流式对照使用说明,理清单染|同型|FMO

在上一期内容中，对流式实验中的实操要点--抗体滴定做了详细介绍，并初步带小伙伴们了解了流式实验中的对照设置。

今天的内容，将理清流式中的单染、同型、FMO三大对照：

首先来介绍单染对照。单染管主要用于调节补偿。但并非所有样本都需要调节补偿，只有出现荧光溢漏时才需要进行补偿调节。若检测靶标数量少，荧光染料选择合理，各荧光由不同激光器对应的通道激发，荧光溢漏程度很低，不调的情况下能够满足“横平竖直”，则无需调节补偿。

若检测靶标数量较多，仪器可用通道有限，荧光难以错开排布，就会产生荧光之间的溢漏，此时必须调节补偿。 判断标准（如上图所示）：无需补偿的散点图细胞群横平竖直，在中心点；存在荧光溢漏时，细胞群发生偏移，需要调节补偿。

补偿调节原则如下：

1. 所有荧光标记靶标，包含死活染料，均需要设置单染管。死活染料同样占用检测通道，部分死活染料发射光谱宽，容易发生溢漏。
2. 单染管上机电压必须与样本管保持一致。利用单染管完成补偿调节后，确定的电压参数与补偿模板，后续检测样本时不可随意更改。
3. 所用的单染管一定要至少和实验所用抗体信号一样强或更强。

这里有个可替代原则：理想状态下，单染管需要具备清晰的阴阳性分群，便于判断阴性与阳性信号，完成补偿调节。 若目标抗原表达量低，为连续性表达，无法形成明显分群，可使用补偿微球进行补偿；也可选用相同荧光标记的其他强表达抗体替代。 比如：APC 荧光标记的靶标分群差，可使用相同APC荧光标记 CD3、CD4 这类高表达，分群清晰的靶标调补偿。仪器仅识别荧光通道信号，不区分靶标种类，因此可以进行替代。

合格补偿判断：补偿调节前，细胞分群异常；调节合适后，细胞群横平竖直，中心点保持在同一水平。补偿调节过度，细胞群会向下偏移，补偿调节效果以细胞群形态为准。

同型对照：同型对照需要使用专用同型对照抗体，需要另外购置。

同型对照抗体选择要求：与实验抗体种属来源一致，免疫球蛋白亚型相同，标记荧光保持一致。 作用：消除抗体本身非特异性结合带来的背景荧光。

如上图所示，未染色空白管阴性群位置偏左；加入同型对照后，细胞群通常轻微右移，该偏移代表抗体产生的非特异性结合，同型对照用于扣除这部分背景。如果靶标阴阳性分群清晰时，可不使用同型对照画门；抗体染色后细胞群右移，且细胞分群不明显时，建议使用同型对照辅助设门。

以上是同型对照选择的原则，图中右边是同行对照的类型，会标好种属及亚型还有对应的荧光

FMO 对照（即荧光减一对照），FMO 对照的核心作用是辅助圈门，多用于三色及以上多色流式实验，单双色实验一般不需要。 例如：实验组合 CD4、CD25、FOXP3 三个指标，FOXP3 表达偏低、分群模糊。制备 FOXP3 的 FMO 对照：不标记 FOXP3，其余 CD4、CD25 抗体正常染色。如上图所示：未染色管组，阴性群压的比较低，其他抗体进行染色后，受荧光溢漏、非特异性结合影响，阴性群基线会上移，该群并非阳性群。需要以FMO对照划定阴阳性界限。

尤其是对于低表达抗原、连续性表达抗原，难以区分阴阳性时；胞内染色需要固定破膜的实验。固定破膜处理常会使背景荧光升高，此场景下同型对照的适用性下降，优先选用 FMO 对照辅助圈门。

下面介绍下染料干扰阻断剂，CY系列花青素染料（如 PE-CY5、PE-CY7、PerCP-CY5.5），这类染料荧光亮度高，但会与像单核、巨噬细胞发生非特异性结合，造成背景信号升高。 可使用染料阻断剂（如上图右所示的单核细胞封闭剂），阻断这类非特异性结合，提升实验重复性与结果准确性。如上图左所示，未添加阻断剂时，会出现假阳性群；加入阻断剂后，可确认该群体实际为阴性群。因此小伙伴们在使用CY系列染料时，推荐搭配染料阻断剂。

本期的内容就介绍到这里了，做流式先把对照安排明白，实验效率直接拉满，刚来的同学可以结合前面几期内容一起掌握。