夜雨聆风本人编著的《高中生物学疑难知识解惑》丛书在热卖中！全国通用，可提供正规发票，也可以通过文章末的微信小店购买。
问题的提出：下列试题是以腺相关病毒（AAV）基因治疗为背景，综合考查基因工程核心操作工具、载体构建原理及安全性，精准对应高考生物学必修2和选择性必修3热点情境。基因治疗的技术越来越多，不仅仅是我在选择性必修《疑难知识解惑》介绍的CRISPR基因编辑疗法：
昨天在《生物世界》上也看到了报道：在美国，几乎所有患有莱伯氏先天性黑蒙症（婴幼儿先天性遗传性视网膜致盲病，RPE65基因纯合突变→酶完全缺失→视觉循环中断→无法合成感光色素）的患者都已接受了该AAV基因疗法的治疗，世界各地的许多其他患者也正在获得这款疗法。其疗效持久，十多年前接受治疗的患者视力改善情况一直保持稳定。
本文结合试题情境、病毒包装原理、ITR的功能、HEK293细胞工厂、双质粒分工，完整梳理AAV基因增补疗法治愈先天黑蒙症的全过程，打通高考考点、科研原理与真实医学临床。
B．仅导入质粒1即可生产含目的基因的病毒
C．生产出的病毒颗粒中不含有质粒2的基因
D．用病毒载体进行基因治疗没有安全性风险
解析：获取的题干信息：（1）质粒1（包装质粒）：两端为ITR（反向末端重复序列，是一种非编码功能元件），中间插入目的基因。仅两个ITR之间的DNA会被包装到病毒颗粒中。（2）质粒2（包装辅助质粒）：包含复制酶基因和衣壳蛋白基因。提供病毒组装所需的结构蛋白和复制酶，但自身不会被包装。（3）生产流程：将两种质粒共同导入受体细胞（如人胚肾293细胞），利用质粒2表达的复制酶和衣壳蛋白，将质粒1产生的含目的基因的DNA组装成病毒颗粒。
构建两种质粒需要限制酶和DNA连接酶（缝合磷酸二酯键），DNA聚合酶用于 DNA 复制（如PCR、细胞内DNA复制），在此处非必需，A错误；质粒1虽含目的基因和ITR，但缺乏衣壳蛋白基因，无法合成病毒外壳；同时缺乏复制酶基因，无法高效扩增产生病毒DNA，结果仅产生裸DNA，无法形成完整的病毒颗粒，B错误；根据题干注释：“仅两个ITR序列之间的DNA 会被包装到病毒颗粒中”。质粒2上的基因（复制酶基因、衣壳蛋白基因）两侧没有ITR序列，因此不会被识别和包装。病毒颗粒中只含有质粒1的ITR之间的DNA（含目的基因），不含有质粒2的基因，C正确；任何生物技术应用都存在潜在风险，AAV基因疗法也不例外：人体可能存在针对AAV的预存抗体，导致治疗失败或引发炎症；病毒载体可能随机整合入宿主基因组（虽概率极低），干扰正常基因表达；少数病例曾出现严重的肝毒性等副作用，D错误。故答案为C。
AAV基因疗法的原理和步骤
AAV（腺相关病毒）细小病毒科、无包膜单链DNA缺陷病毒，自然界广泛存在，对人类无致病性，需要通过辅助病毒才具有感染特性。目前已经从灵长类AAV中分离出13种不同的血清型，不同的AAV对组织和细胞的感染效果具有差异性，为组织器官的靶向治疗提供基础。重组的AAV具有安全性好、免疫原性低、宿主细胞广泛和体内表达外源性基因时间长的优点，因此被广泛应用于基因治疗、疫苗研究以及疾病模型构建。
经人工改造为重组AAV（rAAV），是目前体内基因治疗全球首选递送载体。下面以治疗莱伯氏先天性黑蒙症（LCA，RPE65基因突变）为例，结合试题的情境，具体说一说AAV基因疗法的过程（示意图如下）。
一、构建两种重组质粒（对应试题原图）
质粒1（目的基因载体质粒）结构：ITR-正常RPE65目的基因-ITR，正常基因两端是ITR（反向末端重复序列），中间插入正常野生型RPE65-目的基因。
质粒2（辅助包装质粒）结构：复制酶基因-衣壳蛋白基因，无ITR序列，负责提供AAV增殖、组装必需的复制酶、病毒外壳衣壳蛋白，自身不进入病毒。
ITR的作用：作为复制酶识别位点，驱动中间目的基因DNA复制；作为病毒包装信号，限定包装范围，仅两个ITR之间的DNA序列被包装进入AAV病毒颗粒；维持病毒基因组稳定，使病毒进入宿主细胞后可游离存在，长期表达目的基因。
二、在HEK293细胞中批量生产AAV病毒
将质粒1、质粒2共同导入HEK293人胚肾细胞：HEK293细胞利用自身转录、翻译系统，表达质粒2上的复制酶和衣壳蛋白；复制酶识别质粒1两端的ITR（反向末端重复序列），启动质粒1中DNA片段的复制；ITR的核心包装作用是仅两个ITR之间的DNA会被包装进病毒颗粒，因此，只有两端ITR夹着的正常RPE65基因，被衣壳蛋白包裹，组装进AAV病毒；质粒2上的复制酶基因、衣壳蛋白基因没有ITR，完全不被包装，始终留在HEK293细胞内；质粒骨架、多余序列全部丢弃。最终细胞裂解，收集、纯化，得到纯净的重组AAV病毒。
成品病毒内部核酸只有ITR-正常RPE65目的基因-ITR，无任何病毒致病基因、无辅助质粒基因。
三、体内治疗：向患者注射AAV病毒
对患者进行视网膜下注射，重组AAV侵染患者的视网膜色素上皮细胞：AAV病毒进入宿主细胞后，依靠两端ITR，在细胞核外以游离环状附加体稳定存在；极少整合进人类染色体，因此安全性高，致癌风险极低。
细胞启动转录、翻译，持续稳定表达正常RPE65蛋白；恢复视觉循环，再生感光色素，修复感光功能，患者视力得到恢复。
总之，莱伯氏先天性黑蒙症由RPE65基因突变致病。先构建含ITR−RPE65−ITR的质粒1和含复制酶、衣壳蛋白基因的质粒2，共转染HEK293细胞；ITR作为包装信号，仅两ITR间的正常RPE65基因被包装进AA病毒，辅助质粒基因不被包装。将纯化的AAV注射入患者眼部，病毒进入视网膜细胞后稳定存在并表达正常蛋白，恢复视觉功能。