文档内容
第 2 节 微生物的培养技术和应用
知识梳理
教学目标
课程标准 目标解读
获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。 1. 阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养
物的前提。
2. 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌产品与
无菌区域不被微生物污染的技术。
3. 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养
某种微生物。
4. 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养
某种微生物。
5. 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进
行微生物分离和纯化的常用方法。
6. 概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生
物数量的常用方法。
教学重点
1.微生物纯培养的基本操作要求。
2.酵母菌的纯培养。
3.微生物选择培养的原理。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。
教学难点
1.酵母菌的纯培养。
2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。
一、培养基
1.培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.培养基的类型及用途
（1）按物理性质分：
固体培养基 用于菌种分离、鉴定、计数
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂液体培养基 用于工业生产、连续培养
半固体培养基 用于菌种保存
（2）按化学组成分：
天然培养基 用于工业生产
合成培养基 用于菌种分离、鉴定
（3）按目的用途分：
选择培养基 添加或缺少某种化学成分 用于菌种分离
鉴别培养基 添加某指示剂或化学药剂 用于菌种鉴别
3.培养基的营养成分
培养的基本配方：不管哪种培养基，一般都含有碳源、氮源、水和无机盐等营养物质,另外还需要满足微生
物生长对pH、特殊营养物质(例如:生长因子)以及氧气的要求。
二、无菌技术
1.获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，防止外来杂菌入侵的保证是无菌技术。
2.无菌技术（操作）泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
无菌技术包括：实验操作空间消毒；操作者的手、衣着消毒；实验用具、器皿、培养基灭菌；实验操作过
程，酒精灯火焰附近进行；实验操作时，避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
无菌技术目的：防止实验室的培养物被其它外来微生物污染；避免操作者被微生物感染。
3.消毒与灭菌的概念及两者的区别
（1）消毒：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。（不
包括芽孢和孢子）
（2）灭菌：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌之过程。
4.常用的消毒与灭菌的方法
(1)消毒的方法：
煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
巴氏消毒法：62-65 ℃下煮30min 或 80-90 ℃ 处理30s-1min
化学药剂消毒法:用75%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源
紫外线消毒
（2）灭菌的方法：
灼烧灭菌：在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。灭菌时保证热空气流通。
湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽、高压蒸汽灭菌（常用）。高压蒸汽灭菌，100kPa、121 ℃下维持15-
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂30min.它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分
不破坏。
三、微生物的纯培养
培养物：将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
纯培养物及纯培养：由单一个体繁殖所得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程称为纯培养。
纯培养步骤：配制培养基、灭菌、接种、分离、培养
酵母菌的纯培养
（一）实验原理
1.菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细
胞群体，即菌落。
2.方法：平板划线法和稀释涂布平板法
采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是
由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
3.培养基：马铃薯琼脂培养基
（二）目的要求
（三）材料用具
（四）方法步骤
1.制备培养基
配制培养基
加琼脂的目的是什么?作为凝固剂
2.灭菌
调pH：pH7.6（用 0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液把培养基调节到所要求的值）
分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角瓶的量
以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸
湿棉塞，在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用。
倒平板 待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。如果有菌落生
长，说明培养基已被污染。
3.接种和分离酵母菌
原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数
次划线后培养，可以分离得到单菌落。
接种方法：平板划线法
4.培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右
（培养温度因酵母菌种的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24-48h，分别观察记录结果。
四、微生物的选择培养
（一）选择培养基
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养
基。
实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或
阻止其他微生物生长。
（二）选择培养的方法
稀释涂布平板法：稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固
体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里， 聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从
而
能在培养基表面形成单个菌落。
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放在30-37℃恒温箱中培养1-2d，平板上就可以观察到单菌
落。
（三）微生物的数量测定
常用方法：稀释涂布平板法、显微镜直接计数法、滤膜法
1.稀释涂布平板法（也叫活菌计数法、间接计数法）
原理：成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，
来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
操作：①设置重复组，目的是增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个
稀释度的菌液，分别取0.1ml接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，
放在适宜的温度下培养计数菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平
板上，经涂布培养，计算出菌落平均数。②为了保证结果的准确，一般选择菌落数在30—300的平板进行
计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。
2.显微镜直接计数法
（1）原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。
（2）方法：用血细胞计数板计数。
计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为1mm2，高为0.1mm的计数室，一个计数室又被分成25个
（或16个）中格，每个中格再被分成16个（或25个）小格，每个计数室都由400个小格组成。
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂（3）操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4~5个中格中的细菌数，并求
出每个小格所含的细菌数，再按计数公式求出每毫升样品中所含的细菌数。
（4）计算公式
（5）缺点：不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
3.滤膜法
大肠杆菌菌落呈黑色或深
紫色,有金属光泽
以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基
上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大
肠杆菌的数量
原理：伊红—美蓝培养基(EMB)是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为大肠杆
菌的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色或黑色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，
并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂（四）探究实践一：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（一）课题背景
1.尿素的利用：尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨
之后才能被植物利用。
2.细菌利用尿素的原因：土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶，
3.常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某
些真菌和放线菌也能分解尿素。
（二）课题目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
（三）实验原理
在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不
能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，从而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微
生物。
（四）实验流程：土壤取样、制备培养基、样品稀释、取样涂布、微生物培养、观察并记录结果、细菌计
数、对分离的菌种做进一步鉴定
1.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
2.制备培养基：设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
3.样品稀释：将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，
吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度。
由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个
稀释度下需要3个选择培养基，1个基础培养基，因此共需要15个选择培养基，5个基础培养基。此外，
还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。
◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆不同微生物在土壤中含量不同；保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。
微生物的种类 土壤稀释倍数 目标
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂分离土壤中所有细菌 104、105、106
分离土壤中的放线菌 103、104、105
平板上的菌落数应为30～300个，便于准确计数。
分离土壤中的真菌 102、103、104
分离土壤中的尿素细菌 104、105、106、107
◆为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条
件。
4.取样涂布
按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不
必更换移液管。
◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落
的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
5.微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。
微生物的种类 培养温度 培养时间 观察时间
细 菌 30～37℃ 1～2d ①每隔24h统计一次菌落数，选取菌落数目稳定
时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导
霉 菌 25～28℃ 3～4d
致遗漏菌落的数目。②仔细观察并记录菌落的
（形状、大小、隆起程度和颜色等）特征。
放线菌 25～28℃ 5～7d
将涂布好的培养皿放在某（如：30 ℃）温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。
6.观察记录
比较基础培养基和选择培养基中菌落的数量、形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，并做好记录。
7.细菌计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复
计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
8.进一步探究：对分离的菌种做进一步鉴定
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如图的
颜色反应。
因为在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升
高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
（五）拓展应用：分解纤维素的微生物的分离
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂1.实验原理
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 C 酶、 C 酶和葡萄糖苷酶，前两种酶
X 1
使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
（2）纤维素分解菌的筛选
刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选
原理：刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。
当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的
透明圈 。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
2.实验流程
五、平板划线法和稀释涂布平板法的比较
作用 优点 缺点 适用范围
平板划 可以观察菌落特征，对混合菌进 不易分离出单个菌落，不能
适用于好氧菌
线法 都能使 行分离 计数
稀释涂 细菌纯 吸收量较少、较麻烦；
能使单菌落分离，便于计数；可 适用于厌氧菌和兼
布平板 化
以观察菌落特征 性厌氧菌
法 平板不干燥效果不好；
课后培优练级
练
培优第一阶——基础过关练
一、单选题
1.下列关于微生物的分离和培养的有关叙述，错误的是（ ）
A. 微生物培养前，需对培养基进行消毒
B. 分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度
C. 测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法
D. 分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
2.需要在火焰旁操作的有（ ）
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液 ④涂布平板 ⑤微生物的培养
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂A. ①②③④⑤ B. ②③④ C. ③④⑤ D. ②③④⑤
3.下列有关微生物培养或纯化的叙述，错误的是（）
A. 微生物在培养前要先对培养基进行灭菌处理再接种
B. 培养液中溶氧量的变化会影响酵母菌的繁殖和代谢途径
C. 分离自养型微生物的方法是用纤维素作为唯一碳源的培养基进行培养
D. 分离纯化微生物的常用方法是平板划线法和稀释涂布平板法
4.下列关于微生物培养的叙述，不正确的是（）
A. 倒置平板可防止培养皿盖上冷凝水滴落，造成污染
B. 高温灭菌的目的是杀死微生物的细胞、孢子、芽孢
C. 划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落
D. 稀释涂布平板法易获得单菌落和计数活菌数目
5.下列有关说法错误的是（）
A. 筛选尿素分解菌需采用以尿素为唯一氮源的选择培养基
B. 实验室通常使用平板划线法对分解尿素的细菌进行计数
C. 纤维素酶不只包括C 酶、Cx酶和葡萄糖苷酶这三种组分
1
D. 刚果红染色法可以在制备培养基的时候加入刚果红
6.关于微生物的培养，下列说法正确的是（ ）
A. 培养基、手、接种环、工作台等都需要用适宜的方法灭菌处理
B. 制备固体培养基的操作程序为计算、称量、溶化、灭菌、调pH、倒平板
C. 平板划线法和稀释涂布平板法都可用于大肠杆菌的纯化培养
D. 稀释涂布平板法统计的菌落数往往比实际活菌数多
7.如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是（）
A. 步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B. ①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
C. 操作③到④的过程中，每次接种前后都需要对接种环进行灼烧处理
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂D. 用接种环在平板上划线时注意不能将培养基划破
8.下列关于微生物鉴定方法的叙述，错误的是（）
A. 利用酚红指示剂鉴定尿素分解菌，指示剂将变红
B. 利用刚果红试剂鉴定纤维素分解菌，纤维素分解菌的菌落周围会出现透明圈
C. 利用青霉素鉴定酵母菌，酵母菌的菌落会呈现青色
D. 利用伊红美蓝试剂鉴定大肠杆菌，大肠杆菌的菌落会呈现黑色
9. 下图甲为纤维单胞菌（能产生纤维素酶）的获取过程。下列有关叙述错误的是（）
A. ①②③④培养基都应以纤维素为唯一碳源
B. 图中所用培养基矢菌常用的方法是高压蒸汽灭菌
C. ④所用的接种方法可对培养的微生物进行计数
D. 可用刚果红染料鉴定，看菌落周围是否出现透明圈
10.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（ ）
A. 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B. 取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上
C. 将实验组和对照组平板倒置，37°C恒温培养24~48小时
D. 确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
11. 幽门螺旋杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液
后 ， 进 行 分 离 培 养 。 实 验 基 本 步 骤 如 下 ， 请 选 择 下 列 叙 述 错 误 的 一 项 （ ）
A. 在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为 Hp 含有脲酶，它能以尿素作为氮源；若
有 Hp，则菌落变黑，周围会出现黑色环带。
B. 步骤 X 表示接种。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上，菌液
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C. 在培养时，需将培养皿倒置。若不倒置培养，将可能导致培养基被污染。
D. 临床上用14C 呼气试验检测人体是否感染 Hp，其基本原理是 Hp 能将14C 标记的尿素分解为NH
3
和 CO。
2
12.下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述中，错误的是（）
A. 常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌
B. 平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
C. 稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D. 用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏大
13. 土壤微生物的数量与土壤肥力有极为密切的关系。如图1、2是测定某土壤微生物数量的相关过程，下
列说法错误的是（）
A. 按微生物需求配制好的培养基用高压蒸汽灭菌后，应冷却至50℃左右再倒平板
B. 在选择培养基上加入青霉素可以淘汰细菌，筛选得到酵母菌和霉菌等真菌
C. 用稀释涂布平板法进行微生物的数量测定时，统计的结果往往比实际数目高
D. 若取0.1 mL稀释液涂布平板后平均长出40个菌落，则1 g土壤中的活菌数约为4×107个
二、填空题
14. 孔雀石绿（简称MG）是广泛使用的有机染料，在自然环境中极难降解，容易引起土壤污染，进而危
害人体健康。因此从土壤中分离和筛选出高效的MG降解菌有非常重要的意义。已知MG在水中溶解度低，
含过量MG的固体培养基不透明。
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂（1）培养基的配制：MG降解菌富集培养基需含有NaH PO 、KH PO 、NaCl、NH Cl、CaCl 、MgSO 、
2 4 2 4 4 2 4
水等，再加__________________作为唯一碳源。培养基配制好后，需进行灭菌处理。灭菌是指
____________________________________________________________。
（2）MG高效降解菌株的富集：如图所示，将1.0g土样接入含上述配制好的培养液的三角瓶中，将三角
瓶置于30℃、180r/min摇床中振荡培养1-2天，此操作的目的是__________________________，直至培养
液变浑浊后，换瓶重复操作2-3次，以达到富集的目的。
（3）MG高效降解菌株的分离和纯化：图中所示的分离纯化细菌的方法是________________。实验中初步
估测A中细菌细胞数为1.5×109个/mL，若要在图中每个平板上涂布0.1mL稀释后的菌液，且每个平板上长
出的菌落数约为150个，则应将A中的菌液稀释__________倍。
（4）MG高效降解菌株的鉴定：将纯化获得的菌种接种于含过量 MG的固体培养基（其他营养成分等适
宜 ） 上 ， 根 据 培 养 基 是 否 出 现 __________________ ， 就 可 以 鉴 别 出 目 的 菌 株 ， 原 因 是
_______________________________。
（5）MG高效降解菌株的保存：获得纯净的菌种后，需要进行菌种的保藏。若需长期保存，可以采用
______________的方法。
15.尿素是一种重要的农业肥料，需经细菌的分解才能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数
量繁多，下列是从土壤中分离分解尿素细菌的有关问题，请分析回答：
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂(1)如图是利用_______________法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步稀释分离到培养基的表面。除此方
法外，常用的微生物接种方法还有____________________。
(2)如果要对培养的菌落进行纯化，在培养基上划线操作时，操作的第一步及每次划线之前都要灼烧接种环，
目 的 是 ________________ ， 灼 烧 过 的 接 种 环 必 须 冷 却 后 才 能 接 种 的 原 因 是
_______________________________________________________。
(3)下面是两种培养基配方：
表1：A培养基配方
KH PO NaHPO MgSO ·7H O 葡萄糖 尿素 琼脂 HO
2 4 2 4 4 2 2
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 1000 mL
表2：B培养基配方
纤维素粉 NaNO NaHPO ·7H O KH PO MgSO ·7H O KCl 酵母浸膏 HO
3 2 4 2 2 4 4 2 2
5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 1000 mL
①配制培养基的操作步骤 _____________(用字母顺序回答)。
a．倒平板 b．计算 c．溶化 d．称量 e．灭菌
②通常培养基采用 _______________法灭菌。
③如果要分离土壤中能分解尿素的细菌，应选择上述 ________(A/B)配方的培养基，在该培养基中加入
________指示剂，可初步鉴定出该种细菌能否分解尿素。
④为了分析该选择培养基是否筛选出一些菌落，可以配制牛肉膏蛋白胨完全培养基。溶化过程中，将称好
的 ________连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热。待其溶化至与称量纸分离后，用玻棒取出
称量纸，往烧杯中加入称量好的_______、_______，搅拌使其溶解。加入琼脂时，要不断用玻棒搅拌，目
的是__________________________。
培优第二阶——拓展培优练
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1.双酚A（BPA）是一种含碳有机物，是重要的工业原料，在环境中不易降解，科研人员对土壤中细菌等
微生物进行筛选，得到了具有降解 BPA 能力的菌株，下列有关叙述正确的是（ ）
A. 为了有效防止杂菌的污染，可将土壤稀释液彻底灭菌后再接种到培养基上
B. 分离 BPA 降解菌的培养基需要以BPA 为唯一碳源
C. 可用平板划线法和稀释涂布平板法对该菌进行计数
D. 培养基要维持正常的pH 和渗透压，调pH 一般应在灭菌后
2. 有些细菌可以分解原油，从而消除由于原油泄漏造成的土壤污染。某同学从受原油污染的土壤中，筛选
出能高效降解原油的菌株。下列相关操作不正确的是（ ）
A. 将灭菌后的土壤样品稀释液接种于以原油为唯一碳源的固体培养基初筛菌种
B. 纯化菌种时，可用平板划线法或稀释涂布平板法分离得到单菌落
C. 通过比较纯化得到的菌种的降解效率以获得降解能力强的菌株
D. 可通过基因组测序方法对筛选得到的菌株进行分子鉴定
3.下列是一些关于微生物的培养和应用的基本理论和基础知识，其中都正确的一组是（ ）
①接种环、玻璃器皿（如培养皿等）可以通过灼烧灭菌和干热灭菌
②人工配制的培养基常需要调pH，其应在分装灭菌前进行
③超净工作台、接种室、空气可以通过紫外线消毒
④菌种的长期保存通常接种在试管的固体斜面培养基上，-4℃下进行
⑤用涂布稀释平板法统计菌落数的缺点是不能观察到微生物的的形态、大小、结构
⑥实验室测定土壤中细菌的数量时，选取的稀释度的要求通常分别是：103、104、105，
A. ①②③ B. ①②④ C. ②③⑤ D. ②③⑥
4.某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种培养、菌落观
察与计数。下列与此实验相关问题的叙述中正确的是（）
A. 实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉
B. 利用平板划线法对细菌进行分离纯化并计数
C. 观察细菌培养的实验时，最好是在另一块平板上接种清水作为对照实验
D. 培养基中含有的淀粉、蛋白胨可以分别为细菌培养提供碳源和氮源
5.下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列与该实验相关内容的
叙述中不正确的是（ ）
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂A. 实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基
B. 通过图中I、Ⅱ过程目的是增加目标微生物的数量
C. 统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数
D. 在⑤处培养基上能生长的一定是能降解对羟基苯甲酸的微生物
6.下列有关微生物实验室培养的说法正确有（）项。
①接种环、玻璃器皿（如培养皿等）可以通过灼烧灭菌和干热灭菌
②根据对生存环境的要求，在对应环境中寻找，就一定能寻找到目的菌株
③稀释涂布平板法是需将不同稀释浓度的菌液分别涂布到固体培养基表面
④灭菌是指杀灭物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子
⑤平板划线操作第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物感染操作者
⑥稀释涂布平板法进行梯度稀释时，要用移液管吹吸试管中溶液几次，目的是达到足够稀释倍数
⑦平板划线在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来自第一次划线末端
⑧实验室测定土壤中细菌的数量时，选取的稀释度的要求通常分别是：103、104、105
A. 1项 B. 2项 C. 3项 D. 4项
7.如图是两种不同接种方法所得的结果，下列说法正确的是（）
A. A 、B两种接种方法使用的接种工具在接种前都要在酒精灯火焰上灼烧，且处理方法完全相同
B. 进行接种之前都要对操作者双手和培养基进行灭菌处理
C. A方法划线时，是沿方①②③向进行，且在③区域看到有单个菌落，可直接计数
D. A、B所使用的培养基可以相同，且制作时要先调pH再灭菌最后倒平板
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂8. 下列根据相应实验现象分析得出的结论，错误的是（）
A. 牛肉膏蛋白胨空白对照培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染
B. 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数大于选择培养基，说明选择培养基有选择作用
C. 稀释涂布平板法获得的培养基上菌落数小于 ，说明可能是稀释的倍数太大
D. 在接种大肠杆菌的培养基上观察到菌落有大有小，说明培养基已被杂菌污染
9. 苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有
苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤
如图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是( )
A. 图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
B. 如果要测定②中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法
C. 若图中④为对照实验判断培养基的筛选功能，则其中应以苯酚作为唯一碳源
D. 使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落
10.某学者利用“影印培养法”研究大肠杆菌抗链霉素性状产生的原因，先将原始菌种接种在1号培养基上，
培养出菌落后，将灭菌绒布在1号上印模，绒布沾上菌落并进行转印，使绒布上的菌落按照原位接种到 2
号和3号培养基上。待3号上长出菌落后，在2号上找到对应的菌落，然后接种到不含链霉素的 4号培养
液中，培养后再接种到5号培养基上，并重复以上步骤。实验过程如图所示。下列相关叙述正确的是（）
A. 大肠杆菌抗链霉素的性状是由链霉素的选择作用引起的
B. 1号和5号采用平板划线法将菌种接种在相应选择培养基上
C. 4号与8号培养液中，大肠杆菌抗链霉素菌株的比例逐渐增大
D. 该实验缺乏对照实验，无法确定抗链霉素性状属于可遗传的变异
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂11. 酵母菌的品质影响葡萄酒的产量和质量，研究人员为分离出产酒精能力强的酵母菌菌株，进行了如图Ⅰ
所示实验，甲、乙、丙、丁锥形瓶内分别加入 100mL 完全培养基，下列说法错误的是（）
A. 葡萄酒发酵过程中，缺氧酸性环境、酵母菌产生的次生代谢产物酒精等可抑制杂菌的繁殖
B. 用稀释涂布平板法计算出葡萄酒过滤液的活菌数为6.8×109个/L，此数值可能低于实际的活菌数
C. 对培养基进行灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法，菌种接种过程中的试管口、瓶口等需灼烧灭菌
D. 由图Ⅱ可知，丙瓶培养基浑浊的原因是培养基灭菌不彻底，丁组酵母菌产酒精能力比乙强
12. 下列与土壤中尿素分解菌的分离与计数相关的叙述，正确的是（）
A. 统计尿素分解菌的数目时应该选择菌落数多的培养基进行计数
B. 对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用平板划线法进行接种
C. 可以通过设置空白对照组来检验培养基是否受到了杂菌的污染
D. 尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨后会使培养基pH下降
13. 在分离土壤中分解纤维素的细菌过程中，需要进行的是（ ）
A. 用紫外线对样品进行消毒 B. 用显微镜对菌落进行计数
C. 用选择性培养基进行筛选 D. 用刚果红对菌体进行染色
二、填空题
14. 金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，在患者体内采集样本并制成菌液后进行分离培养，具体如图所示，
已知金黄色葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，在含即黄的同体培养幕上形成的菌落周围会出现特有的乳白
色的乳浊环。请回答：
（1）在配制培养基时，通常利用_________法进行灭菌，然后待温度降到_________℃左右时，在无菌条
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂件下，加入无菌的_________，摇匀后立即倒平板。
（2）若之后需要进行计数，则步骤X可以表示用_________法进行接种。
（3）在培养时，需要将培养皿倒置，原因是__________________。若对培养、鉴定完毕的该菌进行计数，
将1mL样本稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别
为43、44、45，据此可得1L样本中活菌数为_________个。
（4）菌种保存：如果要临时保藏，需要将菌种接种到试管的_________上，在合适的温度下培养，待菌落
长成后，将试管放人4℃冰箱中保藏。如果需要长期保存，可以采用_________法。
15.下表中甲、乙分别是分离两种土壤中微生物的培养基的配方，图丙所示为相关分离过程。请回答下列问
题（注：水解酪素，即水解酪蛋白，由酪蛋白水解得到）：
KH PO 1.4g 纤维素粉 5.0g
2 4
NaHPO 2.1g NaNO 1.0g
2 4 3
MgSO ·7H O 0.2g Na2HPO 1.2g
4 2 4
葡萄糖 10.0g KH2PO 0.9g
4
尿素 1.0g MgSO4·7HO 0.5g
2
琼脂 15.0g KCl 0.5g
酵母膏 0.5g
水解酪素 0.5g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
甲 乙
（1）从功能上看，甲培养基属于________，其中提供氮源的物质是________。
（2）如果将乙培养基配制成固体培养基，则在该培养基上长出的菌落是否都能分解纤维素？________
（填“是”或“否”）。如果培养基中加入________可以筛选出具有分解纤维素
能力的菌株，同时透明圈越________（填“大”或“小”），表示该菌分解纤维素的能力越强。
（3）为了计数微生物的数量，图丙采用________法进行接种培养计数，除此之外，还可以采用________
法进行计数。其中前一种计数方法所得结果要比后一种计数方法所得结果________（填“大”或“小”）。
（4）一位同学利用图丙的方法步骤在4个平板培养基上分别接种0.1mL土壤稀释液④，培养后菌落数分别
为180、155、176、129个，则1mL原土壤样液①中微生物数量约为________________。
16.近日市卫计委发布的卫生监测信息显示多家美容美发场所的毛巾、理发用具等大肠杆菌含量严重超标，
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂回答下列相关问题：
（1）在检查某美发店的卫生状况时对该美发店毛巾浸泡液中的大肠杆菌进行计数可采用稀释涂布平板法，
也可采用如图甲所示的______________法，图甲中a的孔径应__________（填“大于”或“小于”）大肠
杆菌的大小，培养大肠杆菌时，需将pH调至__________。在伊红和美蓝培养基上可观察到大肠杆菌菌落
呈__________色。
（2）如图乙是大肠杆菌鉴别培养基的配方，在该配方中缺少的营养成分是__________；若要进行选择培
养，则培养基配制时应满足_______________________________________。在用稀释涂布平板法对大肠杆
菌 进 行 计 数 时 ， 计 数 结 果 往 往 比 实 际 偏 小 ， 原 因 是
_________________________________________________。
（3）若该美发店需要对毛巾进行定期消毒，最简单有效的消毒方法是__________。
培优第三阶——高考沙场点兵
一、单选题
1.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，有关叙述错误的是（ ）
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂A. 在配制步骤②、③的培养基时，应先调pH值后高压蒸汽灭菌
B. 步骤③纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
C. 步骤③采用涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D. 步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
2.下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述中，错误的是（ ）
A. 常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌
B. 平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
C. 稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D. 用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏大
3. 如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是（ ）
A. ①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B. 步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C. 步骤③中，每次划线前后都需对接种环进行灼烧处理
D. 划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养
4.咔唑是一种含N有机物，有潜在致癌性，其结构稳定难以清除。为了获得高效降解咔唑的微生物，研究
人 员 设 计 了 下 图 所 示 的 实 验 方 案 。 下 列 针 对 该 方 案 的 表 述 错 误 的 是 （ ）
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂A. 加入无菌水稀释前的油田淤泥样品无需灭菌
B. 在CNFM中加入咔唑的培养基属于选择培养基
C. 固体平板培养基培养的目的是分离得到降解咔唑的微生物
D. 利用显微镜直接计数测量经多瓶培养后培养瓶中目标微生物的数量小于实际值
5.在分离土壤中分解纤维素的细菌过程中，需要进行的是（ ）
A. 用紫外线对样品进行消毒 B. 用显微镜对菌落进行计数
C. 用选择性培养基进行筛选 D. 用刚果红对菌体进行染色
6.下列有关微生物培养的叙述，正确的是（ ）
A. 溶化牛肉膏时，称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
B. 涂布接种时，涂布器应在干热灭菌箱中灭菌冷却后再使用
C. 纯化培养时，培养皿应倒置放在恒温培养箱内的摇床上培养
D. 观察菌落时，应将培养皿盖拿掉后在显微镜下进行观察计数
7. 将从种植烟草的土壤里分离得到的尼古丁（C H N ）降解菌株SC接种到尼古丁培养基中，30℃摇床
10 14 2
培养并定时取样，测定并计算发酵液中的尼古丁浓度和菌体浓度，得到的结果如图所示。下列分析不正确
的是（ ）
A. 分离SC时可用稀释涂布平板法或划线法
B. 培养36h时SC的数量为该种群的环境容纳量
C. 影响SC种群密度变化的主要因素是O 浓度和pH
2
D. 发酵液中的尼古丁为SC提供碳源和氮源
8.下列有关用平板划线法和稀释涂布平板法纯化培养大肠杆菌的叙述，正确的是（ ）
①都需要用固体培养基
②都需要使用接种针进行接种
③都需要在火焰旁进行接种
④都可以用菌落数来计数活菌．
A. ①②
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂B. ①③
C. ②④
D. ③④
9. 某研究小组探究A、B、C、D四种抗生素对某种罕见细菌生长和繁殖的抑制能力，设计
完成了抑菌实验，得到了如图所示的实验结果，以下说法正确的是（ ）
A. 抗生素A对这种细菌的抑制能力最强B. 抗生素B对这种细菌的抑制能力最强
C. 实验所用四种抗生素的浓度各不相同 D. 滤纸片E应该蘸取自来水作为对照
10.野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上
补充相应氨基酸才能生长。将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，
均不会产生菌落。某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培
养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落
出现。该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是（ ）
A. 操作过程中出现杂菌污染
B. M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸
C. 混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质
D. 混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变
11.下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是（ ）
A. 培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B. 接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C. 接种后的培养皿要倒置，以防培养基污染
D. 菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
12.科学家通过实验发现了细菌的快速进化过程。人们发现用肉汤培养假单胞杆菌时，如果肉汤保持不动，
不久后在肉汤的不同部位如表面、底部或其他部位，细菌的形态发生了如下图所示的变化，出现一定数量
的变异株。下列有关说法正确的是( )
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂A. 这个实验说明了细菌在不同的小环境中没有发生进化
B. 细菌的生命周期短，繁殖速度快，不容易受到外界环境影响
C. 用高压蒸汽灭菌对肉汤作无菌处理后加入一定量的抗生素以防止培养过程中的污染
D. 用不断摇动的肉汤培养SM细菌，难以出现FS细菌和WS细菌
13.某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物 A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以
及微量元素等配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）．实验的主要步骤如图所
示。下列有关叙述错误的是（ ）
A. 培养基中加入化合物A作为唯一碳源，目的是为了筛选目的菌
B. 实验培养过程中进行振荡培养，可使目的菌和培养液充分接触
C. 实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是防止外来杂菌污染
D. 将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是获得大量菌种
14.下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法中，错误的是（ ）
A. 因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分
离
B. 测定土壤中细菌总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
C. 采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
D. 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌
菌落
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂15.研究小组利用微生物实验操作技术来探究某池塘中大肠杆菌数量，下列叙述正确的是（ ）
组别 部分操作过程、结论
Ⅰ 进行涂布平板操作时，将10mL菌液滴加到培养基的表面后，再用灭菌后的涂布器推匀
Ⅱ 涂布完成后，在培养皿盖上做标记，并将培养皿倒置
Ⅲ 重复实验获得了四个平板，其中的菌落数分别为212、381、157、183，则平均值应为184
实验组平板上有38个菌落，空白对照组有5个，则“38-5”作为池塘中大肠杆菌数量计算
Ⅳ
的依据
A. Ⅰ B. Ⅱ C. Ⅲ D. Ⅳ
二、填空题
16.苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据图1操作步骤，从处理
废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、KHPO 、MgSO 、苯酚和水，其中可作为碳源的有 ______ ．
2 4 4
（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐 ______ ．以达到富集酚降解菌的目
的。若图1平板中菌落过于密集，应进一步 ______ ，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需
要水、营养物质外，还必须添加 ______ ．
（3）图2为连续划线法示意图，在图中 ______ （填图中序号）区域更易获得单菌落。
（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行
显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为 ______ ．
更多资料添加微信号：hiknow_007 淘宝搜索店铺：乐知课堂管号 1 2 3 4 5 6
苯 酚 浓 度
1
（mg/L）
如果废水为 50mg/L 苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释 ______ （填序号：
①5 ②10 ③20）倍后，再进行比色．
17. 回答下列有关微生物的培养与应用的问题：
(1)微生物的培养需要使用培养基，不同培养基的配方不同，但一般都具有 _________等；在配制从土壤中
筛选纤维素分解菌的培养基时，需加入 ____ 作为唯一的碳源。
(2)下图中产生每个菌落的最初细菌数为____个才是最理想的。据图分析，在培养基上划线接种时，划线的
顺序依次是 __（用编号和箭头表示）。
(3)根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大概推测出样品中的活菌数。
某同学在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为25.6，则每毫升样品中的活菌数是___(所
用稀释液的体积为0.2 mL)____。
(4)若要鉴别纤维素分解菌，可用 法；若要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入_________。
18.乳糖酶能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖在工业生产中具有重要价值。乳糖酶的制备及固定化步骤如
图。回答下列问题：
（1）筛选产乳糖酶的微生物L时，培养基中的唯一碳源应该是______，在实验室培养微生物L时，一方
面需要为L提供合适的营养和环境条件，另一方面需要______，以获得纯净的培养物。
（2）将微生物L研磨破碎得到提取液后，可采用凝胶色谱法分离纯化其中的乳糖酶分离过程中，比乳糖
酶相对分子质量小的蛋白质，在凝胶中的移动速度比乳糖酶______（填“快”或“慢”），原因是______。
（3）工业生产中，若要将乳糖酶固定化，一般______（填“适宜”或“不适宜”）采用包埋法原因是
______，与使用游离酶相比，工业生产中使用固定化酶的优点是______。
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