应用说明 | 使用配备人工智能图像分析的下一代高内涵成像平台实现高速表型分析

简介

高内涵成像技术通过同步捕获多重细胞特征，在现代药物发现中发挥着关键作用——相较于单参数检测方法，它能提供更全面的细胞扰动响应视图。为提升该技术的能力，我们开发了新一代 ImageXpress HCS.ai 智能高内涵成像分析系统（Molecular Devices），采用全面重新设计的硬件与软件平台。增强型的 x、y、z 轴载物台运动和自适应自动对焦系统实现了更高通量，而具有优化的照明系统和高量子效率相机的光路设计，可缩短曝光时间、降低背景噪声，并显著提升信噪比。

在此应用说明中，我们介绍了两种代表性检测方法，用以阐释新设计的成像系统及其现代化软件界面如何实现从采集设置到高级数据分析的端到端标准化工作流：

两个实验获得的 Z-prime 因子分数均超过 0.5，印证了该系统在高内涵筛选应用中的稳健性与适用性。

与主流高内涵成像平台相比，ImageXpress HCS.ai 系统的图像采集速度平均提升 100%。这种通量的大幅提升，结合卓越的图像质量，使该系统成为 2D 和 3D 高通量成像应用的理想解决方案。

方法

将表达 GFP 标记 β-arrestin 的 U2OS 细胞接种于 384 孔平底板（Greiner），在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Thermo Fisher Scientific）中培养 1 天后，使用 GPCR 激动剂异丙肾上腺素（SelleckChem）处理 1 小时。处理后，细胞先后用 MitoTracker 深红染料（Thermo Fisher Scientific）和 Hoechst 核染色剂（Thermo Fisher Scientific）进行染色，随后用 4% 多聚甲醛（PFA，Thermo Fisher Scientific）固定。去除固定液后，用 PBS 缓冲液清洗两次即可进行成像。

MCF-7 人乳腺癌细胞（ATCC）按照制造商建议进行传代培养。本实验参照 Bray 等 ¹ 和 Cimini 等 ² 建立的细胞绘画检测方案：将 MCF7 细胞接种于 Greiner 384-well μClear 微孔板中，每孔 2000 个细胞，加入 40 μL MEM 培养基（补充 10% FBS、10 μg/mL 胰岛素）。细胞在 37℃培养 24 小时后进行化合物处理。接种 24 小时后、添加化合物前，将培养基更换为含 2%（体积 / 体积）FBS 的 MEM 培养基。

实验选用以下 11 种化合物：5 - 氟尿嘧啶、Ca-074Me、CCCP、氯喹（Enzo）、细胞松弛素 D、依托泊苷（Calbiochem）、latrunculin B、鱼藤酮（Enzo）、星形孢菌素及汉防己甲素（除特别注明外，所有化合物均购自 SelleckChem）。采用七点法进行 1:3 梯度稀释，每个浓度设置四个复孔。同一板中同时设置 DMSO 对照组、阴性对照和阳性对照。细胞与化合物共孵育 24 小时后进行检测。

活细胞染色使用 MitoTracker 深红染料（500 nM），在 37℃避光条件下孵育 30 分钟，随后用 3.2%（体积 / 体积）多聚甲醛（PFA）固定 20 分钟。清洗后，于室温下用 0.1% Triton-100 透化处理 20 分钟。

染色溶液按以下浓度配制于封闭液（1X HBSS 及 1% wt/vol BSA）中：

染色完成后移除溶液，用 1X HBSS 清洗三次，最后用密封膜封闭板孔。所有清洗步骤均使用 1X HBSS 溶液完成。

使用 ImageXpress HCS.ai 智能高内涵成像分析系统（图 1、2）进行图像采集，采用 20 倍物镜、60” 转盘共聚焦模块，在 DAPI、FITC 和 TL 通道下获取图像。采集 5 个层面（Z 轴步进 1μm）的 Z 轴最大投影图像。通过 IN Carta 图像分析软件内置的分割工具完成细胞核与 GPCR 斑点分割，并进行计数以生成剂量反应曲线。

使用 ImageXpress HCS.ai 智能高内涵成像分析系统（图 1、2）进行图像采集，采用 20 倍物镜、60” 转盘共聚焦模块。采集 13 个层面（Z 轴步进 2μm）的 Z 轴最大投影图像。使用 IN Carta 图像分析软件进行分析，采用 SINAP 算法进行细胞核分割。将每个细胞获取的 246 个测量参数上传至 StratoMineR 软件进行后续分析。

结果

ImageXpress HCS.ai 系统专为高速运行与检测灵活性而设计。为评估成像速度，我们通过多组参数设置对图像采集时间进行对比测试，并以其他主流高内涵成像分析系统作为基准。宽场成像模式下采集时间平均缩短 50%（即速度提升 100%），共聚焦模式下平均缩短 38%（即速度提升 61%）（图 3）。在细胞绘画检测中，本系统完成共聚焦水镜下四荧光通道 + 明场成像仅需 96 分钟，而其他同类系统耗时约 162 分钟。

G 蛋白偶联受体（GPCRs）是药物靶点中占比最大的类别，广泛应用于基于细胞的筛选实验。GPCR 激活后，细胞质中的 β-arrestin 会向网格蛋白包被小窝和内吞囊泡转运（图 4A）。本研究采用表达 GFP-β-arrestin 的 U2OS 细胞，通过异丙肾上腺素（GPCR 激动剂）处理，实现内化 GPCR 囊泡的高内涵成像与分析。

精确的细胞分割对囊泡斑点计数和剂量反应量化至关重要。IN Carta 图像分析软件集成 Cellpose 3.0 算法，可实现精准细胞分割，并以随机颜色显示掩膜区分相邻细胞（图 4B）。Cellpose 是一种基于深度学习的细胞分割算法，无需重新训练即可适应多种图像类型，能够有效处理不同噪声、模糊度和对比度的图像，并适用于多通道及不同尺寸的成像数据。

通过 GFP 荧光斑点数量计算获得检测的 Z-prime 因子分数（0.75 与 0.67）（图 5B）。

细胞绘画是一种采用多达六种荧光染料标记八种不同细胞器的高内涵多重成像技术。该方法已被证明能高效表征细胞表型，可作为细胞状态、基因表达乃至药物作用机制的替代性评价指标。本实验中，MCF7 乳腺癌细胞经小分子化合物处理后，采用细胞绘画检测进行分析（图 6）。

多重检测（如细胞绘画）需进行多荧光通道成像。ImageXpress HCS.ai 系统（advanced 型号）配备 7 色激光器与 8 个荧光通道，特别适合高度多重化研究。本案例使用 HCS.ai 系统采集图像，并通过 IN Carta 图像分析软件进行处理。

所有分析数据上传至 StratoMineR 软件 —— 专为表型分析等多参数数据设计的云端平台。通过多维表型分析进行数据处理，采用均匀流形逼近与投影（UMAP）降维算法显示：相同化合物处理的细胞呈现聚集性分布。表型距离评分进一步表明，经多柔比星、星形孢菌素、latrunculin B 及四氢嘌呤处理的细胞，与未处理对照组相比表现出显著差异化的表型特征。

结论

• 全新设计的 ImageXpress HCS.ai 高内涵筛选系统实现平均最高 100% 的图像采集速度提升，相较其他主流系统显著加速筛选工作流程

• IN Carta 图像分析软件集成 Cellpose 3.0 算法，能在不同噪声、模糊度及对比度条件下实现精准细胞分割

• ImageXpress HCS.ai 系统支持高度多重化检测，并能基于差异化表型特征实现清晰聚类

• 两项检测均获得高 Z' 因子分数（>0.5），证明本系统适用于稳健的高通量筛选应用