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解惑练4 PCR 技术拓展应用
应用1：反向PCR 测定未知DNA 区域
当DNA 的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR 技
术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA 连接酶将获得的酶切产物环化，
这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA 分子。以该已知序列为模板设计一
对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩
增出未知序列。
应用2：PCR 定点突变技术
该技术要使用四条引物。其中引物2 和3 的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，
而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1 和2，引物3
和4 进行PCR 后，得到的DNA 片段可以通过引物2 和3 互补的碱基杂交在一起，再在DNA
聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA 片段。最后，用引物1 和4 进行扩增得到
含有突变位点的DNA 片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
应用3：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR)
先从样本中提取RNA，RNA 中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组
织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA 逆转录为cDNA，并进
行PCR 扩增，在PCR 反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman 探针，该探针为
一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报
告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR 反应时探针与模板
结合，DNA 聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发
出荧光。每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR 仪能够监测出荧光到
达预先设定阈值的循环数(Ct 值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct 值越小(如图)。
跟踪训练
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1．如图所示，在一段未知序列的突变体DNA 片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想
对T－DNA 两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是( )
A．用引物①和引物④直接进行PCR 扩增之后再测序
B．用引物②和引物③直接进行PCR 扩增之后再测序
C．用DNA 连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR 扩增后测序
D．用DNA 连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR 扩增后测序
答案 C
解析 直接选用引物①、④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A 错误；
用引物②和引物③可实现对已知的T－DNA 序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D 错误；
用DNA 连接酶连接成环状后，用引物①④PCR 扩增后测序，恰好可扩增出T－DNA 两侧
的未知序列，C 正确。
2．重叠延伸PCR 技术是采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成重叠链，从而在随后
的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR 技
术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错
误的是( )
A．过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA 模板、引物、4 种脱氧核苷酸、耐高温的DNA 聚合
酶等
B．若引物1、引物2 组成的反应系统和引物3、引物4 组成的反应系统中均进行一次DNA
分子的复制后，一共会产生2 种DNA 分子
C．经过程④获得的杂交DNA 有2 种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因
D．过程⑤使用耐高温的DNA 聚合酶延伸，不需要引物
答案 B
解析 过程②为PCR 反应，需要在添加了Mg2 ＋的缓冲液中才能进行，需要提供模板
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DNA、分别与两条模板链结合的引物、4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA 聚合酶等，A 正确；
两个反应系统中各自形成两种DNA 分子，但由于引物1 和引物4 形成两个与原DNA 相同的
DNA 分子，所以含有引物1 和4 的DNA 属于同一种DNA，故总共形成3 种DNA 分子，B
错误；过程④获得的杂交DNA 有2 种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单
链的杂交DNA 为所需DNA，C 正确；过程⑤是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA 聚合
酶进行催化，不需要引物，D 正确。
3．(2023·北京顺义区高三检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生
插入、删除、置换、重排等变异。下图甲是一种PCR 介导的基因定点突变示意图，图乙是
研究人员利用基因M1 构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：
(1)进行基因定点突变的PCR 反应体系中，除加入引物和模板DNA 外，一般还需要加入
______________________________；图甲所示的基因定点突变技术需要________次PCR；
获得产物A 需要的引物是____________。
(2)研究人员对PCR 的中间产物A、B 进行纯化后，利用图中相关酶对基因M 和产物A、B
进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为
____________，基因M1 的长度为____________。
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项目
基因M
A
B
长度
3.24、2.8、0.15、0.13
2.8、0.09
3.24、0.05
(3)通过图甲过程获得的基因M1 仍需要大量扩增，此时选择的引物是______________，为了
与图乙中的Ti 质粒相连，还需要分别在它们的______端引入限制酶___________的识别序列。
(4)构建基因表达载体时，M1 基因必需插入到Ti 质粒的______________中，原因是
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。
答案 (1)Taq DNA 聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等 3 引物1 和引物3 (2)0.23 kb 6.09
kb (3)引物1 和引物2 5′ HindⅢ、PstⅠ(顺序应与前面的引物对应) (4)T－DNA Ti
质粒上的T－DNA 能够转移并整合到受体细胞的染色体上
解析 (1)进行基因定点突变的PCR 反应体系中，除加入引物和模板DNA 外，一般还需要
加入TaqDNA 聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等。从图甲可以看到，从加入引物到获得基因
M1 总共经历了3 次PCR。产物A 的两端互补的引物是引物1 和3。(2)基因M 上有3 个酶切
位点(箭头处)，完全酶切产生4 个片段，分别为3.24 kb、2.8 kb、0.15 kb、0.13 kb，共6.32
kb，A 片段酶切后产生2 个片段，分别为2.8 kb、0.09 kb，B 片段酶切后产生2 个片段，分
别为3.24 kb、0.05 kb，图中A 片段和B 片段的“……”是相同的，因此“……”处为0.05
kb，则基因M1 的长度为2.8＋0.05＋3.24＝6.09(kb)，因此基因敲除片段的长度为6.32－
6.09＝0.23 (kb)。(3)获得基因M1 后，与M1 两条链两端互补的引物是引物1 和引物2。由于
质粒上有三个酶切位点，切割后会出现不同的黏性末端，而基因M1 两端没有能与黏性末端
互补的序列，故需要分别在基因两条链的5′端引入限制酶的识别序列，根据基因M1 插入
质粒的位置可知，添加的是限制酶HindⅢ、PstⅠ的识别序列。
4．(2023·河北唐山一中高三模拟)“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通
常在1～2 h 内即可得到检测结果。Taqman 探针是实时荧光定量RT—PCR 技术中的一种常
用探针(如图1)，其5′端连接荧光基团(R)，3′端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R 发出
的荧光信号被Q 吸收而不发荧光。在PCR 扩增过程中，当Taq DNA 聚合酶遇到探针时会使
探针水解而释放出游离的R 和Q，R 发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与
PCR 产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题：
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(1)结合图1 和图2 分析，“荧光RT—PCR 技术”所用的试剂盒中通常都应该含有
______________酶、______________酶、Taqman 探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。
这种分子层面的荧光RT—PCR 检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的
____________、______________有关。
(2)根据Taqman 探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据______________________。
新冠病毒是冠状病毒大家庭中新的一员，其碱基序列与引起SARS 的冠状病毒碱基序列有
79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taqman 探针时应筛选出该病
毒特有的序列，以避免______________(填“假阴性”或“假阳性”)的出现。
(3) 根据图1 和图2 ，Taq DNA 聚合酶除了能催化DNA 子链的延伸，还能
___________________。
(4)若每分子探针水解释放的R 基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度
(Rn)主要与______________、______________有关。在检测过程中，随着PCR 的进行，反
应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，
一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧
光扩增曲线图(如图3)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中________________等有
限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。
(5)虽然荧光RT—PCR 是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，
通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有__________(填字母)。
a．通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足
b．在样本运输、检测中出现了损坏和污染
c．病毒相应关键序列发生了基因突变
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答案 (1)逆转录 TaqDNA 聚合 引物 Taqman 探针 (2)新冠病毒RNA 内部的一段序列
(或新冠病毒RNA 逆转录形成的DNA 的部分序列) 假阳性 (3)催化RNA(Taqman 探针)的
水解 (4)扩增次数 样品中病毒初始数量(或病毒样品模板RNA 含量) 原料、引物和探针
数量(或Taq DNA 聚合酶活性) (5)abc
解析 (1)图1 和图2 所示新冠检测的基本原理：将新冠病毒RNA 逆转录为cDNA，因此荧
光PCR 法所用的试剂盒中通常都应该含有逆(反)转录酶、耐高温的DNA 聚合酶、Taqman 探
针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。试剂盒中的引物和Taqman 探针决定了这种分子层面
的荧光RT—PCR 检测具有特异性和高灵敏性。(3)根据图1 和图2 可知，TaqDNA 聚合酶除
了能催化DNA 子链的延伸，还能催化RNA(Taqman 探针)的水解，Taqman 探针水解释放出
游离R 被仪器检测到。(4)在PCR 扩增过程中，TaqDNA 聚合酶遇到探针时会使探针水解而
释放出游离的R，因此，扩增次数越多，样品中病毒初始数量(病毒样品模板RNA 含量)越
多，则被水解的探针越多，释放出游离的R 越多，反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)也越
强。由图3 可知，随着PCR 的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也
等比例增加，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加，其原因最可能是试
剂盒中原料、引物和探针数量(TaqDNA 聚合酶活性)等有限。(5)荧光RT—PCR 出现“假阴
性”可能是通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足，使荧光信号强度(Rn)未达到或超
过阈值而没有检测出；也可能是在样本运输、检测中出现了损坏和污染，导致新冠病毒核酸
破坏而无法检测；还可能是病毒相应关键序列发生了基因突变，导致探针失效而无法检测，
因此a、b、c 正确。
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