夜雨聆风
📁 准备输入文件运行需要两个核心文件：Ranked list 和 Gene set database。
1️⃣ Gene set database (基因集文件)可以选用软件自带的数据库，也可以自定义。自定义格式很简单：一行一个基因名即可，如下演示所示
2️⃣ Ranked list (排序基因列表)这是重头戏！我们需要用Seurat的FindMarkers整理出.rnk文件。直接复制下方代码，替换你的目标细胞群即可运行：保存下来的rnk文件使用左上角的Load data导入
🏃 运行与查看结果检查无误后，点击左下角的 Run！
当左下角状态栏出现绿色的 Success 字样时，点击它就能直接查看丰富的富集结果报告啦！🎉
#out_dir定义下marker <- FindMarkers(seu,ident.1 = "your-cell-of-interest",min.pct = 0.05,logfc.threshold = 0.25,test.use = "wilcox",verbose = TRUE)selected_marker <- marker %>%dplyr::filter(p_val_adj < 0.05)selected_marker$gene <- rownames(selected_marker)ranked_export <- data.frame(gene = selected_marker$gene,avg_log2FC = selected_marker$avg_log2FC)ranked_export <- ranked_export[order(ranked_export$avg_log2FC, decreasing = TRUE), ]write.table(ranked_export,file = file.path(out_dir, "ranked_list.rnk"),sep = "\t",quote = FALSE,row.names = FALSE,col.names = TRUE)cat("Exported ranked list:", nrow(ranked_export), "genes → ranked_list.rnk\n")
🔬 GSEA结果怎么看？
1. 核心统计指标：NES & FDR
- NES (标准化富集分数)
：核心指标！绝对值越大，富集越强。 - NES > 0
：基因集在第一组（如上面定义的ident.1的细胞类型）中上调/富集。 - NES < 0
：基因集在第二组（如其他的细胞）中上调/富集。 - FDR q-value (错误发现率)
：控制假阳性的关键！q < 0.25 通常认为富集显著weibo.com+2。更严格可设为 < 0.05。
2. 显著性判断标准一个结果被认为显著富集，需同时满足：✅ |NES| > 1 (富集信号较强)✅ p值 < 0.05✅ FDR q值 < 0.25
错误发现率（FDR）的统计值（q值）表示该基因集的富集结果为假阳性发现的可能性（例如，若q = 0.25，则意味着发现的富集基因集中有25%可能是假阳性）。
NES的绝对值低于或接近1意味着无富集现象，这与大于0.25的相关q值所证实的结果一致。
3. 可视化解读：条形码图GSEA的“条形码图”直观展示基因集的富集位置：
- 红色区
：基因在第一组中高表达（NES为正时富集侧）。 - 蓝色区
：基因在第二组中高表达。 - 绿色曲线峰值
：对应富集分数（ES），峰值位置越靠边，富集信号越强csdn.net。 - 黑色竖线
：代表基因集内的核心基因（Leading Edge），是驱动富集的关键。
4. 研究中的解读示例
“我们发现，Villani等人定义的DC3特征基因集（Gene Set）在DC3与DC2的比较中，NES = +1.8, FDR q = 0.12。这表明该DC3特征基因集在DC3中显著上调，且结果可靠（q < 0.25）。条形码图显示其核心基因（黑色竖线）紧密聚集在列表右侧（蓝色区），证实了DC3的特异性。”
💡 小贴士：GSEA关注的是基因集的整体协调变化，即使单个基因差异不显著，只要整体趋势一致，也可能得到显著富集结果。这正是它比传统差异基因富集分析更灵敏的原因！结果图如下
参考文献-Transcriptional and Functional Analysis of CD1c+ Human Dendritic Cells Identifies a CD163+Subset Priming CD8+CD103+TCells