夜雨聆风
引言
ER 阳性乳腺癌肿瘤增殖进展高度依赖 ERα 信号通路，内分泌治疗是其核心治疗方案，但耐药复发是临床主要治疗瓶颈。部分患者会出现他莫昔芬治疗耐药，耐药肿瘤侵袭性更强，临床可选治疗方案有限，亟需全新靶向干预策略。
蟾毒灵（Bufalin）是传统中药蟾酥的核心活性单体，已被证实具备广谱抗肿瘤活性，但具体作用靶点与分子机制尚不明确，制约其成药转化。针对这一痛点，中南大学湘雅医院团队在 Nature Communications 发表研究做出了全新突破。团队依托 AI 靶点筛选、分子动力学模拟与多维度实验验证，证实蟾毒灵为全新的 ERα 分子胶降解剂，可通过稳定 ERα 与 E3 泛素连接酶 STUB1 的结合，促进 ERα 泛素化降解，有效逆转乳腺癌他莫昔芬耐药，为临床耐药治疗提供了全新机制与研究方向。
原名：Harnessing artificial intelligence to identify Bufalin as a molecular glue degrader of estrogen receptor alpha
译名：利用人工智能技术识别蟾毒灵为雌激素受体α的分子胶降解剂
期刊： Nature Communications
影响因子：IF 15.7, Q1
发表时间：2025年8月22日
DOI：10.1038/s41467-025-62288-7
集思慧远专注于药物研发全链条技术服务与一站式服务方案，涵盖AI辅助药物靶点预测、分子对接与虚拟筛选、分子动力学模拟、蛋白-蛋白/ 蛋白-小分子互作验证、体内外药效验证全流程，从课题设计到实验执行全流程技术支撑，助力攻克靶点机制研究与创新药物研发难题
直播预告
核心研究成果拆解
1. AI 多维度靶点筛选 精准锁定核心作用靶点
研究团队首先搭建了多数据库联合筛选的 AI 靶点挖掘体系，研究整合Swiss Target Prediction、SEA、PPB2、ChEMBL33四大主流靶点预测平台，搭配自建FMBS筛选方法，覆盖蟾毒灵潜在作用靶点。通过多平台结果取交集完成初筛，收敛得到53个候选靶点，再经KEGG癌症通路富集分析精简，筛出11个肿瘤相关核心候选靶点。后续经AI预测模型二次筛选，最终锁定ESR为核心作用靶点。
图 1 AI多策略筛选流程锁定蟾毒灵潜在作用靶点
这套分层递进的 AI 筛选流程，规避了单一数据库预测的片面性，通过多轮梯度筛选，将蟾毒灵宽泛的药理活性收敛至 ERα 核心靶点，为后续分子机制解析与靶点验证奠定了研究基础。
2.多实验验证靶向结合 分子动力学模拟锁定核心作用位点
为验证蟾毒灵与 ERα 的特异性靶向结合特性，研究采用体外到细胞内的递进式验证策略，通过多项实验交叉佐证核心结论。SPR 定量检测显示，蟾毒灵与 ERα 具备高特异性结合能力，KD 值达 5.42E−06 M，结合亲和力较其他候选靶点高出数个数量级，从分子水平证实二者靶向互作。Pull-down 实验验证，蟾毒灵可剂量依赖性富集细胞内 ERα 蛋白，游离药物可竞争阻断二者结合，证实结合具备特异性。CETSA 实验显示蟾毒灵可显著提升 ERα 蛋白热稳定性，结合免疫荧光共定位观察到的胞内共定位现象，从蛋白稳定性、细胞空间分布层面进一步夯实互作关系。整套实验体系层层递进，证实了蟾毒灵与 ERα 的直接靶向结合特性，为后续原子层面动态机制解析提供了实验支撑。
图 2 SPR、Pull-down、CETSA和共定位实验证实蟾毒灵直接结合ERα
静态实验仅能证明结合现象，无法解释结合模式与关键作用位点，分子动力学模拟可补足这一短板。研究将蟾毒灵对接至 ERα 活性口袋后，开展分子动力学模拟与 MM-GBSA 结合自由能计算，通过残基能量分解量化各氨基酸的结合贡献，筛选出 Leu354、Leu387、Arg394、Met528、Ala350 等关键结合残基，结合模拟轨迹构象波动分析，明确了各残基在动态结合过程中的稳定作用。
图 3 对接、分子动力学模拟和突变验证共同定位ERα关键结合残基Arg394
后续定点突变实验反向验证模拟结果，证实仅 Arg394 位点突变会导致蟾毒灵与 ERα 的结合能力大幅丧失，同时显著削弱药物介导的蛋白降解效应。这印证了分子动力学模拟的精准性，通过动态模拟结合能量分解，可精准锁定药效核心功能残基，为蟾毒灵的分子结构优化、衍生物设计、成药性改造提供了原子级理论支撑，也是本次研究计算模块的核心价值。
3.阐明降解机制 明确泛素蛋白酶体调控通路
确认蟾毒灵可直接结合 ERα 后，研究团队进一步明确了其对 ERα 的调控模式。实验结果显示，在 MCF-7 和 T47D 两种 ER 阳性乳腺癌细胞中，蟾毒灵可剂量、时间依赖性降低 ERα蛋白水平，且处理后 ERα 的 mRNA 水平无明显变化，说明其并非通过抑制 ESR1 转录发挥作用，而是直接影响 ERα 的蛋白稳定性。
图 4 蟾毒灵剂量和时间依赖性降低 ERα 蛋白水平
为证实蛋白降解过程，团队开展放线菌酮（CHX）追踪实验，结果显示蟾毒灵可显著加速 ERα 蛋白降解进程。蛋白酶体抑制剂 MG-132 可完全阻断蟾毒灵诱导的 ERα 蛋白水平下降，E1 泛素激活酶抑制剂 MLN4924 可显著逆转这一效应，而溶酶体抑制剂羟氯喹（HCQ）无法恢复 ERα 蛋白水平。Co-IP实验证实，蟾毒灵处理后，ERα 的泛素化水平明显增强。
图 5 蟾毒灵加速 ERα 降解，并增强其泛素化修饰
功能层面，蟾毒灵可显著抑制雌激素响应元件（ERE）的荧光素酶活性，下调 AGR2、CCND1、GREB1 等 ERα 下游靶基因的 mRNA 表达。这一系列结果证明，蟾毒灵并非传统 ERα 拮抗剂，而是通过泛素 - 蛋白酶体系统直接降低 ERα 蛋白水平，从源头阻断 ERα 驱动的肿瘤相关转录程序。
图 6 蟾毒灵抑制 ERα 转录活性并下调下游靶基因表达
4.分子动力学模拟解析分子胶机制阐明蛋白互作稳定原理
ERα 的泛素化降解高度依赖 E3 泛素连接酶介导，阐明蟾毒灵如何调控 ERα 与 E3 的互作，是解析其降解机制的关键。研究团队锁定多种与 ERα 降解相关的 E3 泛素连接酶，并通过分子动力学模拟对比蟾毒灵干预前后 E3 蛋白的互作差异。结合自由能计算结果显示，蟾毒灵可特异性重塑 ERα 与 STUB1 的结合能力，二者结合自由能由 - 4.9455 kcal/mol 下降至 - 58.1918 kcal/mol，结合亲和力实现数量级提升，初步证实 STUB1 是蟾毒灵介导 ERα 降解的关键下游 E3 连接酶。
图 7 蟾毒灵增强 ERα–STUB1 结合
为从原子动态层面拆解分子胶作用机制，研究再次开展了200 ns 分子动力学模拟，还原无药物空白体系与蟾毒灵干预体系的构象动态差异。模拟轨迹分析显示，蟾毒灵结合 ERα 核心位点后，可诱导 ERα 产生特异性构象重排，优化 ERα 与 STUB1 的蛋白结合界面。多维度量化模拟分析证实，蟾毒灵可显著提升ERα-STUB1复合物的整体构象稳定性，降低互作界面残基柔性，同时扩大蛋白互作接触面、稳定分子间氢键体系，有效稳固二者的结合状态。整套动态模拟数据，完整还原了蟾毒灵的分子胶核心功能，解释了其强化蛋白互作的原子机制，弥补了静态实验无法观测构象动态变化的短板。
图 8 MD显示ERα-STUB1复合物更稳定
研究后续通过细胞实验对分子动力学模拟揭示的分子胶机制进行功能佐证。沉默 STUB1 可显著提升细胞内基础 ERα 蛋白水平，证实 STUB1 是调控 ERα 稳态的核心 E3 泛素连接酶。Co-IP 实验验证，蟾毒灵可显著促进细胞内源性 ERα 与 STUB1 的蛋白互作；敲低 STUB1 表达后，蟾毒灵介导的 ERα 泛素化降解效应几乎完全消失。
图 9 STUB1参与蟾毒灵诱导的ERα降解
结合前期模拟结果，该研究完整阐明了蟾毒灵的独特作用模式：区别于传统小分子抑制剂的占位阻断机制，蟾毒灵以天然分子胶的形式，通过结合 ERα 触发特异性构象重塑，稳固 ERα-STUB1 互作体系，高效促进 ERα 泛素化修饰与蛋白酶体降解，从原子动态到细胞功能层面闭环阐明了耐药逆转机制。
5.多模型药效验证 证实抗耐药临床潜力
为验证蟾毒灵逆转乳腺癌内分泌耐药的实际疗效，研究开展了多层次体内外药效验证。临床样本分析证实，耐药复发患者肿瘤仍高表达ERα，持续依赖ERα信号驱动进展，说明靶向降解ERα是破解他莫昔芬耐药的有效策略。体外实验表明，蟾毒灵可有效降解ERα，显著抑制耐药肿瘤细胞增殖并诱导凋亡，抗耐药活性优于临床一线降解剂氟维司群。体内耐药移植瘤模型进一步验证，蟾毒灵可显著抑制肿瘤生长、下调瘤内ERα与增殖标志物表达，且治疗剂量下无明显脏器毒性，兼具良好的抗肿瘤药效与生物安全性。
图 10 蟾毒灵在他莫昔芬耐药移植瘤模型中抑制肿瘤生长并降低ERα水平
研究进一步采用临床复发患者肿瘤样本构建PDO类器官模型，模拟真实临床场景验证药效。结果显示，蟾毒灵可有效缩小肿瘤类器官体积、抑制肿瘤细胞活力并诱导细胞死亡，将药效结论从基础细胞动物模型落地至临床样本层面，充分印证了蟾毒灵治疗内分泌耐药乳腺癌的临床转化价值。
图 11 患者来源类器官验证蟾毒灵对他莫昔芬耐药肿瘤的抑制作用
研究总结与价值
本研究最大的创新是突破了天然产物靶点模糊、机制不明的研究瓶颈，依托AI 靶点筛选与分子动力学模拟联用的研究范式，首次证实蟾毒灵为靶向 ERα 的天然分子胶降解剂，构建了 “靶点锁定 - 原子机制解析 - 药效验证” 的完整研究闭环。相较于传统 ERα 拮抗剂和 PROTAC 策略，蟾毒灵作为天然来源小分子，展现出分子胶降解 ERα 的潜力，为 ERα 降解剂开发提供了新的先导骨架与设计方向，同时本研究搭建的多技术联用体系，也为天然产物机制挖掘、蛋白动态构象解析提供了可复用的研究范式。
临床应用层面，研究通过细胞、动物、患者来源类器官多维度模型，证实蟾毒灵可安全、高效逆转乳腺癌他莫昔芬耐药，为 ER 阳性乳腺癌内分泌治疗耐药提供了新的机制解释与潜在干预方向，兼具极高的基础科研创新价值与临床转化前景。
集思慧远专注于药物研发全链条技术服务与一站式服务方案，涵盖AI辅助药物靶点预测、分子对接与虚拟筛选、分子动力学模拟、蛋白-蛋白/ 蛋白-小分子互作验证、体内外药效验证全流程，从课题设计到实验执行全流程技术支撑，助力攻克靶点机制研究与创新药物研发难题
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关于集思慧远
1.基因/转录/蛋白/代谢/微生物等常规高通量组学及单细胞和空间转录组等时空组学；
2.表观组学：WGBS/Ribo-seq/CUT&Tag/ATAC-seq/Hi-c/m6A/m5C/ac4C等各类修饰）的表观遗传研究，助力新靶点发现、药物作用机制研究及疾病表观调控机制探索；
3.蛋白修饰：磷酸化、乙酰化、泛素化、乳酸化、组蛋白甲基化等修饰
4.专业的医学方案整体设计，利用生物信息学对公共数据进行深入挖掘分析，并提供干湿结合实验；
5.新靶点发现及验证服务，通过ABPP/TPP/DARTS等技术加速小分子药物靶点发现；
6.难成药靶点降解剂开发技术PROTAC；
7.基于AI的药物筛选/设计/优化/抑制剂开发等；
8.无需抗体的临近标记（PLA）技术提供蛋白互作研究。
9.纳米材料递送药物系统开发，定制化纳米载体设计与制备，解决药物靶向递送至病灶组织/细胞等药物递送难题。
