夜雨聆风器官型三维组织模型需要精确的电生理接口来研究功能和疾病。多电极阵列（MEAs）对于记录和刺激至关重要，然而传统的制造方法成本高昂且耗时。本研究展示了使用气溶胶喷射打印技术在柔性聚酰亚胺基底上打印金纳米颗粒，以制备全金、生物相容性的多电极阵列，实现MEA的快速定制。制造时间从约320分钟（光刻法）减少到约175分钟，且材料浪费极少。打印的电极实现了低阻抗（1 kHz时为0.05 kΩ µm⁻²），并在14天内保持稳定性能。涂覆聚（3,4-乙烯二氧噻吩）聚苯乙烯磺酸盐后，电荷注入能力提高，并在200,000次刺激脉冲后仍保持稳定性。通过将负载C2C12成肌细胞明胶甲基丙烯酰水凝胶直接三维生物打印到MEA上，验证了细胞相容性，细胞存活率达到70–80%。电刺激诱导成肌细胞排列，来自原代皮层神经元和HL-1心肌细胞的细胞外记录的信噪比分别为20.89 dB和16.62 dB。将MEA集成到三维打印的水凝胶导管中，展示了共形应用并增强了细胞组织化。这些研究结果确立了AJP作为一种可扩展的制造方法，用于可定制的MEA，支持开发用于器官型组织模型的先进生物电子接口。
一、引言
现代器官型三维培养模型对生物医学研究人员具有极其重要的意义，其目标是将对生物系统的理解转化为改善患者预后的方法。三维器官型细胞培养可作为实验性模拟疾病以回答生物学问题的有用工具。其中，电生理活动，尤其是在产电组织内，已被证明对于理解基本生物过程至关重要。产电细胞网络形成了多种组织功能，例如大脑内的信息处理和神经传递、心脏节律的同步，以及眼睛中光信息的检测和传递。因此，理解这些复杂细胞网络的正常功能或功能障碍，对于研究人员进行疾病模型应用具有重要意义。
自20世纪70年代初以来，多电极阵列已成为用于在体外和体内研究细胞电生理活动的工具。由于多电极阵列既能刺激也能记录神经细胞和心脏细胞的电活动，它在许多体外电生理学实验室中变得越来越受欢迎。多电极阵列的典型设计包括在适合细胞粘附的基底上以对称排列方式制造的多个电极（10–100 µm），用于研究生物电信号。传统微加工技术的进步使得电极阵列的数量和密度都有所增加。互补金属氧化物半导体芯片的使用使现代多电极阵列能够记录多达26,400个电极位点，从而能够以亚细胞分辨率获取单个细胞的活性。然而，利用传统的微加工工艺（如模板法或光刻法）生产现代多电极阵列存在若干缺点。生产多电极阵列所需的设备和技术专长通常成本高昂，需要专门建造的洁净室，而且生成单一设计的生产流程复杂且耗时。这些工艺不利于定制化研究所需要的快速原型制作，因为设计布局难以轻易更改，并且在三维结构中的制造也面临诸多挑战。此外，传统方法通常涉及使用光敏材料（如SU-8）及其配套的显影液，从而导致使用有害溶剂和化学品、多个制造步骤以及产生材料废料。
针对这些挑战，研究人员将目光转向了增材制造和直写打印等替代制造技术，以生产高度可定制且低成本的多电极阵列。这些技术为代表研究人员实现模块化、可定制、低成本的多电极阵列设备提供了一种有前景的策略。气溶胶喷射打印是20世纪90年代为印刷电子行业引入的一种增材制造技术，专注于可穿戴设备、应变传感器和柔性天线等多种应用。气溶胶喷射打印作为一种有利的打印技术脱颖而出，它为可扩展、可定制的技术提供了途径，可以在各种基底上打印多种功能性墨水，例如导电、半导电和绝缘材料。气溶胶喷射打印作为一项有利的打印技术脱颖而出，它为可扩展、可定制的技术提供了途径，可以在各种基底上打印多种金属墨水。将气溶胶喷射打印用于生物电子学的一个优势在于通过无掩模制造实现快速原型制作的能力，这极大地缩短了制造时间，在某些情况下从40小时缩短到5分钟。根据研究人员的估算，使用气溶胶喷射打印制造单个金基多电极阵列的总时间约为175分钟，而使用传统光刻法则需要约300分钟（表1）。这种时间的减少主要归因于省略了掩模绘制、对准和湿法刻蚀步骤，气溶胶喷射打印的流程仅包括计算机辅助设计准备、打印机设置、金迹线的直接沉积和烧结。此外，这两种方法的材料需求也大不相同。传统光刻法每个器件可能消耗约1–2毫升光刻胶、25–50毫升显影液和25–50毫升金刻蚀液，而气溶胶喷射打印在每个多电极阵列上仅沉积约20微升金纳米颗粒墨水，但需要至少1毫升墨水来填充打印机储液槽。因此，虽然光刻法在大批量生产方面具有更好的时间和成本效益，但气溶胶喷射打印工艺适用于迭代式的小批量制造，以便快速实现设计修改。
表1. 传统微加工技术与气溶胶喷射打印制造金基多电极阵列所需时间的估算比较。
多轴气溶胶喷射打印已被用于在三维物体上打印电子元件，从而拓展了在非标准和共形结构上制造多电极阵列的可能性。气溶胶喷射打印已被用于制造高分辨率柔性电路，能够在平面和三维结构上实现选择性导电迹线的打印，而无需使用光刻法制备多电极阵列中常用的掩模和化学后处理步骤。由于其多功能性，研究人员已经评估了气溶胶喷射打印用于生成生物电子接口的可行性，并利用银纳米颗粒、金纳米颗粒和PEDOT:PSS等墨水制造了多电极阵列。此外，通过逐点打印方式，还可以制造高深宽比的微针电极，从而生成三维多电极阵列。然而，虽然已有关于气溶胶喷射打印多电极阵列的概念验证工作报道，但对柔性多电极阵列的全面电化学表征和生物学评估尚未发表。
在此，研究人员报告了一种使用气溶胶喷射打印制造的可生物兼容的多电极阵列，该阵列将金纳米颗粒墨水打印在柔性聚酰亚胺基底上（图1）。选择薄层聚酰亚胺基底是因为其具有生物兼容性、热稳定性和机械柔韧性。这使得它能够与不规则或三维组织表面实现共形接触，而刚性基底（如玻璃或常见塑料）则无法做到这一点。这种柔韧性促进了更紧密的生物电子-组织接口，这对于器官型组织模型和定制化生物电子设备尤其有价值。研究人员首先将多电极阵列制造成传统的标准平面多电极阵列设计，类似于市售设计。打印的金纳米颗粒导线和电极具有优异的细胞相容性和稳定性，使其成为与细胞进行电接口的理想材料。尽管在印刷电子领域已探索了其他低热处理方法（如光子烧结或激光烧结）以适应热敏感基底，但研究人员仍采用传统的300°C热烧结，因其易于实现且结果可重复。研究人员提供了深入的电化学表征，并展示了电诱导C2C12细胞系排列的能力。还进行了对原代皮层神经元和小鼠心房心肌细胞HL-1细胞系的细胞外信号记录。最后，研究人员展示了利用柔性多电极阵列的潜在应用。本研究确立了气溶胶喷射打印制备的多电极阵列作为传统多电极阵列制造方法的可行替代方案，为生物电子学的发展提供了一种可定制、可扩展的方法。
图1.A) 所提出的用于电化学刺激和传感的微电极阵列平台示意图。
B) 气溶胶喷射打印流程及所提出的多电极阵列制造步骤示意图。
C) 多电极阵列各组件的分解示意图。
D) 使用气溶胶喷射打印多电极阵列进行多种应用的概念验证演示，包括平面体外多电极阵列实验、用于数字光处理打印组织模型的柔性多电极阵列设计、电刺激以及电化学传感。
二、结果与讨论
01.多电极阵列的设计、制造与打印
采用气溶胶喷射打印制备的多电极阵列包含25个圆形记录电极（直径为250微米）和四个大型刺激电极（尺寸为4毫米×1.5毫米）（图2a-ii）。打印的金电极和金导线被直接打印在薄而柔性的聚酰亚胺基底上。接触垫的配置设计为与多种商用多电极阵列系统兼容，但在本工作中，研究人员使用了一款定制的、带有弹簧针的印刷电路板，用于与RHS记录和刺激前端系统连接（见补充信息图S1）。
图2.A) 示意图，展示了多电极阵列及其刺激电极的设计与尺寸。
B-D) 光学显微镜图像，展示了多电极阵列及刺激电极的打印质量。
E-F) 扫描电子显微镜图像，显示了刺激电极和微电极的表面形貌。
为了与传统多电极阵列进行直接比较，本研究选择了一种标准的多电极阵列布局，其特点是包含一个5×5的传感电极阵列（每个电极的裸露直径约为250微米）以及位于周边的四个刺激电极（图2a-i）。选择这种配置是因为它适用于记录产电细胞的信号并能实现有效的电刺激。约250微米的电极直径和1.0毫米的电极间距要求打印精度高且尺寸控制良好。围绕阵列的四个矩形刺激电极（每个约为4.0毫米×1.5毫米）为电气连接和机械稳定性提供了较大的接触面积。本文中使用的不同多电极阵列的设计见补充信息图S2。与该领域先前已发表的研究相比，本工作中多电极阵列的制造完全使用金纳米颗粒墨水，从而确保了完全的细胞相容性，并避免了额外的金属化步骤或涂层需求。
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图2b-e从宏观和微观层面展示了所打印多电极阵列的质量。图2b-d提供了更高放大倍率下的光学显微镜图像，验证了打印质量以及导电迹线的一致对准。蛇形/圆形填充图案清晰可见且相互重叠，确保了良好的薄膜覆盖率和均匀性。此外，迹线和电极的边缘具有最小的过喷和光滑的边缘，表明打印参数（例如打印速度、雾化器流量和基底温度）得到了有效优化。同时，图2d-f显示了扫描电子显微镜图像，突出了微电极的表面形貌。电极表面呈现连续且均匀的特征，电极上的金纳米颗粒层显示出颗粒状微结构，这可能会影响整体活性电化学表面积，可能降低阻抗并提高电极与细胞之间的电荷转移效率，这与先前的报道一致。正如本文后续所探讨的，这种微结构的变化也可能导致不同批次打印之间的差异。未来的研究将致力于表征这种形貌，并可能利用它来改善生物电子接口。
02.打印多电极阵列的电化学行为
采用电化学阻抗谱对气溶胶喷射打印金电极的电化学性能进行了表征。图3A显示了传感电极、刺激电极以及PEDOT/PSS涂层刺激电极的波特图。正如预期，具有更大表面积的较大电极通常在整个频率范围内表现出更低的阻抗值。在所有频率范围内，直径为250微米的传感电极显示出最高的阻抗，其次是较大的刺激电极。大刺激电极上的PEDOT/PSS涂层增加了电极的有效电化学表面积，从而在低于1千赫兹的频率下实现了最低的阻抗。
图3. 气溶胶喷射打印金多电极阵列的电化学表征。
A) 传感电极、刺激电极和PEDOT/PSS涂层刺激电极的波特幅值图。
B) 不同电极的波特相位图。（传感电极，n = 21；刺激电极，n = 18；PEDOT/PSS涂层刺激电极，n = 4）。
C) 纯金电极的批间相对标准偏差与批内相对标准偏差的比较。批间（单个多电极阵列上的传感电极，n = 25），批内（四个多电极阵列上的传感电极，n = 100）。
D,E) 在1 kHz和1 Hz频率下阻抗幅值的比较。（传感电极，n = 21；刺激电极，n = 18；PEDOT/PSS涂层刺激电极，n = 4）。
F) 在标准细胞培养孵育条件下，第0天和第14天时1 kHz频率下阻抗幅值的比较（n = 23）。
G) 在涂覆GelMA、PDL、明胶以及纤维连接蛋白前后，1 kHz频率下电极阻抗增加的百分比（n = 4）。
H) 金刺激电极与PEDOT/PSS涂层刺激电极的最大电荷注入能力代表性电压轨迹。施加到纯金电极和PEDOT/PSS涂层电极的电流分别为575微安和2575微安。
I) 金刺激电极与PEDOT/PSS涂层电极的最大电荷注入能力比较（n = 4）。
J) PEDOT/PSS涂层刺激电极在磷酸盐缓冲溶液中，以其最大电荷注入能力的60%、50赫兹频率下施加双相脉冲的稳定性（n = 3）。误差线表示标准差。（ns表示p > 0.05，***表示p < 0.001，****表示p < 0.0001）
相位图（图3B）显示，电极遵循类似的趋势：在高频率下，相位值接近0°，而在低频率下，相位值约为60°–70°。这表明在高频率下，电极主要表现为电容性行为，而在低频率下则表现出电阻性特征。图3D和图3E展示了在1 kHz和1 Hz频率下阻抗的差异。在1 kHz时，传感电极测得的阻抗为2473 ± 726 Ω，而刺激电极为192 ± 47 Ω，PEDOT/PSS涂层电极为151 ± 19 Ω。刺激电极的表面积使其阻抗降低了约13倍，而PEDOT涂层进一步将阻抗降低了1.2倍。
在1 Hz的低频范围内，与传感电极相比，刺激电极的阻抗幅值降低了9倍，而与刺激电极相比，PEDOT涂层的刺激电极阻抗幅值降低了51倍。这些结果表明，在高频下，电荷转移主要由电容机制主导；而在低频下，主要的电荷转移机制是通过法拉第电阻反应。随着电极表面尺寸增大，可以发生更多的电容性电荷转移，从而在高频下实现更大的阻抗降低。PEDOT涂层增加了电化学表面积，进一步导致在低频范围内阻抗降低。传感电极在1 kHz下的归一化阻抗值为0.05 kΩ µm⁻²，这与先前报道的类似尺寸金电极的值相当。
电化学阻抗谱测量也被用来评估气溶胶喷射打印工艺的可重复性，因为电化学阻抗谱测量提供了一种无损的方法来识别电极表面的差异。如图3C所示，在单个多电极阵列内，金传感电极在1 kHz下的阻抗变异为21 ± 4%，而在五个不同样品之间，变异增加到30 ± 7%。这些差异主要归因于气溶胶喷射打印工艺、批次间差异以及扫描电子显微镜图像中观察到的金纳米颗粒颗粒状表面纹理。
研究人员通过将在标准细胞培养条件下孵育多电极阵列14天并测量阻抗变化来检验传感电极的稳定性。如图3F所示，在标准体外条件下孵育多电极阵列后，未观察到显著的统计学差异。这表明金电极的导电性能在大多数体外培养条件预期的时间尺度内是稳定的。
选择聚酰亚胺基底是因为其相对良好的细胞相容性以及在低厚度下的柔韧性。然而，聚酰亚胺表面通常被认为对细胞不具有粘附性，需要表面改性以促进细胞粘附。在本研究中，为了利用不同的细胞案例研究，研究人员使用了三种不同的表面改性聚合物：GelMA、聚-D-赖氨酸以及明胶-纤维连接蛋白混合物。为了检验这些涂层对电极性能的影响，研究人员在涂层前后对传感电极进行了电化学阻抗谱测量，以识别电极性能的任何损失。结果如图3G所示，涂覆GelMA使阻抗增加了48%，而明胶-纤维连接蛋白混合物和聚-D-赖氨酸涂层分别使阻抗增加了31%和50%。当按电极表面积归一化时，这些值分别对应0.07、0.06和0.08 kΩ µm⁻²，这些值与未改性金电极的报道值相当，尽管高于先进的低阻抗改性（如碳纳米管或PEDOT涂层）。这种增加与添加绝缘聚合物层一致，该层限制了离子到达电极表面。虽然这可能会影响多电极阵列检测产电细胞的性能（将在后面的细胞外信号记录部分进一步探讨），但这种增加可以通过使用导电聚合物功能化电极表面或进一步改进聚合物方法以减少涂层厚度来缓解。
通过检测较大刺激电极的最大电荷注入能力值，评估了所打印气溶胶喷射打印多电极阵列的刺激能力电性能。如图3I所示，打印金的裸电极显示出平均最大电荷注入能力为7.5 ± 0.6 mA cm⁻²。为了增强多电极阵列的电刺激能力并展示使用导电聚合物修饰电极表面的能力，研究人员以100 mC cm⁻²的电荷密度将PEDOT/PSS涂层电沉积到电极表面。PEDOT涂层将最大电荷注入能力提高了约3倍，达到平均31.8 ± 0.4 mA cm⁻²。这种电荷注入能力的增加使得打印的多电极阵列能够承受更宽范围的电场，从而实现对电引导细胞控制的进一步掌控。
03.打印多电极阵列的电化学稳定性
通过在其最大电荷注入能力的80%下进行重复脉冲刺激，检验了涂覆PEDOT/PSS的刺激电极的电化学稳定性。结果如图3J所示，电极的失效判定为阻抗读数超过10 kΩ。如图3J所示，刺激电极能够承受约200,000次脉冲，这被认为足以进行所进行的电刺激细胞实验。观察到电极的主要失效模式是打印的金从基底表面分层。对这种失效模式的进一步研究具有重要意义，但不在本文的研究范围之内。进一步优化粘附层或基底预处理可能在提高这方面耐久性方面有效，并将在未来带来更 robust 的器件。
04.气溶胶喷射打印金多电极阵列的细胞相容性评估
气溶胶喷射打印多电极阵列的最终目标是为器官型组织提供超越传统刚性多电极阵列设计的合适接口。因此，为确保功能性，首先通过将包封在GelMA水凝胶基质中的C2C12细胞打印到多电极阵列上来验证细胞相容性。选择小鼠成肌细胞系C2C12用于细胞相容性和细胞排列实验，因为已知该细胞系表现出电响应性细胞排列。研究人员将细胞分别打印在标准细胞培养孔板（对照组）上或打印的多电极阵列上。图4A显示了在标准细胞培养板和打印的多电极阵列上的GelMA内细胞的代表性荧光图像。图像分析（图4B）显示，培养7天后，打印的多电极阵列上的细胞与对照组之间没有显著差异。观察到的70–80%的细胞存活率与先前关于包封在10%（w/v）GelMA中的细胞的报道一致。这种降低归因于较高的刚度和较低的孔隙率，从而降低了细胞存活率。这些结果表明，打印的多电极阵列中所用的材料对细胞没有不良影响，并且该多电极阵列支持细胞嵌入的三维生物打印结构具有适用性。
图4.使用LIVE/DEAD细胞活力测定法对包封在10%（w/v）GelMA中的生物打印C2C12细胞进行评估，以评价气溶胶喷射打印金多电极阵列的细胞相容性。
A) 使用10倍物镜拍摄的代表性图像（比例尺为100微米）。
B) 条形图显示了培养7天后的平均活细胞百分比，数据来自三个样本，每个样本获取七张图像。误差线表示标准差。（ns表示无显著差异，p > 0.05）。
05.响应多电极阵列电刺激的细胞排列
在开发下一代器官型组织模型的过程中，向组织模型提供生物物理信号对于重现生物模拟刺激的关键特征至关重要。在生物模拟刺激中，电信号已被证明是影响细胞活性的关键因素。因此，研究人员验证了所打印多电极阵列提供持续电场以诱导C2C12细胞排列的功能。首先将C2C12细胞接种到涂覆GelMA的多电极阵列上培养2天，以促进细胞粘附和增殖。然后将细胞培养基更换为分化培养基，并让细胞每天接受电刺激3小时，持续7天。电刺激通过对角相对的刺激电极施加到三个独立的多电极阵列上，对应45°角。所使用的电刺激参数与先前报道的C2C12电脉冲刺激一致，包括阴极优先的电荷平衡电流控制双相脉冲，频率为1 Hz，幅度为1 mA，脉冲宽度为5 ms。对于对照多电极阵列，C2C12细胞在三个独立的多电极阵列上接受相同条件但没有任何电刺激。图5A、C显示了在涂覆GelMA的多电极阵列上培养的C2C12细胞的荧光染色肌动蛋白的代表性图像。如图所示，与对照组相比，施加电刺激导致C2C12细胞骨架的排列增加。从每个样本获取30张图像进行图像分析，结果如图5B、D所示。电刺激组显示出偏斜的细胞方向分布，平均方向为-4.35°，中位方向为-7.5°。对照组显示出随机的方向，分布无明显偏斜，平均方向为0.45°，中位方向为0.00°。虽然发现电刺激样本对细胞方向的影响相对较小，但有足够的证据表明所打印的多电极阵列具有通过电刺激影响细胞行为的潜力。这些结果表明，需要进一步优化电刺激参数（如频率、刺激持续时间和幅度），以产生更显著的效果。
图5. 电刺激诱导C2C12细胞的定向排列。
A) 多电极阵列上经电刺激的C2C12细胞肌动蛋白染色的代表性荧光图像。红色双向箭头指示电刺激方向。白色虚线表示电极位置。
B) 刺激组通过图像分析检测到的方向角分布的极坐标图（n = 3，每个样本30张图像）。
C) 多电极阵列上未经电刺激的C2C12细胞肌动蛋白染色的代表性荧光图像。白色虚线表示电极位置。
D) 对照组通过图像分析检测到的方向角分布的极坐标图（n = 3，每个样本30张图像）。
06.细胞外信号记录
在培养后的第16天，对涂覆了聚-D-赖氨酸的打印多电极阵列上的原代皮层神经元进行了细胞外记录。通过使用III类β-微管蛋白标记物的免疫染色确认了神经元生长（见补充信息图S3）。从多电极阵列记录的信号经过200至3000 Hz的带通滤波，以去除低频振荡和电源线噪声。代表性的原始信号频谱图见补充信息图S4A，代表性的滤波后电信号轨迹见图6A。通过将阈值设置为相应通道均方根值的五倍来识别超过5分钟记录期内检测到的脉冲。从神经元培养物中检测到的脉冲的重叠波形如图6B所示，其平均值及相关的标准差如图6D所示。脉冲形态和持续时间与先前报道的皮层神经元体外和体内电生理记录一致，证实了所打印多电极阵列记录神经电生理的功能能力。已知HL-1小鼠心房心肌细胞在达到足够融合度后会产生电可检测的自发动作电位，但无周期性。因此，使用HL-1细胞系进一步评估多电极阵列性能。在培养后的第3天测量细胞外记录。滤波后的电压轨迹显示在图6E中，原始频谱图见补充信息图S4B。检测到的脉冲波形如图6F所示，其波形平均值和标准差如图6H所示。在记录中，计算出原代皮层神经元的信噪比为20.89 dB，而心肌细胞的信噪比为16.62 dB。这些值与其他平面金多电极阵列（约10 dB）相当。培养的两种不同细胞类型在电压轨迹幅度和信噪比性能上的差异可归因于用于不同细胞类型的聚合物涂层不同。在原代皮层神经元中，使用聚-D-赖氨酸作为细胞粘附层，而在HL-1细胞中，研究人员使用了明胶-纤维连接蛋白涂层。如前所述，与聚-D-赖氨酸涂层相比，明胶-纤维连接蛋白涂层导致更高的阻抗，这可能降低了细胞与金传感电极之间的电容耦合，从而产生略低幅度的信号。尽管如此，这些结果表明，气溶胶喷射打印的多电极阵列能够可靠地捕获来自不同细胞类型的细胞外电生理活动，其性能与传统系统相当。作为气溶胶喷射打印多电极阵列潜在应用的可视化展示，研究人员将一个具有5×4阵列的测试用多电极阵列打印并附着在柔软的、使用数字光处理技术打印的水凝胶脑模型和心脏模型上，如图6C、G所示。薄的聚酰亚胺基底能够顺应模型平滑的曲率，并显示出与数字光处理打印水凝胶良好的接触粘附力。
图6.气溶胶喷射打印多电极阵列的细胞外记录。
A) 来自原代皮层神经元的滤波后电记录。
B) 从原代皮层神经元检测到的脉冲重叠波形。
C) 气溶胶喷射打印多电极阵列附着在数字光处理打印的脑模型上的展示图。
D) 从（B）中检测到的平均波形及标准差（阴影区域）。
E) 来自培养的HL-1心房心肌细胞的滤波后电记录。
F) 从HL-1细胞检测到的脉冲重叠波形。
G) 气溶胶喷射打印多电极阵列附着在数字光处理打印的心脏模型上的展示图。
H) 从（F）中检测到的平均波形及标准差（阴影区域）。
07.使用共形多电极阵列对数字光处理打印导管进行电刺激
作为演示气溶胶喷射打印多电极阵列在三维组织上应用的概念验证，研究人员制造了一款原型弯曲多电极阵列。利用聚酰亚胺基底的柔韧性，结合一个三维打印的固定支架，实现了直径为3毫米的圆柱形弯曲结构（图7C、D）。在此结构内，一个接种了C2C12细胞的数字光处理打印水凝胶导管被放置在弯曲结构的中心位置。细胞在标准细胞培养基中培养2天以进行增殖，随后更换为分化培养基。之后，使用先前描述的方案施加电刺激。对三维打印的C2C12细胞进行肌动蛋白染色后的共聚焦成像显示，电刺激样本与对照组之间存在显著的形态学差异。图7A展示了对照组导管内肌动蛋白染色的C2C12细胞的代表性共聚焦图像，其中C2C12细胞已迁移到孔洞内并在孔壁外缘伸长生长。成肌细胞分布稀疏，具有短小的、轻度定向的肌动蛋白丝。相比之下，电刺激组（图7B）沿导管壁显示出更密集的细胞覆盖，并具有强烈伸长的肌动蛋白丝。导管管的共聚焦三维重建图像见补充信息图S5。这些观察结果与先前关于生物打印的机械作用影响C2C12细胞排列以及电刺激诱导细胞排列的研究结果一致。这些结果表明，可以将打印的柔性共形多电极阵列与三维生物打印支架相结合，而无需依赖洁净室制造。虽然本研究未直接研究器官型组织模型，但所提出的气溶胶喷射打印制备的多电极阵列提供了一个基础，可以扩展以支持产电器官型组织模型的开发与集成。本研究确立了气溶胶喷射打印制备方法作为传统多电极阵列制造方法的可行替代方案，为与三维打印器官型培养物接口提供了一种可定制且可扩展的方法。
图7. 三维生物打印导管的电刺激。
A) 对照组和 B) 电刺激组的肌动蛋白染色（绿色）C2C12细胞在导管孔内生长的荧光共聚焦图像（2.5倍放大）。插图为10倍放大视图。细胞核用蓝色DAPI复染。红色箭头指示电刺激方向。比例尺 = 200微米（n = 1）。
C) 共形多电极阵列中间放置打印水凝胶的照片。
D) 水凝胶置于共形多电极阵列电极系统内的三维渲染图。图示标明了刺激方向（比例尺 = 1厘米）。
三、结论
总之，本研究展示了气溶胶喷射打印作为一种有前景且多功能的替代方案，可替代传统的微加工技术，用于开发生物相容且功能性的多电极阵列，以未来与三维器官型组织模型集成。利用气溶胶喷射打印，研究人员在薄而柔性的基底上成功制备了全金打印的多电极阵列。详细的电化学表征显示，其电极性能适用于产电细胞的记录和刺激。通过电沉积PEDOT/PSS导电聚合物对电极表面进行进一步修饰，提高了多电极阵列电极的刺激能力。基于挤出的三维生物打印证实了其在7天内的细胞相容性，并通过C2C12成肌细胞的定向排列展示了电刺激控制。使用两种不同细胞类型（HL-1心肌细胞和原代皮层神经元）成功记录了细胞外电生理信号。将共形多电极阵列与三维生物打印导管集成，突出了对工程化组织结构进行电刺激以开发更具生理相关性的组织模型的可行性。总体而言，这项工作为当前生物制造与器官型组织建模的交叉领域做出了贡献。气溶胶喷射打印能够快速定制灵活的生物相容性电极系统，并可针对复杂的三维组织结构进行定制，且无需传统的微加工技术。在此背景下，基于气溶胶喷射打印的多电极阵列可作为开发生物电子接口和下一代体外组织模型的基础组件，弥合工程化系统与生理相关性器官型平台之间的差距。
四、实验部分
01.多电极阵列的制造
多电极阵列由导电层和介电层组成。设计最初使用计算机辅助设计软件进行，随后通过插件将工具路径转换为PRG格式，并上传至气溶胶喷射打印系统。接触垫和刺激电极采用蛇形填充图案，而传感电极使用圆形填充图案，两者打印线间距均为70微米。然后使用基于气溶胶喷射的直写工艺配合超声雾化器进行制造，沉积金纳米颗粒和光敏介电墨水以形成导电层和介电层。打印导电层时使用150微米喷嘴，打印参数优化如下：打印速度为8 mm/s，基底温度为50°C，鞘气流量为25 sccm，雾化器气体流量为25 sccm，雾化器超声电流为0.5 A。介电墨水的打印参数如下：打印速度5 mm/s，基底温度50°C，鞘气流量60 sccm，雾化器气体流量21 sccm，雾化器超声电流0.5 A。采用厚度为25微米、具有高透光率的聚酰亚胺薄膜作为基底。在打印金层之前，首先用水和普通肥皂清洁基底以去除任何残留物和污染物。打印金层后，样品在炉中于300°C下烧结1小时，然后再打印介电层。使用气溶胶喷射打印打印光敏介电层，共进行三次打印，每次打印结束后进行紫外固化。使用配备光源的固化系统作为紫外光源，强度设置为70%，照射10秒，光源距离基底约20厘米。介电层的打印参数为：打印速度6 mm/s，鞘气流量70 sccm，雾化器气体流量30 sccm。使用的平台温度和喷嘴尺寸与金层打印时相同。
02.细胞培养孔的制造
为了在多电极阵列上制造细胞培养孔，将聚二甲基硅氧烷与其固化剂按10:1的比例混合，并在真空室中彻底脱气。将未固化的PDMS倒入模具中，在60°C下固化2小时，形成直径为19毫米、高度为3毫米的孔。然后，通过在中间涂覆一层薄薄的未固化PDMS，将PDMS模具固定到聚酰亚胺多电极阵列基底上，并在60°C下进一步固化2小时。
03.光学显微镜和扫描电子显微镜
使用光学显微镜和扫描电子显微镜评估打印质量及多电极阵列的表面形貌。使用光学显微镜进行初步检查。在0.7倍和2倍放大倍数下采集明场图像。选择这些放大倍数是为了捕捉打印中的任何明显缺陷（例如线条扩散、导电迹线不连续）以及更精细的表面形貌特征。
对于更高分辨率的成像和详细的形貌分析，使用扫描电子显微镜进行扫描电子显微镜观察。观察前，样品溅射镀上一层薄金（约5-10纳米）以增强表面导电性并防止充电效应。在5 kV的加速电压和约8毫米的工作距离下采集扫描电子显微镜图像。使用多个放大倍数（例如50倍至3000倍）来评估打印层的微观结构、沉积薄膜的均匀性以及单个电极的完整性。
通过结合光学显微镜和扫描电子显微镜分析，对打印多电极阵列的宏观和微观质量进行了全面评估，确保识别并处理任何潜在缺陷。
04.PEDOT/PSS在气溶胶喷射打印多电极阵列上的电沉积
使用定制的印刷电路板接口将气溶胶喷射打印多电极阵列上的独立寻址电极作为工作电极，铂网电极（4 × 2 cm）作为对电极，Ag/AgCl参比电极连接至恒电位仪，构建三电极电化学池。通过在+0.9 V电位下，在0.01 M EDOT和0.05 M NaPSS溶液中恒电位沉积来实现PEDOT/PSS的电沉积。通过控制通过的电荷总量来控制PEDOT/PSS的沉积总量。将4 × 2 mm的刺激电极电聚合至100 mC cm⁻²的电荷密度。在进行任何进一步表征或细胞实验之前，用去离子水冲洗多电极阵列三次。
05.气溶胶喷射打印电极的电化学表征
使用三电极电化学池进行电化学表征，以寻址电极为工作电极，Ag/AgCl参比电极和10 × 10 mm的铂板为对电极，连接至恒电位仪。使用的电解质为0.01 M磷酸盐缓冲溶液。循环伏安扫描在+0.9 V至-0.9 V（相对于Ag/AgCl）范围内以100 mV/s的扫描速率进行。电化学阻抗谱通过施加10 mV振幅的正弦信号进行测量，频率范围为0.1 Hz至10 kHz，每十倍频程取8个点。通过施加幅度递增的电流控制、电荷平衡、阴极优先、脉宽为1 ms的双相脉冲来确定刺激电极的电荷注入能力。最大电荷注入能力确定为在达到峰峰值1 V的水窗之前可施加的最大电荷量。通过以最大电荷注入能力的60%、在50 Hz频率下施加400,000个脉冲来确定刺激电极的电化学稳定性应力测试，每100,000个循环记录一次电化学阻抗谱特性。通过向每个孔中加入0.5 mL DMEM细胞培养溶液，并将其置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中4周来确定记录电极的稳定性。在孵育前后，对每个多电极阵列上的五个电极进行电化学阻抗谱分析。
06.GelMA合成
研究人员按照之前报道的方案制备GelMA。简言之，将10克明胶（A型）溶解在100 mL PBS中，在50°C水浴中以500-600 rpm搅拌1小时。完全溶解后，将0.6克甲基丙烯酸酐逐滴加入溶液中，反应持续3小时。随后，向溶液中加入200 mL预热至40°C的PBS以终止反应。使用截留分子量为12-14 kDa的透析管在去离子水中进行透析，并在40°C避光环境中保存。一周内每天更换两次透析液。透析后，通过冷冻干燥（-55°C，0.03 mbar，避光7天）获得GelMA泡沫。
07.使用C2C12细胞系进行细胞相容性评估和电刺激引导的细胞排列
无交叉污染的小鼠成肌细胞系C2C12获得自细胞库，并在补充有20%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM中于标准培养瓶内培养。C2C12培养物维持在37°C、5% CO₂的加湿环境中。对于细胞活力实验，收集C2C12细胞并重悬于含有0.25% LAP的10% GelMA前体溶液中，最终细胞密度为5 × 10⁶个细胞/mL。随后，将生物墨水转移到注射器中，针头规格为25G，并装入生物打印机。打印前将喷头在22°C下保持15分钟。将尺寸为5 × 5 × 0.3 mm、间距0.5 mm的立方体结构直接打印到多电极阵列上。然后使用可见光（波长405 nm），以10%的光强度（打印机设置）固化40秒。样本在标准细胞培养基中维持体外培养7天，每天更换两次培养基。孵育结束后，使用LIVE/DEAD细胞活力测定试剂盒测量细胞活力。简言之，将细胞在含有2 µM钙黄绿素-AM和4 µM乙锭同二聚体-1的溶液中于37°C孵育30分钟。绿色荧光的钙黄绿素-AM指示活细胞，红色荧光的乙锭同二聚体-1指示死细胞。然后使用配备有GFP和Texas Red滤光片组的显微镜及10倍物镜对标记的细胞进行成像。
研究发现未修饰的聚酰亚胺基底不足以支持直接细胞实验所需的细胞粘附。因此，进行了基底表面改性以增强细胞粘附。对于细胞排列研究，将1 mL含0.5% LAP的5% GelMA溶液施加到制备好的多电极阵列表面，在室温下放置2小时。然后吸去涂层溶液，将多电极阵列暴露于强度为22 mW cm⁻²的紫外光（405 nm）下30秒。涂层步骤完成后，将0.1 × 10⁶个细胞沉积到多电极阵列中央。15分钟后，加入1 mL培养基。将多电极阵列置于培养箱中，每48小时更换一次培养基。培养3天后，将培养基更换为分化培养基，即补充有10%马血清和1%青霉素-链霉素的DMEM。24小时后开始电刺激，每天刺激3小时，持续7天，以诱导C2C12成肌细胞的排列。使用Intan Technologies的RHS刺激/记录系统配合32通道电极前端进行电刺激，以1 Hz的频率输送1 mA的双相电流脉冲。通过使用任意函数发生器向Intan RHS刺激/记录系统提供模拟信号来实现频率调制。使用肌动蛋白染色试剂对C2C12肌动蛋白进行染色来测量细胞排列。简言之，首先用无菌PBS洗涤C2C12细胞，用4%多聚甲醛固定，然后用0.01% Triton X100透化。然后将染色试剂加入PBS中并施加到透化的细胞上，在室温下孵育30分钟。然后使用配备有GFP滤光片组的显微镜及10倍物镜对细胞进行成像。使用图像分析软件配合插件进行图像分析以确定细胞排列。从多电极阵列的不同区域共采样30张图像用于细胞排列分析。
08.使用HL-1细胞和原代皮层神经元进行细胞外电位记录
无交叉污染的心房来源心肌细胞系HL-1（购自Intan Technologies）按照制造商说明书，在涂覆明胶/纤维连接蛋白（10%/0.5% w/v）的培养瓶中，使用Claycomb培养基（补充有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和0.1 mM去甲肾上腺素）进行培养。HL-1细胞培养物维持在37°C、5% CO₂的加湿环境中。通过在室温下施加1 mL明胶/纤维连接蛋白涂层溶液2小时，对制备好的多电极阵列进行表面涂层处理。然后吸去涂层溶液，将多电极阵列在生物安全柜中干燥15分钟。涂层后，将0.1 × 10⁶个细胞沉积到多电极阵列传感阵列的中心。15分钟后，加入1 mL培养基。将多电极阵列置于培养箱中，每24小时更换一次培养基。在培养3天后，于更换培养基后约30分钟进行电生理记录。
按照先前研究人员的报道，从出生后0-2天的大鼠幼崽中制备原代皮层神经元。所有程序均按照机构动物护理与使用委员会的指南进行。简言之，分离P0-2大鼠皮层，然后去除脑膜。之后，用1.2 U木瓜蛋白酶、0.24 mg/mL L-半胱氨酸和40 µg/mL DNase在37°C下酶解皮层组织30分钟。随后，向解离的组织中加入两倍体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基，并研磨成均匀的细胞悬液。离心后，将神经元重悬并进一步培养于由神经基础培养基、10%胎牛血清、2% B-27补充剂、1% Glutamax和1%青霉素-链霉素组成的培养基中。
通过将1 mL浓度为0.05 mg/mL的聚-D-赖氨酸溶液在室温下过夜孵育，对制备好的多电极阵列进行聚-D-赖氨酸涂层。然后吸去涂层溶液，用无菌PBS洗涤多电极阵列三次。涂层后，将2 × 10⁵个皮层神经元沉积到多电极阵列的中心。然后将多电极阵列置于培养箱中，每48小时更换一次培养基。在培养15-16天后进行细胞外记录。两种细胞类型的细胞外记录均使用Intan Technologies的Intan RHS刺激/记录系统，通过定制的印刷电路板接口，以32通道电极前端和30 kHz的采样率进行。
09.细胞外电位记录的数据分析
使用Intan Technologies提供的代码函数将电记录数据导入MATLAB软件。仅分析来自25个传感电极的数据。原始电信号轨迹使用200至3000 Hz的带通滤波器进行滤波，并应用陷波滤波器以去除50 Hz噪声。脉冲检测通过首先计算每个通道2秒片段的均方根值，然后取平均值以提供每个通道的本底噪声。脉冲检测阈值设置为计算出的均方根值的五倍，并经过筛选仅包括幅度大于-80 µV且小于400 µV的脉冲。所有数据使用Matlab（R2024b版本）进行分析。
10.共形多电极阵列和细胞导管的制造
使用与上述相同的方法制造共形多电极阵列。使用标准聚乳酸线材，通过三维打印机打印用于多电极阵列的三维打印固定支架。该固定支架由一个空心的矩形底部件（两侧带有直径为3毫米的圆柱形切口）和一个相似的矩形顶部件（带有相应的直径为3毫米的圆柱形突起）组成。通过将打印好的多电极阵列夹在中间，制造出一个直径为3毫米的空心圆柱形结构。然后按照上述相同方法，将一个PDMS孔放置在结构顶部并固定。然后使用导电环氧树脂将刺激焊盘连接到细导线上，用于与RHS记录和刺激系统连接。
C2C12导管的制造使用数字光处理打印机。采用由10%（w/v）GelMA、2.5%（w/v）PEGDA、0.1%（w/v）LAP和0.05%（w/v）酒石黄组成的水凝胶单体溶液作为生物墨水。使用计算机辅助设计软件设计导管，其为一个直径为3毫米、高度为7毫米的圆柱体，带有88个直径为200微米的孔。数字光处理打印设置：层厚30微米，曝光1秒，光强度162 mW cm⁻²。
11.电刺激及排列的C2C12管成像
收集C2C12细胞，将0.04 × 10⁶个细胞轻轻移液到打印导管的两端。20分钟后，将导管轻轻放入制备好的共形多电极阵列中，并加入0.5 mL细胞培养基。将共形多电极阵列孵育3天，每24小时定期更换培养基。培养3天后，将培养基更换为分化培养基，即补充有10%马血清和1%青霉素-链霉素的DMEM。24小时后开始电刺激，每天刺激3小时，持续5天，以诱导导管内C2C12成肌细胞的排列。使用Intan Technologies的Intan RHS刺激/记录系统，配合32通道电极前端，以1 Hz的频率输送0.8 mA的双相电流脉冲进行电刺激。对于对照样本，将接种细胞的导管放置在标准细胞培养孔中。
在电刺激结束后对导管进行成像。为了可视化肌动蛋白，采用与前述相同的方案，使用ActinGreen 488 Ready Probes试剂进行染色，并使用DAPI核酸染料对细胞核进行复染。使用倒置共聚焦显微镜，在激光波长为488 nm和405 nm下，以2.5倍和10倍物镜进行共聚焦成像。
12.统计分析
所有结果均以平均值±标准差表示。电化学表征的统计分析使用统计软件进行。数据集之间的统计比较使用非配对双尾t检验确定。p < 0.05的概率被确定为具有统计学显著性。实验重复进行三次或如图注中所定义。
深圳市富临神通科技有限公司（原“东莞市富临塑胶原料有限公司”）是Intan Technologies中国代理商，采购Headstages、芯片、记录系统、刺激/记录系统、SPI线、芯片等电生理产品请立即联系我们。
