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专题32 基因工程
考点分布 重点难点 备考指南
理解掌握质粒的类型和特点。
1.基因工程的诞生
1.基因工程的基本工具 理解并掌握基因工程用的两种酶的作
2.基因工程的原理及技术（含
2.基因工程的基本操作及 用。
PCR技术）
其应用 理解掌握基因工程的操作步骤和注意事
3.基因工程的应用
3.蛋白质工程及应用 项。
4.蛋白质工程
掌握蛋白质工程的流程
考点一 基因工程的操作工具
1．基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 和转基因等
技术，赋予生物以新的 特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型
和生物产品。由于基因工程是在 水平上进行设计和施工的，因此又叫做
DNA重组技术。基因工程的变异原理是 。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶（简称 ）。主要来自 生物。具有
性，断裂特定的两个核苷酸之间的 。产生 末端或 末端
①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱
氧核苷酸之间的 。
②类型
常用类型 E·coli DNA连接酶 T DNA连接酶
4
来源 T 噬菌体
4
特点 只缝合 末端 缝合
DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是 ，
而DNA聚合酶是把单个的 连接到已有的DNA片段上。② 起
作用时需要以一条DNA链为模板，而 不需要模板。(3)载体
①种类： 、 、 等。
②质粒的特点：有 、能 、有特殊的 。
③运载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
1．与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA（水解）酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链
2.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破
坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中 PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒
如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
载体上标记基因的作用
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相
关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内
表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就
可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：典例1.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
典例2.如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过
程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体
内无天然质粒，科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重
组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表
达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中 AOX1 基因受到诱导而表达[5′AOX1 和
3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。请分析回答下列问题：
(1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择 切割质粒，
并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上 ，这样设计的优点是
。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用 将其连接到pPIC9K质粒上，形成重
组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取 。
(3)步骤3中应选用限制酶 来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯
德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入 以便筛选；
若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用 方法进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入 以维持其生活，
同时诱导HBsAg基因表达。考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
(1)目的基因：主要指 的基因，也可以是一些具有 作用的因子。
(2)获取目的基因的方法
利用PCR技术获取和扩增目的基因。
原理： 。
过程
第一步：变性 加热至90 ℃以上，DNA解链为单链；
第二步： 冷却至50 ℃左右，引物结合到互补DNA链；
第三步： 加热至72 ℃左右，Taq酶从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
2. ——基因工程的核心
①目的：使目的基因 ，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因
能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成：目的基因、复制原点、启动子、终止子、标记基因。
启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
（1）启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是 的部位，
驱动基因转录。
（2）终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端。作用是 。
（3）起始密码子和终止密码子位于 上，分别控制翻译过程的 。
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 转化法 技术 感受态细胞法
受体细胞 原核细胞
将目的基因插入到Ti
将含有目的基因的表 处理细胞→
质粒的 上
达载体提纯→取卵 感受态细胞→重组表
→农杆菌→导入植物
转化过程 （受精卵）→显微注 达载体DNA分子与感
细胞→整合到受体细
射→受精卵发育→获 受态细胞混合→感受
胞染色体的DNA上→
得具有新性状的动物 态细胞吸收DNA分子
表达
（4）目的基因的检测与鉴定
利用 技术检测染色体 DNA 上是否插入了目的基因和是否转录出了 mRNA，用
，检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质。1.构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
同时，使目的基因能够表达和发挥作用。一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子
终止子及标记基因等。图中抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，鉴别受体细胞中是否
含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2.PCR技术相关分析
(1)关于引物的2点提醒：①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只
能结合在母链的3′端；②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
(2)PCR技术和DNA复制的比较
3．基因表达载体构建过程
若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连
接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。1.目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因
的插入位点应在启动子与终止子之间。
2．受体细胞选择时需注意：要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素必须用真核生物酵母菌
（需内质网、高尔基体的加工、分泌）；一般不用支原体，因为它营寄生生活；一定不能
用哺乳动物成熟的红细胞，因为它无细胞核，不能合成蛋白质。
典例1.土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物细胞的基因组中。
利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是( )
A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D．T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物细胞的染色体上
典例2.乙肝病毒是一种DNA病毒。中国的乙肝病毒携带者约占总人口的10%。我国科学家
通过基因工程生产出乙型肝炎病毒疫苗，为预防乙肝提供了有力的保障。回答下列问题：
（1）乙肝病毒专一侵染肝细胞的原因是________________________________________。
（2）乙肝病毒的基因组可编码的蛋白质及功能如下：Core蛋白是外壳蛋白；Pre－core与
抑制宿主的免疫反应有关；X蛋白与病毒复制有关；S蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入
细胞有关。通过基因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的
____________________。
（3）通过基因工程生产乙肝疫苗的过程如图所示：
乙肝病毒――→有关基因――→细菌大量生产疫苗
a．若要获得大量的目的基因，可采用 PCR技术进行体外扩增，该技术中使用的引物有
________种，其作用是________________________。
b．在①②过程中需使用的工具酶是________________。②过程中常用的载体是________。
c．为提高②过程的转化效率，常采用的方法是______________________________。
（4）使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好，从细胞结构的角度分析，原因是
________________________________________________________________________。
考点三 基因工程的应用和蛋白质工程
1.基因工程的应用
表现方面 具体内容
①转基因抗虫植物；
农牧业方面
②转基因抗病植物；③转基因抗除草剂植物；
④利用转基因改良植物品质
⑤提高动物的生长速率
⑥改善畜产品的品质
①生产药物
医药卫生领域
②建立器官移植的工厂
利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸、维生素等；
食品工业方面
将牛凝乳酶的基因导入微生物，生产凝乳酶；
2．蛋白质工程
(1)概念
①基础：蛋白质分子的 及其与 的关系。
②手段：改造基因或基因合成。
③结果：对现有蛋白质进行 或制造出 。
1.对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操
作来实现？原因是什么？
应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因有：①蛋白质具有十分复杂
的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改
造的蛋白质无法遗传。
2.蛋白质工程与基因工程的比较
（1）区别
项目 蛋白质工程 基因工程
预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白 获取目的基因→基因表达载体的
过程 质结构→推测应有的氨基酸序列→找 构建→将目的基因导入受体细胞
到相对应的脱氧核苷酸序列 →目的基因的检测与鉴定
定向改造生物的遗传特性，以获
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 得人类所需的生物类型和生物产
品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
（2）联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
(1)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。
(2)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。(3)原核生物的基因(如抗虫基因)可以作为真核生物(棉花)的目的基因。
(4)Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白只在某些昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人
和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt毒蛋白不会对人畜产生危害。
典例1.红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因
工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然 EPO来源极为有限，目前临床使用的
红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)。其简要生产流程
如图，下列相关叙述正确的是( )
A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶
B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程
C．检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术
D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得
典例2.甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化
法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜 (填“受伤的”或“完好的”)叶片与
含重组质粒的农杆菌共同培养，选用这种叶片的理由是
。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中的 已转移到植
物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中
含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为 1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到
(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，
应选用
作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目
的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为
。
1．限制酶是一类酶，而不是一种酶。
2．将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
3．不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制
酶切割，产生的末端一般不相同。
4．限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。1.（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复
（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受
阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述
错误的是（ ）
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行
C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
2.（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的HO 对细胞有毒害作用。
2 2
禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响HO 的跨膜转运，
2 2
如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高HO 外排能力所必需的
2 2
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进HO 外排，从而减轻其对细胞的毒害
2 2
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
3.（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因
（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是
（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能
形成菌落
4.（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因
（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质
的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得
的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙
所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
5.（2023·湖南·统考高考真题）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采
集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性
耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿
神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如
图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1和1-2生育育一个甲和乙突变基因双
纯合体女儿的概率是 。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为
）酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为
（写出6个碱基即可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切产物
长度应为 bp（注：该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸
补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人
群补充有效且安全剂量为0.4~1.0mg.d-1，NTDs生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿
（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
6.（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检
测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还
需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若
仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列
相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是
否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，
条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达
的。
7.（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶
识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的
机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的
P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结
合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物
需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识
别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，
如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合
基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对
应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时
使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成
5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗
体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的
差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列
的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
