SCIEX 软件液相方法及其方法优化要素

色谱质谱，物性表征测试（可合作），实验耗材，技术培训

SCIEX OS软件液相方法关键步骤与参数设置。

SCIEX OS软件液相方法

建立一套完整的液相色谱方法，核心在于对仪器各模块参数的协同设置。以下流程将引导你完成从流动相梯度到方法保存的全过程。

1. 流动相梯度与泵参数设置

方法建立的第一步是定义化合物的洗脱程序。在软件中点击“LC method”模块进入编辑界面，首要设置的是“Binary Gradient”[[液相色谱]]。在此界面，你需要设定流速、初始流动相比例，并通过添加时间点与对应的B相比例来构建洗脱梯度曲线[[液相色谱]]。仪器的运行停止时间通常与梯度结束时间保持一致。最后，需根据色谱柱的耐受压力或方法实际压力，设置系统的最大压力限[[液相色谱]]。软件也提供了“Simple”模式，通过设定B相比例和各段时长即可快速生成常用梯度，简化操作[[液相色谱]]。

2. 自动进样器与洗针程序配置

自动进样器的设置关键在于确保进样的准确性与交叉污染的消除。在“Auto Sampler”标签下，首先设置洗针类型。对于绝大多数情况，仅清洗进样针外壁即可，因此类型可选择“External Only”[[液相色谱]]。

u洗针模式与时间：推荐模式为在吸样前和后都进行清洗，洗针时间通常设置为5-10秒[[液相色谱]]。

u内洗模式：若样品残留风险高，需清洗针内壁，则应选择“Internal & external”模式[[图†1|液相色谱]]。

在此模式下，需要配置详细的冲洗程序，包括冲洗速度、体积以及特定的洗针序列（例如R1→R2）[[图†1|液相色谱]]。值得注意的是，用于内洗的洗针液需有一路其极性与方法的初始流动相一致，并在清洗序列的最后使用该溶液平衡整个进样系统，以防影响色谱峰形[[液相色谱]]。

u进样针深度：此参数需在“Sample Rack Settings”中调整，通过修改“Needle Stroke”值来控制针尖距样品瓶底的距离。该值越大，进样针扎得越深。例如，对于1.5 mL样品瓶，常见设定值为52（距瓶底约2 mm）或48（距瓶底约6 mm）[[液相色谱]]。不同型号的自动进样器默认值不同，需根据仪器型号和样品体积进行调整[[液相色谱]]。

3. 溶剂选择阀与柱温箱设置

u溶剂选择阀：如果系统配置了外置溶剂选择阀，需要在方法中指定其流路，例如选择流路A、B或组合流路AC、AD等[[液相色谱]]。该阀门的物理设置界面通常位于泵模块附近，用于手动确认流路[[图|液相色谱]]。

u柱温箱：在“Column Oven”标签下，直接设置色谱柱的温度。稳定的柱温是保证色谱保留时间重现性的关键因素之一[[液相色谱]]。

4. 系统平衡与方法保存

为确保系统稳定，可在自动进样器设置中勾选“Sample loop环平衡”选项，并设定平衡开始时间与保持时间（例如，保持2.2分钟）[[图†1|液相色谱]]。完成所有参数（流动相梯度、自动进样器、柱温箱）的设置与检查后，即可进行方法的命名与保存[[液相色谱]]。

总结：一个稳健的液相方法，是泵的梯度程序、进样器的清洗与进样精度、以及柱温箱的温度控制三者协同作用的结果。每一步参数的设置都需考虑其对数据重现性与准确性的潜在影响。

annalyst 液质方法

LC-MS/MS硬件开机，自检完成；

双击Hardware Configure，在硬件配置菜单下点击LCMS；点击“Activate Profile”激活仪器，右下角正常显示仪器状态图标，代表仪器连接成功；

选择项目的 Project；双击 Build acquisition method，弹出方法模板，在模板左侧点击Acquisition Method，右侧的参数栏，确认Synchronization Mode选择LC Sync；

点击方法模板左侧的+MRM，在模板右侧Scan type下选择 MRM（多反应监测）；在polarity下选择化合物极性：Positive(正离子)、Negative（负离子），根据做开发方法实际情况选择正离子模式还是负离子模式；

在Duration处时间与液相梯度总时间一致；
在表格中Q1Mass（Da）栏填写母离子分子量；
在表格中Q3Mass（Da）栏填写子离子分子量；
在Dwell Time（msec）填写适合的驻留时间（如30、50、100等）；
在ID栏填化合物名称（通常方法建议设定两对离子对，定量-1，定性-2）；
在表格中右键完成填加DP、EP、CE、CXP参数；将优化好的参数填入到对应的栏目中；

点击Edit Parameters设置离子源参数（APCI源为例）：Source/Gas项下填入优化等到的最优参数；

点击Integrated Valco Valve，弹出Integrated Valco Valve Method Properties界面，进行质谱切换阀设置；

在Position Name for Step0：默认为A可以下拉进行切换，在右侧界面，Total Time（min）处填写切换时间，在对应Position处填写切换位置，完成切换阀设置（以A为切至废液位为例）；

点击Sciex LC System，弹出页面，可以进行液相参数设置；

在Binary Gradient界面进行参数设置（注1）；
在stop time处输入液相梯度截止时间（注2）；
在flow处输入流速（注3）；
在B.Conc处输入起始B泵比例，A泵会自动设置（注4）；
在Maximum处输入项目或仪器的最大压力（注5）；

在Binary Gradient右侧点击倒三角图标，进行梯度设置界面的扩展；

在Binary Gradient项下的Flow program界面输入液相梯度参数；
在Time列输入时间；
在Flow列输入流速；
在B.Conc列输入B相的比例，A相比例会自动填充；

在Autosampler项下的Cooler temperature处进行自动进样器温度的设置；

在Column Oven项下的Oven temperature处进行柱温箱的温度设置；

点击Injection，弹出Autosampler界面，在Injection Volume（ul）处进行项目进样量的设置；

点击保存按钮（或File-Save），弹出Save Acquisition Method界面，在File name处进行采集方法名称的设置；

完成保存操作后，完成了新的采集方法的建立。

附录：

液质方法开发之液相条件优化

液相方法的主要目的是实现分析物的保留、杂质峰的分离、对称的峰形、稳健，其最大的挑战就是在最短的时间内选择出最合适的色谱柱和流动相方法。

通常情况下使用常规流动相做溶剂（酸、碱、缓冲盐）以及色谱柱的组合作为起始条件，然后根据出峰情况对流动相或色谱柱进行调整就可以获得满意的峰形与分离。但这些终究需要经验基础，而经验是不稳定的。如何系统的进行方法开发是本篇中需要讨论的问题。

▉内容拆解

1、文献查阅：

参照文献是很直接的一条途径，“在巨人的肩膀上”可以通过重复实验的方法进行方法的建立，但是我们需要评估所参照的文献方法是否适合我们分析的样品。

因为所参照的文献是在当时色谱条件下所能得到的最佳方法，在色谱柱与仪器设备不断升级与迭代的现在，有可能开发出比参照文献更快速，分离度更好的分析方法。

2、液相方法三要素

液相方法建立的重点及将目标化合物分离，而影响分离关键的三要素就是：化合物、色谱柱、流动相。

对于小分子化合物属性而言，Pka和结构是方法开发中比较关注方面。为了保证化合物的峰型，一般会将流动相的pH值设定在化合物的pKa±2以上范围。如果结构中存在羟基、羧基等极性集团，那在C18色谱柱上会保留较弱；反之，如果碳链较长，则保留较强。

But！

并不是所有化合物都可以查到pka，尤其是新药研发时，也并不是所有化合物都仅仅存在羟基、羧基，所以该方法只是作为辅助，更常用的方法依旧是拉大梯度，观察出峰情况，根据出峰情况进行优化。

3、色谱柱的选择

色谱柱是液相系统的核心。反相色谱柱常用的填料包括 C18 、 C8 、 C4 、氨基柱、苯基柱等。对非极性及弱极性的化合物适用于 C18 色谱柱，中等极性化合物可使用氨基柱，极性化合物可尝试 Hilic 色谱柱，芳香族化合物可以尝试苯基柱。

色谱柱粒径和内径越小峰型及分离度，但同时色谱柱背压也会越高。柱长与分离度成正比，色谱柱越长，获得的理论塔板数越高，分离越好，但待分析物保留时间会相应增加，分析时间可能会延长。

4、流动相的选择

反相色谱中常用的水相为纯化水，有机相为乙腈、甲醇。乙腈的洗脱能力比甲醇强，且柱压也低，因此一般也是先上乙腈作为有机相开发方法。甲醇与乙腈洗脱能力不同，与待测组分及固定相的相互作用方式也不同，因此待测组分在甲醇中与在乙腈中可能呈现不同的洗脱顺序或分离效果，必要时可以将乙腈-甲醇以一定比例混合作为有机相。

5、流动相添加剂种类

在经过C18色谱柱初筛之后，如果出现了峰型差、保留不充分的情况，

在反相模式下，对于不同性质的化合物应采取不同的流动相及相应的色谱柱。一般来说，酸性化合物在酸性条件下保留较强，碱性化合物在碱性条件下保留较强，利用这一性质，可优先通过酸、碱调整pH值或者加入挥发性盐来调节，即可达到良好保留的结果。

一般在正离子模式下都是用酸性的流动相（0.1%甲酸或乙酸），就算是负离子模式下也很少用氨水做流动相（色谱柱一般耐酸不耐碱，用氨水时一定要确定色谱柱适用的PH值范围）。

甲酸、乙酸一般加入量是0.05~0.1%，最高不超1%，甲酸铵乙酸铵一般是5~10mmoL/L，最高不超20mmoL/L。

6、梯度的优化 等度和梯度洗脱均常用于液质分析。在等度洗脱中，流动相组成保持不变；梯度洗脱中流动相的组成则是变化的，等度或梯度洗脱的选择取决于化合物和样品的处理方法。

对于一个未知样品，或没有液相分析的数据，我们一般先走其实梯度为5%有机相的大梯度，然后根据结果再进行梯度优化。

7、温度的优化

调节柱温也有助于目标物化合物的分离，缩短保留时间。

同一提高柱温也会降低柱压。

8、初始方法的设置

我们可以先从最简单的流动相开始优化，正模式下以0.1%甲酸水为水相，0.1%甲酸乙腈为有机相，设置5%有机相的大梯度，设置柱温40℃，然后按照流动初始比例配制目标化合物溶液进样，然后根据出峰情况进行调节。

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