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10XscATAC的结果说明（6）之fragments.tsv

方老师小课堂

前言

上一期，我们介绍了singlecell文件，本期我们介绍一类在scATAC数据 中比较重要的文件：fragments.tsv。这是最原始记录开放区域的矩阵，是一切scATAC下游分析的起始，下面我们开始介绍他的基本情况吧。

fragments.tsv的由来

其实本身fragments.tsv文件属于bed文件的延伸，是cellrangerATAC软件分析出来的每个捕获的开放区域片段的位置和计数情况。由于每个fragments由两个独立的转座事件产生，这两个事件形成了所观察fragments的两端。每个唯一fragments可能会生成多个重复reads。这些重复reads会被合并为一个fragments记录。

可以看到除却表头带“#”的文件注释内容，本身文件分成5列，前3列其实就是和bed文件一样。因此，我将fragments.tsv称为是bed文件的延伸。

该fragments的BED区间是通过调整测序read-pair的BAM比对区间得到的。区间的起点从最左端的比对位置向前移动4个碱基对（bp），从最右端的比对位置向后移动5个碱基对。转座酶切割带有9个碱基对悬突的两条DNA链，调整后的位置表示这些切口之间的中心点。该位置被记录为一个切割位点，代表一个染色质可及性事件。因此这是最原始统计的fragments的情况，后续可基于这个文件进行peaks calling计算peaks矩阵。

fragments.tsv的数据结构

fragments.tsv总共分成5列，前3列是bed文件的格式。

第一列是该fragments位于哪个染色体； 

第二列是该fragments位于染色体的起始位置； 

第三列是该fragments位于染色体的终止位置； 

第四列是该fragments记录的所属的细胞cellbarcodes； 

第五列是该fragments记录与此fragments相关的读取对总数。这包括标记为唯一的读取reads和所有重复的读取reads。

下游如何读取文件

在signac中，我们会使用CreateChromatinAssay函数对fragments文件进行读取处理，加载到矩阵中，创建一类ChromatinAssay结果，参数情况如下： 

counts：读取的filtered_peak_bc_matrix.h5生成的矩阵； 

sep：分隔符替换 有些可能存在":"分割的 替换成"-"； 

fragments：就是提供fragments.tsv文件所在路径； 

min.cells：过滤参数，一个features最少在多少个细胞中检测到；

min.features：过滤参数，一个细胞中最少检测到多少个features。

最终我们就根据我们之前介绍的singlecell和filtered_peak_bc_matrix.h5以及这次介绍的fragments.tsv，使用CreateSeuratObject创建seurat对象就完成了scATAC的数据读取工作。

counts <- Read10X_h5(filename = "10k_pbmc_ATACv2_nextgem_Chromium_Controller_filtered_peak_bc_matrix.h5")metadata <- read.csv(  file = "10k_pbmc_ATACv2_nextgem_Chromium_Controller_singlecell.csv",  header = TRUE,  row.names = 1)chrom_assay <- CreateChromatinAssay(  counts = counts,  sep = c(":", "-"),  fragments = "10k_pbmc_ATACv2_nextgem_Chromium_Controller_fragments.tsv.gz",  min.cells = 10,  min.features = 200)pbmc <- CreateSeuratObject(  counts = chrom_assay,  assay = "peaks",  meta.data = metadata)

bcftools index -t fragments.tsv.gz