

4.梯度洗脱：采用两种（或多种）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过极性变化调整被分离组分的分离因素，以提高分离效果。

5.梯度洗脱分类：

高压梯度（内梯度）：先加压后混合，溶剂经高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，混合后送入色谱柱。

低压梯度（外梯度）：先混合后加压，常压下按程序将溶剂混合后，再用泵输入色谱柱。

6.进样系统要求：良好的密封性、最小的死体积、最佳的稳定性，进样时对色谱系统压力、流量影响较小。

7.分离系统：色谱柱是分离核心，由柱管和固定相组成。柱管为直型不锈钢管，一般柱长530cm、内径45mm；凝胶色谱柱内径312mm；制备色谱柱内径可达25mm。淋洗溶剂进入分离柱前通常先通过前置柱。HPLC柱填料颗粒粒径一般为310μm，填充多采用匀浆法；减小填料粒度和柱径是色谱柱的发展趋势，可提高柱效。

8.检测系统作用：连续监测经色谱柱分离后流出物的组成和含量变化。常见检测器包括：紫外-可见吸收检测器、光电二极管阵列检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器。

9.流动相的要求：不与色谱柱发生不可逆化学变化，以保持柱效或保留性质稳定；对待测样品有足够溶解能力；与所用检测器相匹配；粘度尽可能小，以获得较高柱效；纯度高、价格便宜、毒性小。

10.固定相的分类：

按承受压力分：

刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受较高压力，表面可键合各种功能官能团（键合固定相），是目前应用最广泛的固定相。

硬胶：主要用于离子交换色谱法和凝胶色谱法，由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，可承受压力较低。

按孔隙深度分：

表面多孔型：基体为球形玻璃珠，表面涂覆多孔活性物质（硅胶、氧化铝、聚酰胺等）。优点：适用于快速分离、填充均匀紧密、机械强度高、能承受高压，适于简单样品及常规分析；缺点：多孔层薄，进样量受限制。

全多孔型：由硅胶颗粒聚集而成，比表面积大、柱容量大；小颗粒全孔型固定相孔洞浅、传质速率快、柱效高、分离效果好，适合复杂样品、痕量组分分析，是目前HPLC中应用最广泛的固定相。

11.液固吸附色谱法：

原理：以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面活性中心具有吸附能力；试样分子被流动相带入柱内时，与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附，分离过程为吸附-解吸平衡过程。

固定相：通常为硅胶、氧化铝、活性炭等，硅胶最常用。

流动相：极性大的试样需用极性强的洗脱剂，极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。

应用：几何异构体分离和族分离（如农药异构体、石油中烷、烯、芳烃分离）；不适于强极性离子型样品、同系物（对相对分子质量选择性小）。

12.液液分配色谱法：

原理：根据物质在两种互不相溶（或部分互溶）液体中溶解度的不同实现分离，分配系数较大的组分保留值也较大。

流动相：与固定液应尽量不互溶，或极性相差越大越好。按极性差异分为正相分配色谱（流动相极性＜固定相极性，极性小的先流出，适于强极性和中等极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性＞固定相极性，极性大的先流出，适于非极性或弱极性组分分离）。

固定相：由载体和固定液组成，常用固定液有β,β’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鲨烷等。

应用：同系物组分分离（如水解蛋白质生成的氨基酸、脂肪酸同系物分离）。

13.化学键合固定相：

定义：利用化学反应将有机分子键合到载体表面，形成均一、牢固的单分子薄层，构成各种性能的固定相。

特点：固定相不易流失，柱稳定性和寿命较高；能耐受各种溶剂，可用于梯度洗脱；表面均一、无液坑，传质快、柱效高；可键合不同基团改变选择性（如氰基、氨基用于正相色谱，离子交换基团用于离子色谱，C₂、C₈、C₁₈等烷基用于反相色谱），是HPLC理想的固定相。

14.离子交换色谱法：

原理：固定相为离子交换树脂，流动相为水溶液；利用待测样品中各组分离子与离子交换树脂亲和力的不同进行分离。

流动相：水的缓冲溶液；阴离子交换树脂作固定相时采用酸性水溶液，阳离子交换树脂作固定相时采用碱性水溶液。

应用：离子及可离解化合物（如氨基酸、核酸）。

15.凝胶色谱法：

原理：固定相为多孔性凝胶类物质，流动相为水溶液或有机溶剂；根据不同组分分子体积大小分离。小分子可扩散到凝胶空隙，出峰最慢；中等分子仅通过部分空隙，中速通过；大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子最小，最后出峰。全部组分在死体积前出峰，可分离相对分子质量100～10⁵范围内的化合物。

流动相：能溶解样品且与凝胶相似（润湿凝胶、防止吸附）、粘度小（增加扩散速度），常用四氢呋喃、苯、氯仿、水等。

16.影响分离的因素与提高柱效的途径：

液体黏度比气体大100倍，密度为气体的1000倍左右，降低传质阻力是提高柱效的主要途径。

由速率方程可知，降低固定相粒度可提高柱效。

液相色谱中，无法通过增加柱温改善传质。

恒温下改变淋洗液组成、极性是改善分离最直接的因素。

流速大于0.5cm/s时，H～u曲线为斜率不大的直线；降低流速对柱效提升有限，但流量仍是调整分离度和出峰时间的重要参数。

气相色谱的固定液原则上可用于液相色谱，选用原则相同，但HPLC分离柱制备技术要求高，一般不自行制备。

1.质谱法定义：将待测物质置于离子源中电离形成带电离子，离子加速后通过磁场或电场，按质荷比（m/z）大小分离并形成质谱图；依据质谱线位置和相对强度建立的分析方法称为质谱法。

2.质谱的作用：准确测定物质的分子量；是唯一可以确定分子式的方法；根据碎片特征进行化合物结构分析。

3.基本原理：利用电磁学原理，将待测样品分子解离成不同质量的离子，按质荷比（m/z）大小排列收集成质谱。根据分子离子峰（M⁺）获得相对分子质量信息；根据各离子峰（分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰等）及相对强度、氮数规则确定分子式；根据离子峰及化学键断裂规律进行定性和结构分析；根据组分质谱峰高与浓度的线性关系进行定量分析。

4.分析过程：

进样：化合物通过汽化引入电离室；

离子化：电离室中，组分分子被加速电子碰撞，电离形成正离子；

碎片形成：撞击强烈时可形成碎片离子；

离子加速：荷正电离子被加速电压V加速，产生与质量、电荷、加速电压相关的速度v；

离子偏转：加速正离子进入强度为B的磁场（质量分析器），发生偏转分离。

5.核心组成：真空系统、进样系统、离子源或电离室、质量分析器、离子检测器。

6.真空系统的作用：减少离子碰撞损失。若真空度低，会导致：大量氧烧坏离子源灯丝；本底增高干扰质谱图；引发额外离子-分子反应，改变裂解模型，复杂化质谱解释；干扰离子源电子束调节；几千伏高压引发放电。

7.进样系统的目的：高效重复地将样品引入离子源，且不降低真空度。分类包括：

间歇式进样系统：用于气体及低沸点、易挥发液体；

直接探针进样：用于高沸点液体、固体；

色谱进样系统：用于有机化合物。

8.离子源或电离室的作用：使试样中原子、分子电离成离子，其性能影响质谱仪的灵敏度和分辨率。

9.电子电离源特点：电离电压70eV；加小磁场增加电离几率；电离效率高，碎片离子多，结构信息丰富，有标准化合物质谱库；结构简单，操作方便；样品需气态电离，不能汽化的样品无法分析，主要用于气-质联用仪；部分样品得不到分子离子。

10.化学电离源特点：电离能小，质谱峰数少，谱图简单；最强峰为（M+1）⁺准分子离子峰；不适用难挥发试样。

11.快原子轰击源：高能量Xe原子轰击靶上样品，溅射出离子流。适合高极性、大分子量、低蒸汽压、热稳定性差的样品，一般用作磁式质谱的离子源。

12.电喷雾源：

结构：喷嘴（金属毛细管）、雾化气、干燥气；

原理：喷雾蒸发电压作用下电离；

特点：最软的电离方式，仅产生分子离子，无碎片离子；适用于强极性、大分子量样品（如肽、蛋白质、糖）；产生多电荷离子（尤其生物大分子）；主要用于液-质联用仪，兼具接口和电离功能。

13.场致电离源（FI）和场解吸电离源（FD）：分子离子峰强；碎片离子峰少；不适合化合物结构鉴定。

14.基质辅助激光解吸电离特点：准分子离子峰很强，碎片离子少；通常用于飞行时间质谱，特别适合测定多肽、蛋白质、DNA片段、多糖等的相对分子质量。

15.质量分析器的作用：将离子源产生的离子按质荷比（m/z）大小分开。

16.单聚焦分析器：离子的m/z与R、B、V有关；通过改变磁场分离不同离子，一定磁感应强度B下，改变加速电压V可实现质量扫描。特点：结构简单，操作方便；仅方向聚焦，无能量聚焦，分辨率低。

17.双聚焦分析器：实现方向聚焦和能量（速度）聚焦；对动能不同的离子，通过调节电场能达到聚焦。特点：分辨率高。

18.四级杆质量分析器：特点：结构简单，体积小、重量轻，扫描速率快，适合与色谱联机。

19.飞行时间质量分析器：特点：质量范围宽，扫描速率快，无需磁场和电场，仅需直线漂移空间。

20.离子阱质量分析器：特定m/z离子在阱内一定轨道稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器。特点：结构简单、易于操作、灵敏度高。

21.质谱的表示方法：

线谱：常用表示方式，各直线代表离子峰，横坐标为质荷比（m/z），纵坐标为离子相对强度（相对丰度）；以最强离子峰为基峰（相对强度100%），其他峰以对基峰的相对百分值表示，可直观观察质谱全貌。

表谱：表格形式呈现，含质荷比及相对强度，便于定量计算。

22.质谱仪的分辨率（R）：指能区别邻近两个质谱峰的能力；对两个相等强度的相邻峰，当峰间峰谷不大于峰高10%时，认为两峰已分开。

23.质谱图中主要离子峰类型：分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排离子峰。

24.相对分子质量的测定：分子离子峰的m/z相当于化合物的相对分子质量；除同位素离子峰外，分子离子峰是质谱图中最大质荷比的峰，位于最右端。

25.确认分子离子峰的方法：

符合氮数规则：有机化合物含偶数个氮原子或不含氮时，分子离子峰m/z为偶数；含奇数个氮时，m/z为奇数。

与相邻离子峰质量差合理：不可能出现比分子离子峰质量小4～13个质量单位的峰。

利用同位素离子峰比例：含S、Br、Cl时，可通过M⁺、（M+2）⁺等同位素离子峰比例确认。

改变操作条件：采用化学电离源或降低电子轰击源电压，可提高分子离子峰相对强度。

26.气相色谱-质谱联用仪：

技术互补：质谱擅长纯物质结构分析，色谱擅长化合物分离但定性能力差；联用后兼具两者优点（如GC-MS、LC-MS、CE-MS），色谱为质谱的进样及分离系统，质谱为色谱的检测器。

核心问题：接口技术，需除去色谱中大量流动相分子。

适用范围：挥发度低、难气化、极性强、相对分子质量大及热稳定性差的样品。

27.无损检测定义：即非破坏性检测，指在不破坏待测物质原有状态、化学性质的前提下，为获取与待测物品质相关的内容、性质、成分等物理、化学信息所采用的检查方法。

高效液相色谱的精准分离与质谱的高灵敏度定性，共同构成了复杂样品分析的“利器”。从流动相脱气到离子源选择，从分离条件优化到分子离子峰确认，每一个知识点都对应着实操中的质控关键。这份汇总将零散的理论与实操要点系统化，可作为日常实验的速查工具。熟练掌握这些核心内容，能帮助我们更高效地应对各类样品分析需求，让数据更精准、结果更可靠。

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来源：嘉峪检测网