纯生信 5 分 + 模板|NETs 热点!三数据库联合 + 机器学习建模,一套多组学思路直接复用

急性髓系白血病（AML）是克隆性造血干细胞恶性疾病，以未成熟髓系细胞快速增殖为特征。化疗是传统一线方案，但耐药、复发率高，患者总体生存差。 中性粒细胞胞外诱捕网 NETs 是近年国自然热点，由解聚染色质 + 抗菌蛋白构成，参与炎症与肿瘤进展；NETs 可以调控 AML 体内免疫应答，影响患者预后。但调控 NETs 形成的相关基因在 AML 中的预后价值尚不明确。 本研究目的：挖掘 AML 中 NETs 相关预后基因，构建预后模型，解析分子机制，寻找潜在治疗靶点。

数据集：TCGA+GTEx 作为训练集，GEO (GSE71014) 作为外部验证集，正好就是前面推文说的三数据集组合！

1. 数据获取
   TCGA：151 例 AML 样本；GTEx：386 例健康外周血样本；ComBat 校正批次效应合并为训练集；GEO 数据库 GSE71014（104 例骨髓样本）作为外部验证队列；从文献收集 136 个 NETs 相关基因（NRGs）。
2. 一致性聚类 Consensus clustering
   基于 NETs 相关基因表达，对 TCGA 的 151 例 AML 样本进行无监督聚类，划分 AML 分子亚型，K-M 比较不同亚型总生存 OS；ESTIMATE 评估免疫、基质评分。
3. 差异基因筛选
   DESeq2，筛选亚型间差异基因、肿瘤 vs 正常差异基因（|log2FC|>1，校正 P<0.05）；取交集得到 NETs 相关差异基因 NR-DEGs；GO/KEGG 富集分析。
4. 预后模型构建（LASSO，机器学习）
   对 NR-DEGs 做单变量 Cox 回归筛选候选预后基因；LASSO 回归 + 10 折交叉验证，筛选最优基因，计算每位患者风险评分；以风险中位数分为高、低风险组；K-M 生存、时间依赖 ROC 评估模型效能；GSE71014 外部验证模型。
5. 独立预后 + 列线图 nomogram
   单因素、多因素 Cox 回归，验证风险评分是否为 AML 独立预后因子；联合独立预后因子构建 nomogram，校准曲线评估预测准确度。
6. 免疫微环境、免疫检查点、TIDE 分析
   CIBERSORT 算法计算 22 种免疫细胞浸润；比较高低风险组免疫细胞、免疫检查点分子表达差异；TIDE 打分评估免疫治疗潜在响应。
7. GSEA 富集 + 药物预测
   GSEA 解析模型基因相关通路；DGIdb 数据库预测候选基因靶向药物。
8. 统计学
   Wilcoxon 秩和检验，Log-rank 检验，P<0.05 具有统计学意义。

1.NETs 相关基因对 AML 进行分子亚型划分

基于 TCGA 数据库 151 例 AML 患者的基因表达谱，利用 NETs 相关基因开展共识聚类，将患者划分为 Cluster1、Cluster2 两个亚型。采用 Kaplan‑Meier 生存曲线比较两组总生存期（OS），并计算免疫评分、基质评分及 ESTIMATE 评分，Wilcoxon 检验用于组间比较。结果显示 Cluster2 亚型患者 OS 显著更差，免疫评分、基质评分与 ESTIMATE 评分更高，提示该亚型肿瘤微环境的免疫活性更为活跃。（图 1）

2. AML 中 NETs 相关差异表达基因（NR‑DEGs）筛选与功能富集

分别筛选亚型间差异基因 1700 个、AML 肿瘤样本与正常对照样本间差异基因 1941 个；将两组差异基因集合与 136 个 NETs 相关基因取交集，得到 13 个 NR‑DEGs。GO 与 KEGG 富集分析提示，13 个 NR‑DEGs 富集于炎症反应、NETs 形成相关通路，推测其是调控 AML 发生与进展的关键分子。（图 2）

3. 基于 NR‑DEGs 构建并验证 AML 预后风险模型

对 13 个 NR‑DEGs 依次实施单变量 Cox 回归及 LASSO 回归，筛选出 MPO、CCL3、TLR8 三个核心预后基因。根据基因表达水平计算患者风险评分，以评分中位数划分高、低风险组，借助 KM 生存分析与时间依赖 ROC 曲线评估模型效能；选用 GEO 数据库 GSE71014 数据集，经跨平台归一化处理作为外部验证队列。结果表明，训练集与外部验证队列中高风险组 OS 均显著缩短；训练集 1–5 年 AUC 为 0.68–0.76，验证集 AUC 均大于 0.6。基于 MPO、CCL3、TLR8 构建的 NETs 相关预后特征预测性能良好，在独立外部队列中稳定性佳，具有较好泛化能力。

4. AML 独立预后因素识别及列线图构建

将风险评分、性别等临床变量纳入单变量 Cox 回归分析；对 P<0.05 的变量进行 PH 假设检验后开展多变量 Cox 回归，筛选 AML 独立预后因子，据此构建列线图，并采用校准曲线评估预测准确度。结果显示，风险评分与年龄是 AML 的独立预后因素；列线图对患者 1 年、3 年、5 年生存率的预测值与实际生存结局高度吻合，可为临床 AML 个体化预后评估提供直观可靠的评估工具。

5. 核心预后基因的通路富集分析

计算 MPO、CCL3、TLR8 与训练集全部基因的相关性并排序，对 3 个预后基因开展 GSEA 基因集富集分析。结果显示，三者共同富集趋化因子信号通路；MPO、CCL3 同时富集细胞因子‑受体相互作用通路，TLR8 富集 Toll 样受体信号通路。提示 MPO、CCL3、TLR8 可能通过趋化因子信号通路及免疫相关通路参与 AML 发病机制，为 NETs 相关基因的功能机制解析提供分子线索。

6. 高低风险亚组免疫微环境特征及靶向药物预测

采用 CIBERSORT 算法评估高低风险组 22 种免疫细胞浸润丰度，Wilcoxon 秩和检验进行组间比较；同时比较两组 20 个免疫检查点分子的表达水平，并利用 DGIdb 数据库预测潜在靶向药物。结果显示，两组存在 5 种免疫细胞浸润差异，全部 20 个免疫检查点分子表达存在统计学差异；风险评分与免疫功能障碍呈正相关；共预测获得 25 种候选药物。提示 AML 高低风险亚组肿瘤免疫微环境存在明显异质性，预测得到的候选靶向药物可为 AML 个体化治疗提供参考。）

本研究整合公共数据库，基于 NETs 相关基因对 AML 进行分子亚型分类，筛选得到 13 个 NETs 相关差异基因，并从中鉴定出 MPO、CCL3、TLR8 三个核心基因，成功构建并外部验证了 AML NETs 相关预后风险模型。风险评分联合年龄可作为 AML 独立预后指标，基于二者构建的列线图可实现 AML 患者个体化生存预测。通路分析提示这三个核心基因主要参与趋化因子及免疫相关通路；高低风险组在免疫细胞浸润、免疫检查点表达上存在显著差异，同时预测出 25 种潜在靶向药物。综上，NETs 相关基因特征可有效评估 AML 患者预后，其介导的免疫微环境调控有望成为 AML 潜在治疗靶点。