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解惑练5 CRISPR/Cas9 技术
1．CRISPR/Cas9 技术敲除掉部分基因原理
(1)CRISPR/Cas9 是细菌的一种后天免疫防御机制——CRISPR 序列示意图如下(其中，菱形
框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列)，其中的“间隔序列”来源
于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。
(2)病毒或外源质粒上存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔
序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我
们称为PAM(原间隔序列临近基序)。
(3)当病毒或外源质粒DNA 首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA 潜在的PAM 序列进
行扫描识别，将临近PAM 的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上
CRISPR 序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。
(4)当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR 序列的表达。同时，在CRISPR 序
列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas 基因。CRISPR 序列的转录产物CRISPR
RNA 和Cas 基因的表达产物等一起合作，通过对PAM 序列的识别，以及“间隔序列”与外
源DNA 的碱基互补配对，来找到外源DNA 上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这
也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。
2．CRISPR/Cas9 技术的运用和发展
(1)具体运用如下图所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(指导RNA)，将其与
含有Cas9 蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA 通过碱基互补配对可以靶向
PAM 附近的目标序列，Cas9 蛋白会使该基因上下游的DNA 双链断裂。对于DNA 双链的断
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裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA 损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序
列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。
(2)CRISPR/Cas9 基因魔剪：当研究人员要用基因魔剪来编辑一个基因组时，他们会人工构
建一个指导RNA，它与将要被切割的DNA 代码相匹配。魔剪蛋白Cas9 与指导RNA 形成复
合物，将魔剪带到基因组中将要进行切割的地方。
(3)原始的CRISPR/Cas9 会由于RNA 定位偏差而出现脱靶效应，现在通过改进，可以大幅降
低脱靶效应。同时还发现了一些新的系统，除了最开始的Cas9，后面又找到了Cas12 的一
系列酶，机理上有一定不同，但还是用以切割DNA；还有Cas13 则用于切割RNA。基于
Cas12 和Cas13 的开发以及机制研究，又发展出了新的工具用于快速检测病毒，效率可以达
到几分钟检测一个样品，并且用到了现在的新冠病毒检测中。
跟踪训练
1．CRISPR/Cas9 基因编辑技术源于细菌抵御噬菌体的机理研究。细菌被特定噬菌体感染后，
细菌Cas2 会随机切断入侵的噬菌体DNA 双链，并将切下的一个DNA 片段(原型间隔序列)
插入CRISPR 位点(由间隔序列和重复序列交替排列组成的基因序列)的重复序列中，构成新
的间隔序列，形成“免疫记忆”。当同种噬菌体再次入侵时，由CRISPR 位点的新的间隔序
列转录产生的crRNA 便会将另一种蛋白质(如Cas9)准确带入到入侵者的原间隔序列DNA 处，
并将之切断，即“免疫灭杀”。CRISPR/Cas9 基因编辑技术中，sgRNA(单向导RNA)是根据
靶基因设计的引导RNA ，准确引导Cas9 切割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列，
CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑时，对DNA 序列中的原型间隔序列相邻基序具有较高的编
辑效率，如图所示。回答下列问题：
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(1)细菌Cas2 基因表达Cas2 的过程需要细菌提供______________________等原料，Cas2 和
Cas9 在功能上都属于__________酶，可催化____________键水解。
(2)CRISPR/Cas9 系统中的sgRNA 与细菌体内的____________功能相同，都可以与相应靶基
因序列发生碱基互补配对。细菌利用该防御机制可以有效抵抗噬菌体的二次入侵，但是仍然
会有部分噬菌体能够继续侵染已经获得免疫能力的宿主菌，原因可能是_________________
_______________________________________________________________________________
。
(3)CRISPR/Cas9 基因编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，sgRNA 通过20 个核苷酸
长度的引导序列与目标DNA 序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会
发生第18～20 个碱基不匹配的情况，此时，Cas9 可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区
稳定住RNA－DNA 双链，从而为Cas9 切割DNA 铺平道路，但这可能会导致Cas9 在错误
的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应，提出可能的思路：
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)核糖核苷酸和氨基酸 限制性内切核酸(或限制) 磷酸二酯 (2)crRNA 噬菌体
DNA 中的原型间隔序列发生基因突变，导致CRISPR 位点形成的crRNA 无法对其进行识别
(3)设计Cas9 酶，让其手指状结构远离DNA 序列，从而在sgRNA 和DNA 错配时，不会用
来稳定错配结构(合理即可)
解析 (1)基因表达包括转录和翻译两个过程，因此细菌Cas2 基因表达Cas2 的过程需要细
菌提供核糖核苷酸和氨基酸等原料。由题意可知，Cas2 和Cas9 都能切割DNA，属于限制性
内切核酸酶(或限制酶)。限制酶能切割DNA 分子，催化磷酸二酯键水解。(2)分析题意可知，
CRISPR/Cas9 系统中的sgRNA 能够与DNA 杂交，其功能与细菌体内的crRNA 相似。细菌
“免疫记忆”能够切割噬菌体的DNA，若其功能失效，可能是细菌体内的crRNA 不能正确
识别噬菌体的DNA，即噬菌体的DNA 中的原型间隔序列发生基因突变，导致CRISPR 位点
形成的crRNA 无法对其进行识别，进而导致Cas9 不能切割噬菌体的DNA。(3)由题意可知，
sgRNA 通过20 个核苷酸长度的引导序列与目标DNA 序列发生碱基互补配对准确识别时，
由于第18～20 个碱基不匹配，Cas9 可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA－
DNA 双链，导致错误切割，故可设计Cas9 酶，让其手指状结构远离DNA 序列，从而在
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sgRNA 和DNA 错配时，不会用来稳定错配结构。
2．(2023·河南安阳高三模拟)CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改
变任意靶基因的遗传信息，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9 蛋白到一个特
定的基因位点进行切割，从而达到基因定点敲除、敲入、突变的目的。通过设计向导RNA
中20 个碱基的识别序列，可人为选择DNA 上的目标位点进行切割(如图所示)。请据图分析
回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 基因编辑技术中，sgRNA 是根据靶基因设计的向导RNA，准确引导Cas9 切
割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列。Cas9 借助向导RNA 对目标DNA 分子进行精准定位，
依赖于________________________________________________________________________
________________________________________________________________________ ；Cas9
蛋
白
能
对
目
标
位
点
进
行
准
确
切
割
，
是
因
为
_____________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。
(2)在使用Cas9 对不同目标DNA 进行编辑时，应使用Cas9 蛋白和__________(填“相同”或
“不同”)的向导RNA 进行基因编辑。在设计向导RNA 识别序列时，若目标DNA 的α 链切
点附近序列为…GAATCTCCA…，则向导RNA 上识别序列为__________________________
_______________________________________________________________________________
。
(3)已知玉米中赖氨酸含量较低，原因是与赖氨酸合成过程中的两个关键酶——天冬氨酸激
酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度影响较大。当赖氨酸浓度达到一定
量时就影响这两种酶的活性，从而使赖氨酸含量很难提高，不能满足需求。现使用
CRISPR/Cas9 基因编辑技术对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶基因进行改造，首先需
要构建由启动子、__________________________________(目的基因)、标记基因、终止子等
组成的基因表达载体，然后使用____________法导入玉米细胞，完成转化后CRISPR/Cas9
系统可在玉米体细胞中特定的基因位点改写遗传信息，再经______________________技术培
育成赖氨酸高产的玉米植株。
答案 (1)向导RNA 识别序列与目标DNA 之间的碱基互补配对 Cas9 蛋白能识别特定核苷
酸序列并在特定位点断开磷酸二酯键(Cas9 蛋白具有专一性) (2)不同 …GAAUCUCCA…
(3)Cas9 蛋白基因和sgRNA 基因 农杆菌转化 植物组织培养
解析 (1)CRISPR/Cas9 基因编辑技术中，sgRNA 是根据靶基因设计的向导RNA，能准确引导
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Cas9 切割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列。Cas9 能借助向导RNA 与目标DNA 进行精确定位的
原因在于向导RNA 上的碱基序列与目标DNA 分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实
现向导RNA 与目标DNA 分子特定序列的特定识别，进而定位；对目标位点的切割则依赖于
Cas9 蛋白的专一识别，Cas9 蛋白能识别特定核苷酸序列并在特定位点剪切特定的碱基序列，
使磷酸二酯键断裂。
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