文档内容
押非选择题
生物技术与工程
考向预测 考情统计（2023年） 核心考点
近几年高考题通常以具体
情境，考查基因工程的原理、
工具和基本操作程序，启动子
2024·浙江
的含义和功能，PCR技术的原
2023·河北
理，限制酶的作用、基因表达
2023·重庆
载体的组成、启动子的作用
2023·辽宁
等，题目难度系数大：其中启
2023·江苏
动子的插入位点和插入方向等
2023·海南 生物技术与工程
都需要学生有很强的理解信
2023·天津
息、获取信息的能力、以及综
2023·北京
合运用知识解决问题的科学思
2023·山东
维和科学探究能力，通过基因
2023·湖北
工程考查学生的结构与功能
2022·福建
观。预测2024年难度系数也
会非常大，不排除出现细胞工
程的可能。
一、重组DNA技术的基本工具
考向01 生物技术与工程
1.基因工程概述
1.（2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研
究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了
F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因
用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒
绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表
示；f杂合子基因型用+f表示）
回答下列问题：
(1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个
DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前
出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而 提醒
丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进
行 和 。 基因工程的理论基础(2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用
限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检
测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠
和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第
泳道。
2.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f
基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g
小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基
提醒
因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：
不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型
①将一个基因从DNA分子上切割下来需
用+g表示）
要切两处，同时产生四个黏性末端或平
(4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别
末端。
提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的
mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针 ②限制酶不切割自身DNA的原因是原核
和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是
生物DNA分子中不存在该酶的识别序列
。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠
或识别序列已经被修饰。
不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。
(2)DNA连接酶
2．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴
油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶
（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获
得高产生物柴油的硅藻品系。
提醒
回答下列问题：
①DNA 连接酶连接的是两个 DNA 片
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异
段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷
获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标 酸连接到已有的DNA片段上。
记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA
(3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据
表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅
链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，
(3)载体
扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的
组，样品2有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂
质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结
果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平
均水平明显 。同时，还需测定 以比较在相同发酵条
件下品系A与B的繁殖速率。
3.限制酶的选择原则
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选
反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显
择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。
著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中
NADH水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复
制原点原则：所选择的限制酶尽量不要
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生
物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即 破坏这些结构，如图乙中不选择 Sma
可） Ⅰ。
3．（2023·重庆·高考真题）妊娠与子宫内膜基质细胞的 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选
功能密切相关。某研究小组通过如图所示的实验流程获得
择与切割目的基因相同的限制酶切割质
了子宫内膜基质细胞，以期用于妊娠相关疾病的研究。
粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质
粒自身环化和随意连接，也可使用不同
的限制酶切割目的基因和质粒，如图也
可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
(1)手术获得的皮肤组织需在低温下运至实验室，低温对 4.标记基因的作用
细胞中各种蛋白质的作用为 。
标记基因可用于检测目的基因是否导入
(2)过程①中，诱导形成PS细胞时，需提高成纤维细胞中
受体细胞：
4个基因的表达量，可采用 技术将这些基因导入该
细胞。这4个基因的主要作用为：M基因促进增殖，S基
因和C基因控制干细胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。若
成纤维细胞形成肿瘤细胞，最有可能的原因是 基因
过量表达。
(3)培养iPS细胞时，应对所处环境定期消毒以降低细胞被
污染风险。可用紫外线进行消毒的是_____（多选）。
A．培养基 B．培养瓶C．细胞培养室 D．CO 培养箱
2
(4)过程②中，iPS细胞经历的生命历程为 。PCR技
术可用于检测子宫内膜基质细胞关键基因的mRNA水
平，mRNA需经过 才能作为PCR扩增的模板。
4．（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，
不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基
因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆
菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
二、基因工程的基本操作程序
(2)PCR中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
1.目的基因的筛选与获取
①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的
RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的
DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将 (2)利用PCR获取和扩增目的基因
该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提
升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱
基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，
由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图
示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后
的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将
其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌
菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长
度，这一操作的目的是 。正确连接的基因表达载体
被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
提醒
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，
根据中心法则，可通过 反应获得PCR的模板。 ①在 PCR 过程中实际加入的原料为
5．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧 dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，
光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1 既可作为合成DNA子链的原料，又可为所示。请回答下列问题： DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱
基序列互补配对的短单链核酸，作为新
子链的合成起点，只能结合在母链的 3′
端，使DNA聚合酶能够从引物的 3′端开
始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链
结合，温度过低则易使两条母链配对结
合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要
Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个 般要添加Mg2＋。
反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是
。 2.基因表达载体的构建——核心
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项
中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作
用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传
统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有
。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，
下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同
菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩
增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结
果判断，可以舍弃的质粒有 。
提醒 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一
步通过基因测序确认，原因是
。
6．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的
重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因
递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB
法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某
3.将目的基因导入受体细胞
植物中递送基因的示意图。
只有该步骤没涉及碱基互补配对原则
回答下列问题。
提醒
(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；
(1)农杆菌特点
从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和
，该过程还需要光照，其作用是 。
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸
(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培
子植物，而对大多数单子叶植物没有侵
养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含
染能力。
有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标
注 。
②农杆菌细胞内含有 Ti质粒，当它侵染
(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因
植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA转
递送到植物细胞中的原因是 。
移到被侵染的细胞中，并且将其整合到
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了
该细胞的染色体DNA上。
用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有
绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重 (2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次
组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．
拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-
据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是
DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指
，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥
作用的方法是 ，依据是 。 插入目的基因的 TDNA拼接到受体细胞(5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点 的染色体DNA上；两次导入：第一次导
是 （答出2点即可）。
入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆
7．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的 菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的
转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设
基因的TDNA导入受体细胞。
计表达载体，思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。 (3)导入的目的基因，可能存在于细胞质
中，也可能整合到染色体DNA上。存在
于染色体DNA上的目的基因有可能通过
花粉传播进入杂草或其他作物中，造成
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿
“基因污染”。
酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞
(内/外)发挥作用。
4.目的基因的检测与鉴定
(2)外源基因的插入方法
同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链
断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外
源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌
株，如甲图所示。
三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外
及电泳鉴定
源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技
术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片 1.DNA的粗提取与鉴定
段。PCR时应选用的一对引物为 (从P1~P6中
选)。
(3)标记基因的选择 URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常
被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟
乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同
URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，
并利用 的培养基筛选存活菌株。
(2)方法步骤
②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标
记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应
向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C
和C´,并以下图方式 排列才能通过同源重组达到上
述目的。
此后，需要将菌株1在 的培养基上培养，存活
菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。
(4)表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒
酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图 的排布方式。 提醒
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要
轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致
DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞
8．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会 作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的
增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可
红细胞无细胞核和其他细胞器 (无
能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采
DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥
胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并
(1)实验基础
掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能
与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的
EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养
板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养
孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细
胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如
图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点
到 点。
(2)PCR实验操作步骤
(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变
胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲
喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科
学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染
（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其 色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被
编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA 检测出来。
片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er
①成功扩增出DNA片段的判断依据是可
蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小
分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小
以在紫外灯下直接观察到DNA条带。
鼠IK的技术路线： →连接到表
②进行电泳鉴定的结果应该是一条条
达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →
带。如图所示，该片段大小约为 750
获得小鼠IK。
bp。
(4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细
胞周期时长（t）是途径Ⅱ细胞周期时长（t）的三倍以
1 2
上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t 时间后换用
2BrdU饲喂，再过t 时间后检测B细胞被标记的情况。研
2
究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分
裂，与之相应的检测结果应是
。
提醒
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR
实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏
水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②在向微量离心管中添加反应组分时，
每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都
必须更换，避免试剂的污染。
③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁
移速率越慢；DNA的相对分子量越小，
迁移速率越快。
四、PCR技术与电泳相关问题
PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的
1 3 7 2n－1
数量
同时含两种引物的
0 2 6 2n－2
数量2n＋1－
共消耗引物的数量 2 6 14
2
PCR定点突变技术——重叠延伸PCR
1.图解
2.四种引物
引物 2 和 3 的突起处代表与模板链不能
互补的突变位点，而这两条引物有部分
碱基(包括突变位点)是可以互补的。
3.流程
(1)分别利用引物1和2，引物3和4进行
PCR后，得到的DNA片段可以通过引物
2和3互补的碱基杂交在一起。
(2)再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能
成为一条完整的DNA片段。
(3)用引物 1和4进行扩增得到含有突变
位点的DNA片段。
(4)通过测序可以检验定点突变是否成
功。
尝试解答：
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1．尖孢镰刀菌容易引起番茄枯萎症，对农业造成巨大损失。为研究F基因（目的基因）的功能，科学家
利用同源重组交换的原理对F基因敲除，分析其生物学功能及致病力。基因敲除过程是先构建基因敲除载体，将基因敲除载体导入受体细胞，经过筛选找出基因敲除成功的受体细胞。基因敲除原理如下图所示：
注：Hygr为潮霉素抗性基因；A、B为实现同源重组交换的序列，C、D、E、G为其他不同的基因片段；1
～6为引物。
(1)选取限制酶 、 分别对F基因左右两端A、B片段进行酶切，并用 酶将A、B片段与潮霉素
抗性基因连接，构建目的基因敲除载体。同时需要在潮霉素抗性基因前添加启动子，启动子的作用是 。
(2)把构建好的目的基因敲除载体导入尖孢镰刀菌细胞内，导入成功后，将菌液放在含 的固体培养基上
培养，使用的接种方法是 。在这一过程中，F基因与潮霉素抗性基因发生同源重组交换，与 （填
减数分裂时期）的某些行为类似。
(3)培养完毕，挑取单菌落提取其基因组DNA作为模板，选择引物 进行PCR扩增，其中引物会结合在
DNA片段的 （3'或5'）端，扩增30个循环进行电泳，如果没有F基因条带，则确定目的基因敲除成功。
(4)潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌中表达的原因是 。
2．紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种次生代谢物，具有高抗癌活性，现已被广泛用于乳腺癌等癌
症的治疗。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取，但野生红豆杉是濒危植物，这种方法
不利于对它们的保护。下图为科研人员制备能合成紫杉醇的紫茎泽兰愈伤组织细胞的流程，EcoRⅠ、BamHⅠ
为限制酶。回答下列问题：(1)图中过程①依据的原理是 ，复制开始时需要用到 种引物，引物的作用是 。
(2)图中过程②构建基因表达载体时，目的基因必须位于 之间，启动子的作用是 。
(3)某同学认为图中过程③中Ti质粒的T-DNA能携带目的基因整合到根瘤农杆菌的染色体DNA中，你认为
该同学的说法是否合理，理由是 。
(4)过程④需要控制培养基中 ，以防愈伤组织细胞发生分化，若要检测目的基因是否导入受体细胞
以及成功表达，则可以分别使用 和 技术进行检测。
3．筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签（能特
异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合），再利用该标签在病毒敏感细胞（如非洲绿猴肾细胞）中快
速纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，具体过程如下图。其中XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶，
PCMV、T7表示启动子，Kozak序列是翻译起始因子结合位点的编码序列，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，
ori表示复制原点。请回答问题：
(1)为成功构建重组质粒pcDNA3.1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，应在S基因的5'端引入 序列，
3'端删除 的编码序列。
(2)将S基因和TAP序列的扩增产物进行 鉴定，结果显示两个片段均得到扩增且与预期值大小相一
致。再经测序证实正确后，将这两个片段经限制酶切割并通过 酶连接定向克隆入质粒pcDNA3.1.
(3)重组质粒pcDNA3.1-S-TAP转染细胞前，需将vero细胞置于37℃、 （填气体条件）下培养18~24h进行传代。将传代的细胞与重组质粒pcDNA3.1-S-TAP以适宜比例混合，在转染试剂的作用下转染
细胞（实验组），为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做法为 。将转染24h的细胞置于
载玻片，洗涤、固定后滴加正常人血清稀释液和荧光素标记的羊抗人IgG抗体稀释液，荧光显微镜下观察，
若 ，则说明S-TAP融合蛋白在vero细胞中得以表达。
(4)通过上述检测发现，S-TAP融合蛋白表达量较低，其原因可能有 （填序号）。
①重组质粒pcDNA3.1-S-TAP在vero细胞中大量复制
②S-TAP融合基因在vero细胞中转录出的mRNA量较少
③S基因与病毒宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA的tRNA数量不足
4．鸭坦布苏病毒可感染鸭、鹅等多种禽类，给禽类养殖业带来严重危害。科研人员通过基因工程获取该
病毒的prM蛋白用于制备单克隆抗体。为了鉴定单克隆抗体识别prM蛋白的具体区域，将prM蛋白逐步截
短，分别与纯化的单克隆抗体反应，实验结果如下图（“aa”表示氨基酸，“+”表示有反应，“-”表示无反
应）。
回答下列问题。
(1)通过基因工程获取prM蛋白，需要利用 技术快速扩增目的基因，与生物体内DNA复制相比该
技术所需酶的种类 ，但需具有， 的特性，反应过程中复性的结果是 。
(2)用prM蛋白为抗原制备单克隆抗体，需用纯化的prM蛋白对小鼠进行免疫，其目的是获得 细胞，
并将该细胞与骨髓瘤细胞融合，对经 培养的杂交瘤细胞进行 培养和抗体检测，多次筛选
后可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞，再将其注射到小鼠的腹腔内增殖并产生抗体。
(3)根据图示实验结果分析，该单克隆抗体识别prM蛋白的区域大概包含 （填“10”“15”或“20”）
个氨基酸残基。
5．动物细胞生物反应器旨在复现动物体内的生理条件，以便在实验室环境中进行有效的细胞培养。该系
统特别适用于生产特定蛋白质，例如人乳铁蛋白。实验人员构建了人乳铁蛋白基因表达载体，然后将该重
组载体导入奶牛体内以生产人乳铁蛋白相关过程如图所示。回答下列问题：(1)获取人乳铁蛋白基因是实施人乳铁蛋白动物细胞生物反应器工程的第一步。实验人员利用PCK技术材
增人乳铁蛋白基因过程中，需要使用TaqDNA聚合酶，而不能使用普通的DNA聚合酶，其原因是
。
(2)图中标注了三种限制酶BamHI、HindⅢ、SmaI及其酶切位点，TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨
苄青霉素抗性基因。据图分析，构建人乳铁蛋白基因表达载体时，应选择的两种限制酶是 ，同
时，要将人乳铁蛋白基因导入启动子和 之间。
(3)将人乳铁蛋白基因表达载体导入供体牛受精卵后培养至早期胚胎，然后将早期胚胎移植到代孕牛体内。
此过程中，一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂，这是因为 。
(4)为检测人乳铁蛋白基因是否在雌性转基因牛中表达，研究人员提取了A、B、C三头转基因牛的乳汁，
从中提取了蛋白质，结果发现A、C两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B转基因牛提取
的乳汁中检测到了人乳铁蛋白。进一步提取A、C两头转基因牛的基因组DNA和mRNA进行检测，A转
基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但不能检测到相关mRNA，C转基因牛则都不能检测到。以上两次检测
结果说明了 。
6．抗菌肽是一类具有广谱抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,细菌不易对其产生耐药性且无残留等,被认为
是理想的抗生素替代品。为了突破抗菌肽在畜禽养殖业广泛应用的瓶颈，我国研究人员运用小分子泛素蛋
白（SUMO）融合技术将含有重组抗菌肽LLv基因的质粒导入大肠杆菌，表达融合蛋白SUMO-LLv,并优化
了表达条件,从而能高效获得重组抗菌肽 LLv。所用质粒含有卡那霉素抗性基因(KanR)、LacZ基因及
SacⅠ、XhoⅠ酶切位点等，其结构和构建重组质粒的过程如图1所示。据此分析回答以下问题：注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
(1)扩增LLv基因时，PCR反应体系中含有的酶有 ；已知该基因序列不含图1中限制酶的识
别序列，为了使其能与已被酶切的质粒连接，需根据 设计引物。
(2)LLv基因以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。该基因内部没有SacⅠ、XhoⅠ这
两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。
(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，需用CaCl 处理大肠杆菌，其目的是 。
2
(4)为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal等成分的培养基中进
行接种，结果如图2，该同学采用的接种方法是 。图2中出现的 菌落即成功导入重组
质粒的大肠杆菌菌落，判断的理由是 。
7．某种小麦的雄性不育由核基因M控制，其整个花药在发育早期停止发育进程，因此其雄性不育比较彻
底。研究发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且M及其等位基因的编码区相同；为研
究该序列与雄性不育之间的关系，科研人员在野生型小麦中获得了M等位基因的启动子并利用Ti质粒构
建表达载体，表达载体T-DNA部分结构如图1所示，GFP表达后会发出绿色荧光。将不同表达载体转入幼
胚获得转基因小麦，分别对核不育小麦、野生型小麦及转基因小麦的表型和M基因表达情况进行检测，部
分结果如表：
组别 实验材料 载体组成I、Ⅱ 植株表型 M基因表达情况
核不育小
第一组 无 雄性不育 eg
表
第二组 野生型小 无 可育 fg麦
野生型小
第三组 ad 死亡
麦
野生型小
第四组 ①____ ②____ eg
麦
注：a．通用的强启动子b．M等位基因启动子c．插入TRIM序列的M等位基因启动子d．M编码区e．
仅在花药发育早期表达f．在花药发育各时期均不表达g．在根、茎、叶、雌蕊中均不表达
(1)表中①处应分别选择 （填表注中字母序号），②处植株表型是 ，结果发现在存活的转基因小麦
花药中均能检测到绿色荧光。根据实验结果推测导致雄性不育的原因是 。
(2)实验过程中 （填“需要”或“不需要”）设置将bd导入野生型小麦的实验组，理由是 。
(3)科研人员为检测（1）中T-DNA插入受体细胞染色体中的位置，利用反向PCR技术对插入位点两侧序列
进行了分析，过程如图2。已知T-DNA的一条单链序列为：5-GCAATGCGTAGCCTCT……
AACTATGCGCTCATGA-3（虚线处省略了部分核苷酸序列）。应选下列引物中的 （填序号）用于步骤
Ⅲ，引物的作用是 。
A．5'-CGCGAGTACT-3' B．5'-GCGCTCATGA-3' C．5'-CGTAGCCTCT-3' D．5'-TACGCATTGC-3'
8．谷氨酸脱羧酶能以谷氨酸钠为前体产生γ-氨基丁酸，蛋白质复合物SNOI-SNZI能提高谷氨酸脱羧酶的
活性。将谷氨酸脱羧酶基因gadB(1401bp)和基因SNOI(675bp) 、SNZI (894bp) 导入大肠杆菌， 以探究该
复合物对其生产能力的影响。请回答下列问题：
(1)构建基因表达载体前，需先通过PCR 分别扩增目的基因片段，扩增反应体系应添加引物、模板、 、
缓冲液等，添加引物量不宜过多，原因主要是 。
(2)表1 是相关基因扩增所用引物的部分序列，表2是多种限制酶的识别序列和切割位点。构建重组质粒时，先将gadB 和 pTrc99a质粒(4176bp)分别用限制酶 进行双酶切， 并连接得到重组质粒 pTrc99a-
gadB。将基因 SNOI 和基因SNZI 分别连接到重组质粒 pTrc99a-gadB 上时， 均需用 (填限制酶)和
DNA 连接酶处理，最终得到重组质粒 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI，如图1所示。
表1
基因 引物1部分序列(5'→3') 引物2部分序列(5'→3')
gadB TCGCCCATGGCCATGATAAG CTTCGGTACCTTAGGTATGT
SNZ1 CTAAGGATCCGAAGGAGATA CCTTCTCTAGATTACCACCC
SNO1 TCGCGGTACCAAGGAGATAT CTTCGGATCCTTAATTAGAA
表2
识别序列
限制酶
和酶切位点
Xba Ⅰ T↓CTAGA
Kpn Ⅰ GGTAC↓C
Nco Ⅰ C↓CATGG
BamH Ⅰ G↓GATCC
(3)采用电泳的方法对 pTrc99a 质粒、重组质粒 pTrc99a-gadB 和重组质粒 pTrc99a-gadB-SNO1-SNZI 进行
鉴定。若构建成功， 用限制酶KpnI单酶切后电泳获得图2-A，则可推测泳道2是 的电泳结果；用限
制酶 酶切后电泳可获得图2-B泳道3 结果。(4)将质粒 pTrc99a、pTrc99a-gadB 和 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI 分别转化至处于 的大肠杆菌细胞中，
分别获得菌株R 、R 、R ，培养后分别接种于含一定量 的发酵培养基中，一段时间后测定γ-氨基丁
1 2 3
酸含量。结果如图3所示。结果表明，与导入谷氨酸脱羧酶基因的菌株比，SNOI-SNZI基因的导入
了其生产γ-氨基丁酸的能力，从能量代谢的角度分析，其原因有 。
9．细胞中NF-kB蛋白的活性水平与肿瘤的发生发展密切相关。为了高效地筛选出以NF-kB为靶点的抗肿
瘤药物，利用基因工程构建NF-kB的报告基因载体。具体原理为把已确定的NF-kB基因的调控序列（响应
元件）正确地剪切到报告基因GFP（其表达产物荧光蛋白可被实时检测）上，使报告基因能与NF-kB基因
同步表达，其工作模式见下图。构建载体过程中，报告基因GFP由pcDNA3．1-Flag-GFP质粒提供，NF-
kB基因由pGL6-NF-kB-Luc质粒提供。请回答下列问题：
(1)构建pGL6-NF-kB-CFP报告基因质粒时，首先以pcDNA3．1-Flag-GFP质粒为模板，利用PCR技术扩增
GFP基因，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、 （至少答两点）等。在PCR循环的3
个步骤中，温度设置最高的是 。
(2)用BamHI和HindⅢ限制性核酸内切酶（二者切割后的黏性末端不同）对上述PCR产物及pGL6-NF-kB-
Luc质粒进行双酶切，该方法的优点是 ，然后还需要使用 酶，才能得到
pGL6-NF-kB-GFP报告基因质粒。
(3)将pGL6-NF-kB-CFP报告基因质粒导入肿瘤细胞常用的方法是 ；体外培养肿瘤细胞除了
需要使用合成培养基外，还需要加入 等一些天然成分；再放入气体组成成分为
的培养箱中进行培养。(4)将转染成功的肿瘤细胞置于含待检测抗肿瘤药物的培养基中培养一段时间，并通过特定方法检测细胞中
GFP蛋白表达量的变化，以显示NF-kB的活性水平。若药物抗肿瘤效果显著，可观测到的现象为
。
10．遗传学技术在突变检出领域中有着重要的贡献与作用。
(1)Muller-5技术常用于果蝇X染色体上突变的检出，已知果蝇棒眼对圆眼为显性，红眼对杏色眼为显性，
且控制这两对相对性状的基因皆位于X染色体上。下图为利用Muller-5品系雌果蝇检测基因突变的过程图。
不考虑交叉互换。
为检测出果蝇X染色体上是否发生了突变，F 代需进行 （填“自由交配”“自交”或“单对交
1
配”）获得F 代。现有某纯合致死突变基因被检出，则在F 代中，最好选取性状为 果蝇进一步研究
2 2
该突变基因的作用。
(2)PCR扩增法可用于基因点突变的检出，其基本原理是，如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用耐
热DNA聚合酶无法延伸。已知某变异果蝇品种在Badh2基因的EXON7区出现了一个8bp的碱基对缺失和
三个位置的碱基替换（其他序列与野生型一致），为了检测该变异，现设计以下四条引物进行PCR（如图
所示）。
除了题干中提到的引物、耐热DNA聚合酶和DNA模板外，PCR反应体系中还需添加 。若在8bp缺
失型的DNA样本中同时加入四条引物进行PCR扩增，实验结束后应使用 技术对产物进行检测，且理论上可以得到 种序列不同的DNA片段。
(3)在检出突变基因后，科学家往往利用基因工程的方式获得该基因对应的蛋白质并进行下一步研究。如图
为构建重组质粒的流程示意图，在该过程中，应使用 对质粒S进行酶切。将重组质粒通过转化导入
亮氨酸合成缺陷细菌后，应使用 （填“添加亮氨酸”或“不添加亮氨酸”）的选择培养基，同时挑
取 （填“有绿色荧光”或“没有绿色荧光”）的菌落进行进一步鉴定。
11．人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶
性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成
为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题：
注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，
只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。
(1)图示hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并
保证连接的方向性，可在其两端添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷
酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序
列是5＇ -3＇。
(2)图示 hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。从生产控制的角度分析，选用
AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。
(3)阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌 的特点，从而实现重组DNA的扩增，然后在含有
的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。
(4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （a.氨苄青霉素b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此
菌株扩大培养后，离心取上清液，依据 原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ
基因得以表达。
