高危神经母细胞瘤（NB）以MYCN扩增为最强预后标志，但其构建免疫抑制微环境（TME）、驱动免疫逃逸的细胞与分子机制尚不清晰。本研究整合bulk RNA‑seq（n=721）、单细胞RNA‑seq（n=9，32363细胞）、质谱蛋白组（n=49）、Visium空间转录组+黑色素瘤外部队列四层公共多组学资源，叠加无监督共识分型、ESTIMATE免疫荒漠全景刻画、Scissor bulk‑单细胞表型投影、CopyKAT/SingleR单细胞图谱、T/B淋巴细胞亚群深度解析、iRegulon转录因子网络+虚拟敲除、CellCall配受体‑TF通讯、空间邻近分析与PPI枢纽鉴定完整分析体系；证实MYCN扩增亚型（Class C）呈典型“免疫荒漠”，T/B淋巴细胞数量显著耗竭且功能重编程；锁定T细胞关键转录因子REL（蛋白组交叉验证，REL抑制剂IT‑901可增强PBMC杀伤约1.45倍）与EOMES（经JASPAR预测调控TRP通道基因介导耗竭）；发现B7免疫抑制性B细胞亚群以MYC为中心发生细胞周期失调，作为信号“接收枢纽”与耗竭T/Treg强化通讯，空间上B7活性区与Treg耗竭区显著邻近并在黑色素瘤队列验证；单细胞+空间+蛋白多组整合，儿童肿瘤免疫微环境方向二区干湿均衡可直接复用的发文框架！

整合基因组与蛋白质组分析揭示了MYCN驱动的特定神经母细胞瘤亚型中T-B淋巴细胞特征，该区域被称为“免疫荒漠”

研究思路解构

1. 多组学数据整合：bulk RNA‑seq 721例（GSE49710+EMTAB8248两队列合并），单细胞RNA‑seq 9例32363细胞（GSE147766），质谱蛋白组49例（PXD018300），Visium空间转录（NB GSE309269 + 黑色素瘤GSE250636外部验证）；
2. bulk无监督聚类分型：HVG筛选→PCA降维→KNN/SNN图→Louvain社区检测→UMAP可视化，划分A‑D四型；ESTIMATE计算免疫/基质/肿瘤纯度，ssGSEA评估28类免疫细胞、TIP七步癌症免疫循环、TISIDB免疫分子活性，HALLMARK‑GSVA解析通路差异；
3. 单细胞图谱构建：Seurat标准流程整合9例样本，CopyKAT推断拷贝数变异区分肿瘤/正常细胞，SingleR自动注释+人工校正，得到T、B、巨噬、NK、内皮、平滑肌、神经元、组织干、肿瘤等10大细胞类型；
4. Scissor表型投影：把bulk定义的Class C vs NOC表型投影到单细胞水平，识别T、B淋巴细胞为“免疫荒漠”中显著减少的关键区分细胞；
5. T淋巴细胞亚群解析：提取11216个T细胞重聚类为11个功能亚群；scCODE差异分析锁定288个DEG；iRegulon预测关键转录因子REL与EOMES；scTenifoldKnk对REL虚拟敲除构建调控网络；EOMES经miRWalk构建ceRNA网络、JASPAR预测TRP基因启动子结合位点；IT‑901抑制REL后PBMC杀伤功能实验；
6. B淋巴细胞亚群解析：提取3445个B细胞重聚类为10个亚群，B7亚群细胞周期失调；HALLMARK通路富集、8个关键转录因子鉴定；CellCall解析T‑B细胞通讯，LR‑TF轴锁定B7内MYC为中心激活网络；16个激活TF中11个关联生存（MYBL2、TCF3高表达提示不良预后）；
7. 空间转录验证与总结：B7核心活性与Treg耗竭信号空间最近邻分析，黑色素瘤外部队列独立验证；PPI网络确认MYC为枢纽；GSVA关联MYC与细胞周期、铁死亡、MAPK通路；汇总三大治疗节点并写明研究局限。

主要结果

图1 多组学队列全景与MYCN驱动的“免疫荒漠”分子亚型Class C鉴定

示意图总览四层组学队列（bulk 721、单细胞、蛋白49、空间转录）。UMAP展示721例bulk样本无监督聚类为A‑D四种分子亚型，两队列样本成功整合，证实分型稳健。ESTIMATE分析显示Class C免疫评分、基质评分显著最低，肿瘤纯度最高；临床特征富集分析表明Class C高度富集MYCN扩增（占全部扩增病例92.75%）与死亡结局（占61.22%）。ssGSEA免疫全景热图证实Class C在28类免疫细胞浸润、癌症免疫循环七步活性、免疫相关分子表达各维度全面下调，确立“免疫荒漠”表型。

图2 T淋巴细胞功能重编程与关键转录因子REL/EOMES解析

Class C T细胞差异分析得到288个显著DEG，热图展示前30个上调基因；ClueGO功能网络显示Rho GTPase循环、趋化因子信号、B细胞受体信号通路显著激活。iRegulon转录因子预测锁定REL与EOMES；REL在多数T细胞亚群广泛上调，质谱蛋白组交叉验证MYCN扩增样本REL蛋白表达显著更高（p<0.05）。scTenifoldKnk虚拟敲除REL后，MALAT1、CXCR4、CCL4、RPS12等基因差异调控显著，REL作为中心节点构建调控网络。功能实验证实REL抑制剂IT‑901预处理可增强PBMC杀伤肿瘤细胞约1.45倍（p<0.05），为“免疫荒漠”T细胞耗竭提供可靶向药物节点；EOMES则经ceRNA网络与TRP通道基因启动子结合位点预测（TRPA1/TRPC1/TRPM1/TRPV1），构成介导T细胞耗竭的生信机制假说。

图3 B淋巴细胞细胞周期失调与关键转录因子网络

Class C B细胞差异分析鉴定505个显著DEG，火山图展示分布；HALLMARK富集显示MYC靶标V1、氧化磷酸化、mTORC1信号通路显著富集。iRegulon预测NFYA、NFYC、E2F1、XBP1、HSF4、FOSL2、PML、E2F6八个关键转录因子。ClueGO网络证明上述转录因子显著参与细胞周期进程、相转变与增殖调控。相关性热图显示8个转录因子与核心细胞周期调控因子广泛相关，提示Class C中B细胞以细胞周期失调为核心功能改变。

图4 T‑B淋巴细胞间免疫抑制性通讯转换，B7亚群成为信号接收枢纽

CellCall通路热图显示Class C中耗竭CD8⁺T（TNF信号）、耗竭CD4⁺T与Treg（趋化因子信号）向B细胞亚群的通讯显著增强；circos图对比Class C与NOC整体通讯网络结构改变。配受体水平分析证实CCL3/4/5‑CCR5/1、CCL20‑CCR6、IL15/23及TNF超家族成员等趋化因子、细胞因子互作显著上调。B7亚群在所有显著差异通路中均作为受体出现，且从NOC时期的信号“发送者”转变为Class C中的主要“接收者”，接收信号总数明显增加，被鉴定为接收耗竭T/Treg抑制信号的免疫抑制枢纽。

图5 LR‑TF轴揭示B7亚群以MYC为中心的激活转录网络

对T9‑B7、T6‑B7、T2‑B7、T3‑B7四对关键通讯组合做配体‑受体‑转录因子轴分析。下游通路分析提示这些转录因子显著参与癌症进展；B7细胞内鉴定出16个激活状态的关键转录因子（MYC、STAT1/3/5、RELA、CREB1、ATF2、TCF3等），其下游靶基因普遍上调。生存分析显示16个转录因子中11个与神经母细胞瘤总生存显著相关，其中MYBL2、TCF3高表达组预后最差；GSVA进一步提示高MYBL2/TCF3样本上调DNA复制等细胞周期通路。

图6 空间转录验证B7‑Treg空间邻近、MYC枢纽鉴定与全文机制整合

NB空间转录切片上B7核心活性评分与Treg耗竭评分主要富集于肿瘤区域并存在部分空间重叠。最近邻距离分析证实B7高活性spot与Treg耗竭spot显著相互邻近。MYC表达主要富集于肿瘤区域，与B7/Treg耗竭相关区域部分重叠；ClueGO确认关键转录因子富集于细胞周期通路，PPI网络将MYC鉴定为最高枢纽蛋白；GSVA显示MYC与细胞周期、铁死亡、MAPK通路相关，细胞周期基因签名在B7亚群表达最高。黑色素瘤独立空间数据集外部验证B7高与Treg耗竭高区域显著共定位（p=0.008），提示该免疫抑制空间模式跨瘤种保守；文末汇总机制模式图，提出REL抑制（功能验证）、EOMES/TRP轴（生信假说）、B7‑MYC通讯枢纽（转录+空间证据）三大治疗节点，并写明样本量有限、EOMES/B7轴缺乏直接扰动实验、空间邻近不等于直接细胞接触等研究局限。

易选团队总结

1. 二区完整多组学‑功能闭环：多队列bulk聚类分型→免疫荒漠全景刻画→单细胞图谱→Scissor表型投影→T/B淋巴细胞亚群功能解析→TF网络+LR‑TF通讯→空间验证+体外功能实验六层递进，完全匹配CNS Neuroscience & Therapeutics二区收稿偏好；
2. 差异化创新：在MYCN驱动的“免疫荒漠”背景下系统性解析T‑B淋巴细胞互作，发现B7免疫抑制性B细胞亚群作为信号接收枢纽的全新角色；把“MYC癌基因”扩展为B7亚群细胞周期失调与免疫抑制通讯的双重驱动；REL抑制具备体外功能验证，EOMES/TRP轴提供可检验的机制假说，空间+黑色素瘤外部验证增强结论稳健性；
3. 复刻门槛适中：全部公共数据库（GEO/ArrayExpress/ProteomeXchange）；Seurat、CopyKAT、Scissor、CellCall、iRegulon、CellChat等全套开源工具；湿实验仅需PBMC+IT‑901共培养杀伤，不需要细胞系工程与动物模型，适合儿科肿瘤、肿瘤免疫临床/基础医生开展生信为主课题；
4. 癌种通用性：其他MYCN/免疫荒漠型实体瘤（如髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤），可直接复用「多组聚类分型‑Scissor投影‑淋巴细胞亚群‑TF网络‑空间邻近验证」整套分析管线；
5. 科研转化提示：“免疫荒漠”不等于免疫细胞单纯缺失，淋巴细胞功能重编程（T细胞耗竭、B7抑制性B细胞）同样关键；REL抑制剂、EOMES/TRP轴、B7‑MYC通讯为神经母细胞瘤免疫治疗提供三个不同层级的干预切入点。

Seurat、CopyKAT、Scissor、CellCall、iRegulon、CellChat、GSVA均为开源R工具；湿实验仅需健康供者PBMC共培养杀伤实验，不需要动物模型。 不会生信分析的科研人员可一站式承接；整套生信代码、PBMC功能实验方案快速落地，快来找小编聊聊吧！