夜雨聆风
口腔溃疡是口腔黏膜最常见的炎症之一[1]，以局部灼痛、进食困难和高复发率为主要临床特征。传统敷料（如普通药膜）成本低、易获取，但干燥环境会延缓上皮细胞迁移，减缓愈合进程[2]，且易与新生肉芽组织[3]粘连，造成更换时的二次损伤与疼痛。因此，伤口愈合理论逐渐由“干性愈合[4]”向“湿性愈合[5]”转变。功能型敷料（如水胶体、泡沫及薄膜[6]）能维持适宜的湿性环境[7]，加速细胞增殖与迁移，保留内源性生长因子来促进愈合[8-9]。此外，载药凝胶敷料更是实现了从“环境管理”到“靶向治疗”的跨越。此类敷料能负载多种活性成分，通过局部精准给药显著提高生物利用度，有效规避全身性不良反应，并对伤口愈合的不同病理阶段（止血、炎症、增生和重塑[10-12]）进行干预。
近年来，基于天然产物的药用敷料日益受到关注，其核心优势在于多靶点[13]、协同作用机制。姜黄素是从姜黄Curcumalonga L.根茎中提取的疏水性多酚[14]，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗癌和促进细胞凋亡[15-16]等作用，在创面愈合治疗中展现出独特潜力。但姜黄素水溶性差、口服生物利用度低[17]，且具有显著的光不稳定性[18]，严重限制其临床应用。现有用于口腔溃疡的载姜黄素敷料，如Liu等[19]报道的金属有机框架微针贴片载药量低且穿刺易致黏膜损伤；Guo等[20]研究的聚氨酯姜黄素贴片残留碎片可能刺激黏膜。
低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES）为克服上述缺陷提供了新策略，它通常是由氢键供体（hydrogen bond donor，HBD）和氢键受体（hydrogen bond acceptor，HBA）通过氢键作用形成的熔点低于任一组分的物理混合物[21]。通过调控各组分的种类、物质的量配比及含水量，可实现对其相行为、物理性质及溶解性能的定向设计。其中，氨基酸基DES兼具来源广、成本低、可设计性强、可生物降解[22]等优势，能高效溶解姜黄素、提升其光稳定性，为创面敷料提供了理想的药物递送平台。
本研究旨在构建以脯氨酸和乳酸为功能组分的DES体系，通过优化处方组分提高姜黄素的溶解度；进而将该DES体系与光固化生物高分子材料（gelatinmethacryloyl/chitosan methacryloyl，GelMA/CSMA）复合，结合3D打印技术制备载姜黄素氨基酸基低共熔凝胶敷料。系统评价该凝胶敷料的理化性能（包括流变学、溶胀、机械及黏附性能）、药物释放行为及生物相容性，并构建SD大鼠口腔溃疡模型验证其治疗效果，以期为口腔溃疡的局部治疗提供新型功能性敷料。
1仪器与材料
1.1仪器
AB135-6型分析电子天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；Nicolet iS型傅里叶变换红外光谱仪、Multifuge X1R型台式通风型离心机、MultiskanFC型酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；SU8010型扫描电子显微镜，日本日立有限公司；HD 600 MHz型核磁共振氢谱仪，德国Bruker Physik-AG公司；TU-1900型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；X’Pert PRO型XRD分析仪，荷兰Panalytical公司；LGJ-10型真空冷冻干燥机，北京松原华兴科技有限公司；Mono X型3D打印机，深圳纵维立方科技有限公司；DHR 20型旋转流变仪、XT Plus型质构仪，美国TA公司；动物生化分析仪，深圳迈瑞动物医疗科技股份有限公司。
1.2试剂
苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP），上海引昌新材料有限公司；姜黄素、醋酸、柠檬酸、甘油、甲醇，国药集团化学试剂有限公司；L-精氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸，上海麦克林生化科技有限公司；甘露醇、苹果酸，阿拉丁试剂有限公司；壳聚糖、明胶、甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride，MA）、碳酸氢钠、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮［2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone，I2959］、乙酸、柠檬黄、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦［diphenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphine oxide，TPO］，上海阿拉丁生化科技有限公司；乳酸，上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS），武汉博士德生物工程有限公司；DMEM高糖培养基、CCK-8试剂盒、Calcein-AM/PI活/死细胞染色试剂盒，碧云天生物技术有限公司；青/链霉素，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清，杭州天杭生物科技有限公司。
1.3动物
SPF级雄性SD大鼠40只，体质量180～200 g，购自浙江省医学科学院动物中心，合格证号为20220009019261。该研究获得浙江工业大学实验动物伦理委员会批准，伦理号为MGS20240313009。
2方法与结果
2.1氨基酸基姜黄素DES的制备及最优比例筛选
2.1.1氨基酸基DES的制备按照表1所示物质的量比将各氢键供体与氢键受体混合，于80 ℃恒温水浴搅拌加热至形成澄清、均一的体系。用偏振光显微镜判断样品中是否有晶体残留或析出。结果如图1所示，15种DES视野内均无亮斑或几何晶体出现，表明制备成功。
2.1.2 姜黄素标准曲线的建立精密称取姜黄素对照品，甲醇溶解后于200～600 nm扫描，确定最大吸收波长为420 nm。配制1～6 μg/mL系列质量浓度的姜黄素对照品溶液，避光测定其在420 nm处的吸光度（A）值，绘制标准曲线，进行线性回归，得到线性回归方程为Y＝0.160 6 X＋0.005 3，R2＝0.999 7，结果表明姜黄素在此质量浓度范围内与A值呈良好的线性关系。
2.1.3不同氨基酸基DES对姜黄素溶解度的影响考察及Cur-DES的制备按照“2.1.1”项下筛选出的15种DES的物质的量比配制不同溶液，并向其加入过量的姜黄素，取适量用甲醇溶解后参照“2.1.2”项下方法测定姜黄素溶解度。测定结果见表2。当脯氨酸与乳酸物质的量比为1∶12时，姜黄素有最佳溶解度（0.789 mg/mL），并以此制备Cur-DES溶液。
2.1.4傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）与核磁共振氢谱（nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H-NMR）分析
（1）FT-IR：精密称取脯氨酸、乳酸、脯氨酸-乳酸（1∶12）样品各1 mg，分别与100 mg干燥、光谱纯的溴化钾粉末按比例混合，经研磨、压片处理后，利用傅里叶变换红外光谱仪进行检测。设定扫描光谱范围为400～4 000 cm−1，分辨率为4 cm−1。
（2）1H-NMR：精密称取5 mg脯氨酸-乳酸（1∶12）样品溶于0.5 ml氘代甲醇，转移至核磁管中，使用核磁共振仪采集1H-NMR谱进行结构表征。
（3）FT-IR和1H-NMR分析结果：结果如图2、3所示。在FT-IR谱图（图2）中，脯氨酸-乳酸（1∶12）与单独的脯氨酸和乳酸相比，在3 200～3 500 cm−1区域吸收峰明显展宽并向低波数方向发生红移，证明体系中形成了氢键。此外，脯氨酸-乳酸（1∶12）在1 700 cm−1附近的C＝O伸缩振动区峰位发生了微小移动和强度变化，进一步说明分子间相互作用增强。再结合1H-NMR谱图（图3），可以证明目标产物脯氨酸-乳酸（1∶12）制备成功。
2.1.5稳定性考察
（1）存储稳定性：将Cur-DES置于室温［（25.0± 0.2）℃］下，于30 d内的特定时间点（1、2、3、4、5、7、14、21、30 d）取样，在最大吸收波长处测定其A值以评价其稳定性。
（2）光照稳定性：对比姜黄素在氨基酸基DES和甲醇体系中，经4 h强光［（4 500±500）lx］直射前后的A值变化，以评估氨基酸基DES对姜黄素的光保护作用。
（3）稳定性考察结果：结果如表3、4所示。表3结果显示，样品A值在14 d内保持稳定，30 d内整体变化较小，表明体系中姜黄素未发生明显沉淀或聚集，分散性良好，短期储存稳定性较好。表4结果显示，强光照射4 h后，姜黄素在氨基酸基DES中的A值由3.53降至3.45（降解率2.27%），而甲醇溶液中的姜黄素由2.84至1.13（降解率60.21%），表明Cur-DES具有良好的光稳定性。降解率计算公式如下。
降解率＝(A0－A1)/A0
A0表示光照前A值，A1表示光照后A值
2.2氨基酸基DES凝胶敷料的制备
2.2.1CSMA与GelMA的制备将1 g壳聚糖溶于100 mL 1%醋酸溶液中，制备0.01 g/mL壳聚糖溶液。随后，缓慢滴加0.5 mL MA，于60 ℃水浴中反应12 h。然后，采用饱和碳酸氢钠溶液中和反应液，并使用截留相对分子质量为8 000～14 000的透析袋连续透析5 d（每日更换去离子水2次）。最后，经−80 ℃预冻及24 h冷冻干燥，即得白色海绵状固体甲基丙烯酰化壳聚糖（methacrylated chitosan，CSMA）。
将10 g明胶溶于100 mL预热的PBS中，避光条件下缓慢滴加10 mL MA，反应3 h。加入200 mL PBS终止反应，所得溶液经离心处理后，采用截留相对分子质量为8 000～14 000的透析袋连续透析7 d（每日换去离子水2次）。最后，产物经−80 ℃预冷及24 h冻干，即得白色泡沫状液体甲基丙烯酰化明胶（methacrylated gelatin，GelMA）。
2.2.2CSMA与GelMA的表征
（1）FT-IR：精密称取CSMA、GelMA、明胶、壳聚糖样品各1 mg，与100 mg干燥、光谱纯的溴化钾粉末充分混合。在波数4 000～400 cm−1区域进行表征，通过对比壳聚糖、明胶的FT-IR验证反应是否成功。结果如图4、5所示。图4中，CSMA在1 659、1 540、1 310 cm−1处对应的酰胺键（-NH-CO-）的特征吸收峰的强度，较壳聚糖明显增强，同时在1 730～1 740 cm−1区域无明显吸收峰，证实了MA与壳聚糖发生了N-酰化反应并具有良好的选择性。图5结果显示，与明胶相比，GelMA在1 640 cm−1（酰胺带I，C=O伸缩振动）和1 537 cm−1（酰胺带II，N-H与C-N耦合）处的吸收峰强度及峰形发生了明显变化，表明明胶中的-NH2与MA发生了缩合反应，成功引入了甲基丙烯酰基，证明GelMA制备成功。
（2）1H-NMR：精密称取壳聚糖、CSMA、明胶、GelMA样品各5 mg，分别溶解于0.50 mL氘代水（D2O）中，经超声处理至完全溶解后，转移至核磁管以供氢谱测定。1H-NMR谱图进一步证实了化学改性的成功，结果如图6所示。CSMA较壳聚糖在δ5.4～5.6处新增了乙烯基质子峰，并在δ 1.8处出现了甲基峰，证实MA成功接枝到壳聚糖分子链上。同样，GelMA在δ 5.24、5.62处出现了归属于烯烃双键的特征峰，证明明胶已顺利完成甲基丙烯酰化改性。
2.2.3氨基酸基姜黄素DES凝胶敷料处方设计处方的选择首先，制备不同CSMA-GelMA用量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）的水凝胶，通过对比I2959与LAP的成胶时间与交联速率筛选出较优的光引发剂。随后，采用单因素实验优化不同用量CSMA（0.5%、1.0%）与GelMA（5.0%、10.0%）复合基质、光引发剂LAP用量（0.05%、0.10%、0.20%、0.30%）、光吸收剂柠檬黄用量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%）、DES用量（10%、20%、30%、40%、50%）及打印参数（层高、曝光时间）。
使用SolidWorks 2020 3D建模软件构建标准模型（图7），经Photon WorkShop V2.1.24软件切片后导入3D型打印机成型。最后通过游标卡尺测量尺寸偏差以确定最优工艺条件。结果见图8～12和表5～7。
图8为不同凝胶光交联的示意图。成胶时间随CSMA与GelMA用量的增加而缩短。同等用量下，LAP引发速率高于I2959，固化效率更佳，故选其为光引发剂（表5）。表6为不同打印条件下的打印结果，图9～12为不同打印条件下圆柱体及哑铃形厚度与直径的变化。综合图表来看，CSMA与GelMA用量对样条宏观尺寸无显著影响，但高浓度体系会导致宽度偏差增大。这是因为光交联密度的增加，诱发了边缘过度固化，且所得疏松的三维网络结构可能干扰药物释放。权衡成型质量与结构特性，选定C1G5（1% CSMA/5% GelMA）为最优基质组合（图9），并确定LAP用量为0.10%（图10）。随柠檬黄用量从0.01%增至0.04%，圆柱体厚度相对稳定，而哑铃形长度和厚度及圆柱体直径呈下降趋势（图11）。0.02%柠檬黄的打印偏差最小，成型精度最优，故选其为最佳用量。DES含量对打印实体成型性影响较小，但打印尺寸普遍高于标准值，可能因其氢键结构增强光吸收导致过度固化。占比过高会导致可交联双键密度降低，降低凝胶强度并增大尺寸波动，综合考虑选定20%为最佳添加量（图12）。打印参数方面（表7），50 μm层高因精度不足致形态缺失，150～200 μm则出现过度固化，故选定100 μm为最佳层高；曝光时间20 s交联不充分，30 s过度交联致厚度偏差过大，故确定25 s为最优曝光时间。
综上，基于最优处方组成、用量及打印工艺参数制备CSMA-GelMA-Cur，CSMA-GelMA-DES-Cur凝胶敷料。具体为（总量为100 g）：1% CSMA，5% GelMA，0.1% LAP，0.02%柠檬黄，20% DES（含14.35 mg Cur），73.88%去离子水。该条件下，凝胶成型完整、尺寸偏差小、机械性能适宜，可适配口腔溃疡敷料的制备需求。
2.3氨基酸基DES凝胶敷料体外性能研究
2.3.1形态学测定将冷冻干燥后的CSMA-GelMA和CSMA-GelMA-DES复合凝胶经液氮脆断，用导电胶将断面粘贴于金属载物台一侧，喷金处理后，采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（加速电压6 kV）观察其多孔结构。结果（图13）显示，CSMA-GelMA-DES凝胶具有均匀的多孔结构，平均孔径约50 μm，且孔隙分布均匀。与CSMA-GelMA相比，其平均孔径明显更小，内部互联结构更为致密。这主要归因于DES与CSMA及GelMA分子间的氢键作用，提高了体系的交联密度。
2.3.2流变学行为测定在25 ℃、应变1%的条件下，对CSMA-GelMA及CSMA-GelMA-DES前驱体溶液进行动态频率扫描（0.1～100 rad/s），测定其储能模量（G′）与损耗模量（G″），每组重复3次。结果（图14）显示，低频区G″＞G′，体系呈类液体行为；随着角频率增加，G′增速超过G″，体系逐渐向类固体转变，弹性响应占主导。该流变特性由交联速率与交联密度决定，直接影响给药系统在黏膜环境中的机械强度与弹性行为。
2.3.3溶胀性能测定将制备的等尺寸圆柱形凝胶（Φ 20 mm×H 10 mm）浸没于37 ℃的PBS中。定期取出凝胶样品，用滤纸轻轻吸干多余水分后称定质量，重复操作直至溶胀平衡。结果如图15所示，随着GelMA与DES组分的加入，凝胶溶胀率逐渐降低，并于6 h达到溶胀平衡。结果表明，通过组分优化可有效抑制过度溶胀，保障凝胶在湿润生理环境中的结构稳定性。溶胀率计算公式如下。
溶胀率＝(Wt－W0)/W0
W0和Wt分别为初始和预设时凝胶的质量
2.3.4机械性能与黏附性能测定机械性能采用质构仪以30 mm/min的速度压缩圆柱形凝胶至断裂，记录应力-应变曲线，同时获得压缩强度，重复3次。
体外黏附力测试用质构仪测定。取1 cm2生理盐水清洗后的新鲜鸡蛋膜固定于P6探头，凝胶表面滴加100 μL人工唾液浸润后，以0.5 mm/s速度、0.049 N触发力按压30 s，再以相同速度拉伸分离，记录最大分离力。
黏附时间参照小杯桨法测定。将1 cm2鸡蛋膜固定于搅拌桨，滴加人工唾液按压1 min后，加入100 mL人工唾液于37 ℃、30 r/min条件下搅拌，记录脱落时间。
结果如图16和表8所示，与未加DES的软脆凝胶相比，CSMA-GelMA-DES水凝胶压缩强度显著提升。这归因于DES的氢键网络与聚合物链相互作用，增强了其力学性能。该凝胶在湿润状态下，最大黏附力达2.5 N，持续时间约为25 min。这种湿态黏附性能，有助于凝胶在复杂口腔环境下的稳定滞留，从而有效保护受损黏膜并促进其生物功能恢复。
2.3.5 体外药物释放考察将CSMA-GelMA-DES-Cur凝胶封装于截留相对分子质量为3 500的透析袋中，浸入200 mL含0.75%聚山梨酯80的PBS（满足漏槽条件）中，37 ℃恒温摇床中振荡。在预设时间点取样2 mL，并立即补足等温、等体积的新鲜PBS。采用紫外分光光度计测定最大吸收波长处的A值。计算姜黄素的质量浓度及累积释放率。结果（图17）显示，2组凝胶均表现为前10 h快速释放、后趋于平缓（至72 h）的缓释特征。其中，CSMA-GelMA-DES-Cur组的累积释放率约为45%，显著高于未添加DES组，这是由于DES抑制了打印过程中姜黄素的析出，提升了该制剂的载药稳定性与生物利用度。结果证实该体系作为口腔黏膜给药系统具有良好的临床应用潜力。
2.3.6生物相容性考察
（1）体外细胞毒性评价（CCK-8法）：取对数生长期的小鼠成纤维细胞L929，以5 000个/孔的密度接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h待其贴壁。分别取CSMA-GelMA、CSMA-GelMA-DES、CSMA-GelMA-DES-Cur样品75 mg于5 mL含10%胎牛血清完全培养基中浸提（37℃，避光）12 h。弃96孔板原培养基，然后加入各组浸提液100 μL，空白组（不接种细胞）、对照组均加入不含药物的培养基。继续培养24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，孵育2 h。利用酶标仪测定细胞活性。结果如表9所示，各组细胞存活均维持在90%以上，且组间无显著差异。细胞存活率计算公式如下。
细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白)
A实验为实验组测得的A值，A空白为空白组测得的A值，A对照为对照组测得的A值
（2）活/死细胞染色实验：采用钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对L929细胞进行活/死细胞染色实验表征材料毒性。将L929细胞接种于35 mm共聚焦小皿，分别取CSMA-GelMA、CSMA-GelMA-DES、CSMA-GelMA-DES-Cur样品75 mg于5 mL完全培养基中浸提（37 ℃，避光）12 h。加入紫外灭菌的凝胶浸提液1 mL作为实验组，加入等体积完全培养基作为对照组，共培养48 h后，弃去培养基并用PBS清洗。每孔加入100 μL含2 μmol/L Calcein-AM与PI的染色工作液，37 ℃避光孵育30 min，再次以PBS清洗后于共聚焦显微镜下观察。结果如图18和表10所示，染色24、48 h时，镜下观察显示各组细胞形态正常，表明所用材料对细胞具有良好的生物相容性。且在48 h时，CSMA-GelMA-DES-Cur组表现出更强的细胞增殖活性。
（3）细胞迁移实验：采用划痕实验评估凝胶对细胞迁移的影响。分别取CSMA-GelMA、CSMA-GelMA-DES、CSMA-GelMA-DES-Cur样品75 mg置于5 mL无血清培养基中浸提，无菌过滤后备用。当6孔板内L929细胞达90%～100%密度时，用200 μL枪头划痕，PBS清洗后加入浸提液干预。分别于0、24 h在光学显微镜下观察划痕愈合情况，计算细胞迁移率。结果（图19和表11）显示，L929细胞与载姜黄素凝胶提取物共培养24 h后，其迁移率较对照组显著提高。这表明该凝胶可有效促进细胞迁移，为口腔黏膜缺损愈合提供了有利的治疗潜力。计算公式如下。
迁移率＝(A0－At)/A0
A0表示初始划痕面积，At表示在t时刻的划痕面积
2.4氨基酸基DES凝胶敷料药效学研究
2.4.1口腔溃疡模型的构建与给药选择20只适应性喂养5 d的SD大鼠，经异氟烷麻醉，在其左下颊黏膜注射0.1 mL 50%冰醋酸溶液诱导溃疡。24 h后，实验区出现明显溃疡，表面呈黄白色，有部分溃疡渗出，表明建模成功。随后采用完全随机分组法将大鼠分为4组：对照组、阳性对照组、CSMA-GelMA-Cur组、CSMA-GelMA-DES-Cur组。给药时将打印凝胶敷料在溃疡区域轻压30 s，确保紧密贴合，每次给药时间不少于30 min。阳性对照组给予市售醋酸地塞米松贴片（0.3 mg/片，SD大鼠体质量300 g，采用体表面积换算系数6.17，每只大鼠的剂量为9.30 µg），每日1次；对照组正常饲养，不给予药物处理。实验组每日给药1次，连续给药7 d。各组均于给药后2 h内禁食禁水，以保证药物的疗效。
2.4.2大鼠溃疡面积记录第1、3、5、7天拍照记录大鼠溃疡，并用Image J软件计算愈合率，结果见图20和表12。造模2 d后各组创面无明显差异；持续给药5～7 d后，各组溃疡面积均减小。CSMA-GelMA-DES-Cur组愈合效率不仅优于地塞米松贴片，且明显高于不含DES的对照组，表明DES可提高姜黄素溶解度与生物利用度。该载药凝胶贴片在口腔溃疡治疗中具有临床潜力。
2.4.3溃疡面组织病理学分析建模后第7天处死大鼠，取溃疡周围口腔黏膜组织，经生理盐水漂洗、4%多聚甲醛固定24 h后，脱水、石蜡包埋、切片。经苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色、脱水封片后，于光学显微镜下观察上皮结构及炎症细胞浸润情况。结果（图21）显示，对照组口腔黏膜上皮结构破坏，基底层大量中性粒细胞浸润，炎症程度高；阳性对照组及CSMA-GelMA-Cur组炎症细胞浸润程度低于对照组；CSMA-GelMA-DES-Cur组上皮结构完整，中性粒细胞密度显著降低，炎症浸润明显减少。上述结果表明，CSMA-GelMA-DES-Cur组对口腔溃疡炎症具有良好的治疗作用。
2.4.4大鼠体质量记录每天记录各组大鼠的体质量，观察大鼠生长状况及是否正常进食、饮水。结果如表13所示，造模初期，大鼠因溃疡疼痛导致摄食量下降，体质量增长缓慢；随治疗推进，各组体质量均有所回升。CSMA-GelMA-DES-Cur组与其他各组相比，不仅在整个实验过程中体质量持续上升，且在第7天达到最高值。结果表明，CSMA-GelMA-DES-Cur能够有效改善溃疡疼痛导致的体质量增长缓慢的问题。
2.4.5安全性指标考察选取20只SD大鼠，适应性喂养5 d后，按完全随机分组法分为4组：对照组、阳性对照组（醋酸地塞米松贴片）、CSMA-GelMA-Cur组及CSMA-GelMA-DES-Cur组。按照“2.4.1”项下方法给药，末次给药后24 h处死大鼠。采集口腔黏膜组织制备切片（按照“2.4.3”项下方法），观察组织病理学变化，同时采集血液分离血清，采用动物生化分析仪检测肝功能指标：丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST），肾功能指标：肌酐、尿素。
结果（图22）显示，各组上皮结构完整，无明显炎症细胞浸润及组织坏死，表明所用材料无显著刺激性，生物相容性良好。表14显示各生化指标与对照组无显著性差异，均处于生理参考范围内，无肝肾毒性。综上所述，该材料表现出良好的体内安全性。
3讨论
本研究成功开发了一种基于脯氨酸-乳酸的DES可打印凝胶敷料，为口腔溃疡治疗提供了一种新的解决方案。与以往报道中采用的传统DES（如Parsana等[23]报道的氯化胆碱-乙二醇体系）相比，本研究创新性地选用氨基酸基DES，从源头规避了传统DES潜在的生物安全性风险。脯氨酸与乳酸经分子间氢键形成稳定的DES体系，该体系可能与姜黄素之间形成强静电相互作用和氢键作用，从而显著提升姜黄素的溶解度，为天然活性成分的高效递送提供新策略。将该DES引入以GelMA/CSMA为基质的光固化体系后，可能通过氢键作用与聚合物分子链上的氨基、羟基等活性基团发生分子间交联，进而提高体系的交联密度，形成更为致密且均匀的多孔网络结构（孔径约50 μm）。这种分子组装方式不仅提升了凝胶的机械强度与黏附性能（2.5 N），还表现出约500%的高溶胀率，使其能动态适配口腔湿润环境。通过系统优化3D打印工艺参数，制备出兼具优异成型精度与个性化适配能力的新型敷料。体外生物相容性实验证实细胞存活率超过90%，体现了良好的安全性。在SD大鼠口腔溃疡模型中，该敷料通过DES调控的药物缓释行为，有效减轻中性粒细胞浸润并显著促进创面愈合。
但本研究仍存在诸多局限性，需结合后续研究完善以推动临床转化。首先，在模型相关性方面，SD大鼠口腔溃疡模型在发病机制、局部微环境等方面与人体存在差异，这可能影响疗效预测的准确性。其次，长期生物安全性有待深入评估，包括敷料降解产物的潜在毒性，以及DES组分在体内的代谢行为。此外，3D打印技术的临床转化面临成本与规模化生产的挑战。尽管3D打印技术近年来在生物医药领域的应用日益广泛（如Yang等[24]报道的个性化骨骼修复支架，Shinde等[25]开发的可打印水凝胶生物墨水体系），但其打印产品质量均一性以及标准化生产流程等方面仍是未来产业化生产需要解决的问题。最后，本研究动物实验中阳性对照组起始体质量低于其他组，可能是造模或者随机分组过程中的个体差异导致。
综上所述，本研究通过DES与3D打印技术的有机结合，构建了一个集高效载药、可控释放与优良生物相容性于一体的局部药物递送平台。尽管仍面临模型相关性、长期安全性及临床转化可行性等方面的挑战，但本研究为将难溶性天然活性成分转化为临床疗法提供了具有前景的策略。后续研究方向可包括系统评价敷料的长期生物安全性、优化打印工艺以降低成本等，以验证其临床应用潜力。
