文档内容
押非选择题
生物技术与工程
考向预测 考情统计（2023年） 核心考点
近几年高考题通常以具体
情境，考查基因工程的原理、
工具和基本操作程序，启动子
2024·浙江
的含义和功能，PCR技术的原
2023·河北
理，限制酶的作用、基因表达
2023·重庆
载体的组成、启动子的作用
2023·辽宁
等，题目难度系数大：其中启
2023·江苏
动子的插入位点和插入方向等
2023·海南 生物技术与工程
都需要学生有很强的理解信
2023·天津
息、获取信息的能力、以及综
2023·北京
合运用知识解决问题的科学思
2023·山东
维和科学探究能力，通过基因
2023·湖北
工程考查学生的结构与功能
2022·福建
观。预测2024年难度系数也
会非常大，不排除出现细胞工
程的可能。
一、重组DNA技术的基本工具
考向01 生物技术与工程
1.基因工程概述
1.（2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研
究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了
F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因
用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒
绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表
示；f杂合子基因型用+f表示）
回答下列问题：
(1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个
DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前
出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而 提醒
丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进
行 和 。 基因工程的理论基础(2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用
限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检
测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠
和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第
泳道。
2.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f
基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g
小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基
提醒
因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：
不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型
①将一个基因从DNA分子上切割下来需
用+g表示）
要切两处，同时产生四个黏性末端或平
(4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别
末端。
提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的
mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针 ②限制酶不切割自身DNA的原因是原核
和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是
生物DNA分子中不存在该酶的识别序列
。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠
或识别序列已经被修饰。
不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。
(2)DNA连接酶
2．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴
油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶
（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获
得高产生物柴油的硅藻品系。
提醒
回答下列问题：
①DNA 连接酶连接的是两个 DNA 片
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异
段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷
获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标 酸连接到已有的DNA片段上。
记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA
(3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据
表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅
链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，
(3)载体
扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的
组，样品2有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂
质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结
果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平
均水平明显 。同时，还需测定 以比较在相同发酵条
件下品系A与B的繁殖速率。
3.限制酶的选择原则
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选
反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显
择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。
著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中
NADH水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复
制原点原则：所选择的限制酶尽量不要
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生
物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即 破坏这些结构，如图乙中不选择 Sma
可） Ⅰ。
3．（2023·重庆·高考真题）妊娠与子宫内膜基质细胞的 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选
功能密切相关。某研究小组通过如图所示的实验流程获得
择与切割目的基因相同的限制酶切割质
了子宫内膜基质细胞，以期用于妊娠相关疾病的研究。
粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质
粒自身环化和随意连接，也可使用不同
的限制酶切割目的基因和质粒，如图也
可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
(1)手术获得的皮肤组织需在低温下运至实验室，低温对 4.标记基因的作用
细胞中各种蛋白质的作用为 。
标记基因可用于检测目的基因是否导入
(2)过程①中，诱导形成PS细胞时，需提高成纤维细胞中
受体细胞：
4个基因的表达量，可采用 技术将这些基因导入该
细胞。这4个基因的主要作用为：M基因促进增殖，S基
因和C基因控制干细胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。若
成纤维细胞形成肿瘤细胞，最有可能的原因是 基因
过量表达。
(3)培养iPS细胞时，应对所处环境定期消毒以降低细胞被
污染风险。可用紫外线进行消毒的是_____（多选）。
A．培养基 B．培养瓶C．细胞培养室 D．CO 培养箱
2
(4)过程②中，iPS细胞经历的生命历程为 。PCR技
术可用于检测子宫内膜基质细胞关键基因的mRNA水
平，mRNA需经过 才能作为PCR扩增的模板。
4．（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，
不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基
因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆
菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
二、基因工程的基本操作程序
(2)PCR中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
1.目的基因的筛选与获取
①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的
RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的
DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将 (2)利用PCR获取和扩增目的基因
该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提
升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱
基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，
由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图
示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后
的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将
其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌
菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长
度，这一操作的目的是 。正确连接的基因表达载体
被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
提醒
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，
根据中心法则，可通过 反应获得PCR的模板。 ①在 PCR 过程中实际加入的原料为
5．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧 dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，
光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1 既可作为合成DNA子链的原料，又可为所示。请回答下列问题： DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱
基序列互补配对的短单链核酸，作为新
子链的合成起点，只能结合在母链的 3′
端，使DNA聚合酶能够从引物的 3′端开
始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链
结合，温度过低则易使两条母链配对结
合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要
Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个 般要添加Mg2＋。
反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是
。 2.基因表达载体的构建——核心
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项
中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作
用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传
统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有
。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，
下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同
菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩
增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结
果判断，可以舍弃的质粒有 。
提醒 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一
步通过基因测序确认，原因是
。
6．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的
重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因
递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB
法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某
3.将目的基因导入受体细胞
植物中递送基因的示意图。
只有该步骤没涉及碱基互补配对原则
回答下列问题。
提醒
(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；
(1)农杆菌特点
从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和
，该过程还需要光照，其作用是 。
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸
(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培
子植物，而对大多数单子叶植物没有侵
养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含
染能力。
有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标
注 。
②农杆菌细胞内含有 Ti质粒，当它侵染
(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因
植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA转
递送到植物细胞中的原因是 。
移到被侵染的细胞中，并且将其整合到
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了
该细胞的染色体DNA上。
用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有
绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重 (2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次
组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．
拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-
据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是
DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指
，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥
作用的方法是 ，依据是 。 插入目的基因的 TDNA拼接到受体细胞(5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点 的染色体DNA上；两次导入：第一次导
是 （答出2点即可）。
入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆
7．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的 菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的
转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设
基因的TDNA导入受体细胞。
计表达载体，思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。 (3)导入的目的基因，可能存在于细胞质
中，也可能整合到染色体DNA上。存在
于染色体DNA上的目的基因有可能通过
花粉传播进入杂草或其他作物中，造成
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿
“基因污染”。
酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞
(内/外)发挥作用。
4.目的基因的检测与鉴定
(2)外源基因的插入方法
同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链
断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外
源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌
株，如甲图所示。
三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外
及电泳鉴定
源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技
术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片 1.DNA的粗提取与鉴定
段。PCR时应选用的一对引物为 (从P1~P6中
选)。
(3)标记基因的选择 URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常
被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟
乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同
URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，
并利用 的培养基筛选存活菌株。
(2)方法步骤
②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标
记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应
向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C
和C´,并以下图方式 排列才能通过同源重组达到上
述目的。
此后，需要将菌株1在 的培养基上培养，存活
菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。
(4)表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒
酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图 的排布方式。 提醒
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要
轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致
DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞
8．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会 作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的
增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可
红细胞无细胞核和其他细胞器 (无
能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采
DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥
胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并
(1)实验基础
掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能
与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的
EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养
板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养
孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细
胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如
图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点
到 点。
(2)PCR实验操作步骤
(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变
胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲
喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科
学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染
（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其 色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被
编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA 检测出来。
片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er
①成功扩增出DNA片段的判断依据是可
蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小
分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小
以在紫外灯下直接观察到DNA条带。
鼠IK的技术路线： →连接到表
②进行电泳鉴定的结果应该是一条条
达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →
带。如图所示，该片段大小约为 750
获得小鼠IK。
bp。
(4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细
胞周期时长（t）是途径Ⅱ细胞周期时长（t）的三倍以
1 2
上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t 时间后换用
2BrdU饲喂，再过t 时间后检测B细胞被标记的情况。研
2
究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分
裂，与之相应的检测结果应是
。
提醒
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR
实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏
水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②在向微量离心管中添加反应组分时，
每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都
必须更换，避免试剂的污染。
③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁
移速率越慢；DNA的相对分子量越小，
迁移速率越快。
四、PCR技术与电泳相关问题
PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的
1 3 7 2n－1
数量
同时含两种引物的
0 2 6 2n－2
数量2n＋1－
共消耗引物的数量 2 6 14
2
PCR定点突变技术——重叠延伸PCR
1.图解
2.四种引物
引物 2 和 3 的突起处代表与模板链不能
互补的突变位点，而这两条引物有部分
碱基(包括突变位点)是可以互补的。
3.流程
(1)分别利用引物1和2，引物3和4进行
PCR后，得到的DNA片段可以通过引物
2和3互补的碱基杂交在一起。
(2)再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能
成为一条完整的DNA片段。
(3)用引物 1和4进行扩增得到含有突变
位点的DNA片段。
(4)通过测序可以检验定点突变是否成
功。
尝试解答：
____________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________
1．【答案】(1) 编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失
(2) 3 2
(3) 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1
(4) 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长
【分析】基因分离定律实质：在杂合子细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；当细胞进行减数分裂，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子当中，独立地随配子
遗传给后代。
【详解】（1）依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从
而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决
定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失
或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。
（2）从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因
此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来
能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1泳道中
只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合
子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。
（3）据题意可知，野生型基因用++表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因
型用+f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠（+f/++）与
g小鼠（++/gg）杂交，后代为++/+g和+f/+g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠（+f）与
g小鼠（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。
（4）据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢失，无法转录出 mRNA，
也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g
小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没
有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。
2．【答案】(1)溶解度
(2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME基
因”）
(3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合
到硅藻细胞基因组中”）
(4) 增加 细胞数量
(5)有氧呼吸生成的ATP增多
(6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生
产”）
【分析】1、PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物
体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。2、PCR原理：DNA半保留复制。
3、PCR基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷三磷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。
【详解】（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。
因此，根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到
的粗提DNA可以作为PCR扩增目的基因的模板。
（2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有
特殊序列结构的DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果
酸酶（ME）基因。
（3）PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的
基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链
核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA作为
PCR模板，而在实验组中以转ME基因的硅藻细胞基因组DNA作为模板。如此比较两个实验扩增结果可
以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME基因序列是否整合到硅藻细胞基
因组中。
（4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3分析
可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定
硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A与B的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高
产生物柴油的优良硅藻细胞品系。
（5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B线
粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析可知，ME基因的超表达导致线粒体中的NADH水平升高，
NADH进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。
（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、
不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
3．【答案】(1)抑制酶的活性（降低蛋白质或酶的活性），防止蛋白质变性
(2) 转基因 M
(3)CD
(4) 增殖分化 逆转录/反转录
【分析】1、构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达
和发挥作用。基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因。
2、动物细胞培养的条件：（1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌；②添加一定量的抗生素；③定期更换培养液，以清除代谢废物。
（2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。
（3）温度和pH：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。
（4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO（维持培养液的pH）。
2
【详解】（1）低温可以抑制酶的活性，防止蛋白质变性，使细胞中的蛋白质维持正常的生理功能。
（2）将外源基因导入细胞内，通常需要转基因技术。即过程①中，诱导形成PS细胞时，需提高成纤维细
胞中4个基因的表达量，可采用转基因技术将这些基因导入该细胞。M基因促进增殖，S基因和C基因控
制干细胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。肿瘤细胞（癌细胞）具有无限增殖的能力，因此若成纤维细胞形
成肿瘤细胞，最有可能的原因是M基因过量表达造成的。
（3）培养iPS细胞时，应对所处环境定期消毒以降低细胞被污染风险。可用紫外线对细胞培养室和CO 培
2
养箱进行消毒处理，而对培养基和培养瓶需要进行灭菌处理，因此AB错误，CD正确。
故选CD。
（4）由图可知，过程②中，iPS细胞经过细胞的分裂分化，即增殖分化，形成了体腔上皮。PCR扩增的模
板为DNA，因此若想利用PCR技术检测子宫内膜基质细胞关键基因的mRNA水平，mRNA需经过逆转录
过程形成DNA，才可作为PCR的模板。
4．【答案】(1)蛋白质
(2)③
(3)②
(4)标记基因
(5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检
测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。（2）PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片
段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶
切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。
5．【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度
(2)CD
(3)限制性内切核酸酶（限制酶）
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因
——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR
扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程
需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和
引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq
DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小
在 30s~2min的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。
（2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能
与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中
的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，
由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核
酸酶（限制酶）和DNA连接酶。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于
30，A错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，
故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落
无需进一步划线纯化，D正确。
故选ABC。
（5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F和F2-R进行了
PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，
因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
6．【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
(2) 遗传特性 转基因标识
(3)Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
(4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导
致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
(5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【分析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、
芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。【详解】（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来
特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值
能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机
物，供试管苗生长发育。
（2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。
图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。
（3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T-DNA能
将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑
载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功
获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴
定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会
导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。
（5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组
织培养技术进行操作，且培养周期较短。
7．【答案】(1)外
(2)P 和P
1 6
(3) 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2分）
(4)4
【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进
行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
【详解】（1）由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所
在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，
将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P 和P
1 6
这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上
培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式一，C和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，
如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同 时满足两个条件：一是需要将UR43标
记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵母基因组AB之间，所以A、B应置于标记基因与目的基因
最 外侧；二是需要利用C、C片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C应紧邻
URA3两侧。同时满足上述条件 的只有图4。
8．【答案】(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3) 将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B细胞没有被BrdU标记
【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水
解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：
一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。
【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，
掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞
混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定
时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到
峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，
结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于
x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱
导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、
分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t）是途径Ⅱ细胞周期时长（t）的三倍以上，若先用
1 2
EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t 时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应
2
都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程
已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t 时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B
2
细胞没有被BrdU标记。1．尖孢镰刀菌容易引起番茄枯萎症，对农业造成巨大损失。为研究F基因（目的基因）的功能，科学家
利用同源重组交换的原理对F基因敲除，分析其生物学功能及致病力。基因敲除过程是先构建基因敲除载
体，将基因敲除载体导入受体细胞，经过筛选找出基因敲除成功的受体细胞。基因敲除原理如下图所示：
注：Hygr为潮霉素抗性基因；A、B为实现同源重组交换的序列，C、D、E、G为其他不同的基因片段；1
～6为引物。
(1)选取限制酶 、 分别对F基因左右两端A、B片段进行酶切，并用 酶将A、B片段与潮霉素
抗性基因连接，构建目的基因敲除载体。同时需要在潮霉素抗性基因前添加启动子，启动子的作用是 。
(2)把构建好的目的基因敲除载体导入尖孢镰刀菌细胞内，导入成功后，将菌液放在含 的固体培养基上
培养，使用的接种方法是 。在这一过程中，F基因与潮霉素抗性基因发生同源重组交换，与 （填
减数分裂时期）的某些行为类似。
(3)培养完毕，挑取单菌落提取其基因组DNA作为模板，选择引物 进行PCR扩增，其中引物会结合在
DNA片段的 （3'或5'）端，扩增30个循环进行电泳，如果没有F基因条带，则确定目的基因敲除成功。
(4)潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌中表达的原因是 。
【答案】(1) KpnI/XhoI SmaI/XbaI DNA连接 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基
因转录，使潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌细胞内表达
(2) 潮霉素 平板划线法或稀释涂布平板法 减数分裂Ⅰ前期
(3) 引物1、2 3’
(4)生物界共用一套遗传密码子【分析】1、基因工程技术的基本步骤：①目的基因的获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体
细胞④目的基因的检测与鉴定。2、PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，
在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 。
【详解】（1）选取限制酶KpnI/XhoI对A片段进行酶切，选取限制酶SmaI/XbaI对B片段进行酶切。需要
用DNA连接酶将A、B片段与潮霉素抗性基因连接。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因
转录，能够使潮霉素抗性基因在尖孢镰刀菌细胞内表达。
（2）导入完成后，潮霉素抗性基因与F基因完成重组替换，受体细胞就具有抗潮霉素的特性，所以用潮
霉素进行筛选转化的受体细胞。得到单菌落的接种方法有平板划线法或稀释涂布平板法。减数分裂过程中，
发生类似于潮霉素抗性基因替换目的基因的过程，是减数分裂Ⅰ前期（或四分体时期）的互换。
（3）用基因敲除成功的基因组DNA为模板，由于子链延伸方向是5’到3’，所以引物会结合在DNA片段
的3’端。如果敲除成功，那么尖孢镰刀菌无F基因，用引物1和2是无法扩增出F基因的。
（4）由于生物界共用一套遗传密码子，所以潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌中表达。
2．紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种次生代谢物，具有高抗癌活性，现已被广泛用于乳腺癌等癌
症的治疗。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取，但野生红豆杉是濒危植物，这种方法
不利于对它们的保护。下图为科研人员制备能合成紫杉醇的紫茎泽兰愈伤组织细胞的流程，EcoRⅠ、BamHⅠ
为限制酶。回答下列问题：
(1)图中过程①依据的原理是 ，复制开始时需要用到 种引物，引物的作用是 。
(2)图中过程②构建基因表达载体时，目的基因必须位于 之间，启动子的作用是 。
(3)某同学认为图中过程③中Ti质粒的T-DNA能携带目的基因整合到根瘤农杆菌的染色体DNA中，你认为
该同学的说法是否合理，理由是 。
(4)过程④需要控制培养基中 ，以防愈伤组织细胞发生分化，若要检测目的基因是否导入受体细胞
以及成功表达，则可以分别使用 和 技术进行检测。
【答案】(1) DNA半保留复制 2 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸(2) 启动子与终止子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白
质
(3)不合理，根瘤农杆菌是原核细胞无染色体，而过程③获得含目的基因的Ti质粒的T-DNA是利用农杆菌
侵染植物细胞后，将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞
的染色体DNA上
(4) 植物激素的种类和比例 PCR技术 抗原-抗体杂交
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）PCR技术的原理是DNA半保留复制，而DNA的复制需要2种引物，其主要原因是DNA聚
合酶只能从3′端延伸DNA链。因此，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
（2）图中过程②是构建基因表达载体，在构建基因表达载体时目的基因必须位于启动子和终止子之间，
才能使目的基因正常转录，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终
表达出蛋白质。
（3）不合理，根瘤农杆菌是原核细胞无染色体，而过程③获得含目的基因的Ti质粒的T-DNA是利用农杆
菌侵染植物细胞后，将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细
胞的染色体DNA上。
（4）过程④是植物组织培养，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们
的浓度、比例都会影响植物细胞的发育方向。所以过程④需要控制培养基中植物激素的种类和比例，以防
愈伤组织细胞发生分化。检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因可以使用PCR技术进行检测，
而检测目的基因是否成功表达，可以使用抗原-抗体杂交技术进行检测。
3．筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签（能特
异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合），再利用该标签在病毒敏感细胞（如非洲绿猴肾细胞）中快
速纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，具体过程如下图。其中XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶，
PCMV、T7表示启动子，Kozak序列是翻译起始因子结合位点的编码序列，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，
ori表示复制原点。请回答问题：(1)为成功构建重组质粒pcDNA3.1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，应在S基因的5'端引入 序列，
3'端删除 的编码序列。
(2)将S基因和TAP序列的扩增产物进行 鉴定，结果显示两个片段均得到扩增且与预期值大小相一
致。再经测序证实正确后，将这两个片段经限制酶切割并通过 酶连接定向克隆入质粒pcDNA3.1.
(3)重组质粒pcDNA3.1-S-TAP转染细胞前，需将vero细胞置于37℃、 （填气体条件）下培养
18~24h进行传代。将传代的细胞与重组质粒pcDNA3.1-S-TAP以适宜比例混合，在转染试剂的作用下转染
细胞（实验组），为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做法为 。将转染24h的细胞置于
载玻片，洗涤、固定后滴加正常人血清稀释液和荧光素标记的羊抗人IgG抗体稀释液，荧光显微镜下观察，
若 ，则说明S-TAP融合蛋白在vero细胞中得以表达。
(4)通过上述检测发现，S-TAP融合蛋白表达量较低，其原因可能有 （填序号）。
①重组质粒pcDNA3.1-S-TAP在vero细胞中大量复制
②S-TAP融合基因在vero细胞中转录出的mRNA量较少
③S基因与病毒宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA的tRNA数量不足
【答案】(1) Kozak序列和SmaⅠ识别序列 终止密码子编码序列
(2) 琼脂糖凝胶电泳 DNA连接
(3) 95%空气+5%CO 使用PCDNA3.1空载体转染细胞，其余操作相同 出现荧光标记
2
(4)②③
【分析】构建基因表达载体：用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生
相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
【详解】（1）Kozak序列是翻译起始因子结合位点的编码序列，根据构建的重组质粒图示可分析，在S基
因的上游加入了Kozak序列；为了使目的基因和质粒连接，根据启动子的方向、质粒上的酶切位点可知，
上游不能用XhoI，故应在S基因的上游加入Smal识别序列；因为S基因和TAP序列需要同步表达才能利
用TAP作为S蛋白的标签，二者共用一个启动子，故应去除S基因下游的终止密码子编码序列。（2）将S基因和TAP序列的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示两个片段均得到扩增且与预期
值大小相一致。DNA连接酶可将限制酶切割后形成的末端连接。
（3）细胞培养的气体条件是95%的空气和5%的CO。对照组是为了排除空质粒的影响，故应使用
2
PCDNA3.1空载体转染细胞，其余操作相同。将转染24h的细胞置于载玻片，洗涤、固定后滴加正常人血
清稀释液和荧光素标记的羊抗人IgG抗体稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明S-TAP融
合蛋白在vero细胞中得以表达，荧光素标记的羊抗人IgG抗体才能够与TAP标签结合发出荧光。
（4）蛋白质表达要经过转录和翻译两个过程，①重组质粒pcDNA3.1-S-TAP在vero细胞中大量复制，与
蛋白表达量较低无关，①错误；②S-TAP融合基因在vero细胞中转录出的mRNA量较少，模板少，影响
翻译出的蛋白质含量，②正确；③tRNA在翻译过程中起到转运氨基酸的作用，tRNA数量不足影响翻译的
进行，③正确，故选②③。
4．鸭坦布苏病毒可感染鸭、鹅等多种禽类，给禽类养殖业带来严重危害。科研人员通过基因工程获取该
病毒的prM蛋白用于制备单克隆抗体。为了鉴定单克隆抗体识别prM蛋白的具体区域，将prM蛋白逐步截
短，分别与纯化的单克隆抗体反应，实验结果如下图（“aa”表示氨基酸，“+”表示有反应，“-”表示无反
应）。
回答下列问题。
(1)通过基因工程获取prM蛋白，需要利用 技术快速扩增目的基因，与生物体内DNA复制相比该
技术所需酶的种类 ，但需具有， 的特性，反应过程中复性的结果是 。
(2)用prM蛋白为抗原制备单克隆抗体，需用纯化的prM蛋白对小鼠进行免疫，其目的是获得 细胞，
并将该细胞与骨髓瘤细胞融合，对经 培养的杂交瘤细胞进行 培养和抗体检测，多次筛选
后可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞，再将其注射到小鼠的腹腔内增殖并产生抗体。
(3)根据图示实验结果分析，该单克隆抗体识别prM蛋白的区域大概包含 （填“10”“15”或“20”）
个氨基酸残基。
【答案】(1) PCR Taq酶 耐高温 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
(2) 能产生抗prM蛋白（特定）抗体的B淋巴 选择培养 克隆化(3)20
【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合
成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高
温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温
复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1）快速扩增目的基因需要利用PCR技术。与生物体内DNA复制相比，该技术需要在高温下解
开DNA双链进行DNA复制，所需酶是Taq酶需要耐高温。反应过程包括变性（DNA解旋过程）、复性
（引物结合到互补链DNA上）和延伸（合成子链），其复性的结果是两种引物通过碱基互补配对与两条
单链DNA结合；
（2）抗原能刺激机体发生免疫反应，一种抗原能引起机体产生特定的抗体，用prM蛋白为抗原制备单克
隆抗体，需用纯化的prM蛋白对小鼠进行免疫，其目的是获得能产生抗prM蛋白（特定）抗体的B淋巴细
胞，并将该细胞与骨髓瘤细胞融合，对经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选后
可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞，再将其注射到小鼠的腹腔内增殖、合成抗体；
（3）根据图示实验结果分析，该单克隆抗体识别prM蛋白的区域大概包含60-40等于20个氨基酸残基。
5．动物细胞生物反应器旨在复现动物体内的生理条件，以便在实验室环境中进行有效的细胞培养。该系
统特别适用于生产特定蛋白质，例如人乳铁蛋白。实验人员构建了人乳铁蛋白基因表达载体，然后将该重
组载体导入奶牛体内以生产人乳铁蛋白相关过程如图所示。回答下列问题：
(1)获取人乳铁蛋白基因是实施人乳铁蛋白动物细胞生物反应器工程的第一步。实验人员利用PCK技术材
增人乳铁蛋白基因过程中，需要使用TaqDNA聚合酶，而不能使用普通的DNA聚合酶，其原因是
。
(2)图中标注了三种限制酶BamHI、HindⅢ、SmaI及其酶切位点，TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨
苄青霉素抗性基因。据图分析，构建人乳铁蛋白基因表达载体时，应选择的两种限制酶是 ，同时，要将人乳铁蛋白基因导入启动子和 之间。
(3)将人乳铁蛋白基因表达载体导入供体牛受精卵后培养至早期胚胎，然后将早期胚胎移植到代孕牛体内。
此过程中，一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂，这是因为 。
(4)为检测人乳铁蛋白基因是否在雌性转基因牛中表达，研究人员提取了A、B、C三头转基因牛的乳汁，
从中提取了蛋白质，结果发现A、C两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B转基因牛提取
的乳汁中检测到了人乳铁蛋白。进一步提取A、C两头转基因牛的基因组DNA和mRNA进行检测，A转
基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但不能检测到相关mRNA，C转基因牛则都不能检测到。以上两次检测
结果说明了 。
【答案】(1)PCR技术扩增人乳铁蛋白基因时，需要加热至72℃左右合成DNA子链，在该温度下，
TaqDNA聚合酶能够耐高温并发挥作用，普通的DNA聚合酶因不耐高温而失活
(2) BamHI、HindⅢ 终止子
(3)受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应
(4)A转基因牛成功导入了人乳铁蛋白基因，但未能表达，C转基因牛未导入人乳铁蛋白基因，B转基因牛
成功导入了人乳铁蛋白基因，且能表达
【分析】根据题意和图示分析可知：图中质粒包括四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、启动子、复制
原点，以及两个限制酶切点，并且两个限制酶切点的位置均在四环素抗性基因上；目的基因上有三个限制
酶切点，与质粒对照，共有的是BamHⅠ、HindⅢ。图中①表示目的基因导入受体细胞，②表示通过胚胎移
植的方式将早期胚胎移植到代孕母牛体内。
【详解】（1）TaqDNA聚合酶，与普通的DNA聚合酶相比较，耐高温，PCR技术需要经过变性
（90℃）、复性（50℃）和延伸（70℃）三个过程，所需要的温度条件均高于普通的DNA聚合酶的耐受
温度，TaqDNA聚合酶能够耐高温并发挥作用，普通的DNA聚合酶因不耐高温而失活，所以使用TaqDNA
聚合酶。
（2）从图中可知，SmaI会破坏人乳铁蛋白基因，所以应使用BamHI、HindⅢ两种限制酶，构建基因表达
载体，同时将人乳铁蛋白基因导入启动子和终止子之间。
（3）在胚胎移植过程中，供体牛的早期胚胎被植入代孕牛体内，代孕牛通常不会对移植的胚胎产生免疫
排斥反应，因此一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂。
（4）A、C两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B转基因牛提取的乳汁中检测到了人乳铁
蛋白，说明B转基因牛成功导入了人乳铁蛋白基因，且能表达；A转基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但
不能检测到相关mRNA，C转基因牛则都不能检测到，说明A转基因牛成功导入了人乳铁蛋白基因，但未
能表达，C转基因牛未导入人乳铁蛋白基因。6．抗菌肽是一类具有广谱抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,细菌不易对其产生耐药性且无残留等,被认为
是理想的抗生素替代品。为了突破抗菌肽在畜禽养殖业广泛应用的瓶颈，我国研究人员运用小分子泛素蛋
白（SUMO）融合技术将含有重组抗菌肽LLv基因的质粒导入大肠杆菌，表达融合蛋白SUMO-LLv,并优化
了表达条件,从而能高效获得重组抗菌肽 LLv。所用质粒含有卡那霉素抗性基因(KanR)、LacZ基因及
SacⅠ、XhoⅠ酶切位点等，其结构和构建重组质粒的过程如图1所示。据此分析回答以下问题：
注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
(1)扩增LLv基因时，PCR反应体系中含有的酶有 ；已知该基因序列不含图1中限制酶的识
别序列，为了使其能与已被酶切的质粒连接，需根据 设计引物。
(2)LLv基因以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。该基因内部没有SacⅠ、XhoⅠ这
两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。
(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，需用CaCl 处理大肠杆菌，其目的是 。
2
(4)为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal等成分的培养基中进
行接种，结果如图2，该同学采用的接种方法是 。图2中出现的 菌落即成功导入重组
质粒的大肠杆菌菌落，判断的理由是 。
【答案】(1) 耐高温的 DNA 聚合酶 LLv 基因两端的部分核苷酸序列和 Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ的识别序
列
(2)Xho Ⅰ、Sac Ⅰ（二者顺序不可调换）
(3)使大肠杆菌变为感受态细胞，便于从周围环境吸收 DNA 分子
(4) 稀释涂布平板法 白色 目的基因（或 LLv 基因）的插入破坏了 LacZ 基因的结构，使
其不能正常表达形成β-半乳糖苷酶，底物 X-gal 不会被分解
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因
——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR技术的基本原理是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于TaqDNA
聚合酶的酶促合成反应，即扩增LLv基因时，PCR反应体系中含有的酶有耐高温的 DNA 聚合酶。PCR过
程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。目的基因需要与质粒进行连接，
但已知LLv基因序列不含图1中限制酶（ Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ）的识别序列，为了使LLv基因能与已被酶切的
质粒连接，需要根据LLv 基因两端的部分核苷酸序列和 Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ的识别序列设计引物。
（2）LLv基因以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'，DNA模板被转录方向是从
3→5′，即图1中酶切位点1对应的酶为Xho Ⅰ，酶切位点2对应的酶为Sac Ⅰ。
（3）将目的基因导入微生物细胞，常用Ca2+处理微生物，使微生物细胞处于感受态，便于从外界环境吸收
DNA分子。
（4）分析菌落分布可知，采用的接种方法是稀释涂布平板法。为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选
出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal等成分的培养基中进行接种，目的基因（ LLv 基因）的插入破坏
了 LacZ 基因的结构，使其不能正常表达形成β-半乳糖苷酶，底物 X-gal 不会被分解，使菌落为白色，因
此图2中出现的白色菌落即成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落。
7．某种小麦的雄性不育由核基因M控制，其整个花药在发育早期停止发育进程，因此其雄性不育比较彻
底。研究发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且M及其等位基因的编码区相同；为研
究该序列与雄性不育之间的关系，科研人员在野生型小麦中获得了M等位基因的启动子并利用Ti质粒构
建表达载体，表达载体T-DNA部分结构如图1所示，GFP表达后会发出绿色荧光。将不同表达载体转入幼
胚获得转基因小麦，分别对核不育小麦、野生型小麦及转基因小麦的表型和M基因表达情况进行检测，部
分结果如表：组别 实验材料 载体组成I、Ⅱ 植株表型 M基因表达情况
核不育小
第一组 无 雄性不育 eg
表
野生型小
第二组 无 可育 fg
麦
野生型小
第三组 ad 死亡
麦
野生型小
第四组 ①____ ②____ eg
麦
注：a．通用的强启动子b．M等位基因启动子c．插入TRIM序列的M等位基因启动子d．M编码区e．
仅在花药发育早期表达f．在花药发育各时期均不表达g．在根、茎、叶、雌蕊中均不表达
(1)表中①处应分别选择 （填表注中字母序号），②处植株表型是 ，结果发现在存活的转基因小麦
花药中均能检测到绿色荧光。根据实验结果推测导致雄性不育的原因是 。
(2)实验过程中 （填“需要”或“不需要”）设置将bd导入野生型小麦的实验组，理由是 。
(3)科研人员为检测（1）中T-DNA插入受体细胞染色体中的位置，利用反向PCR技术对插入位点两侧序列
进行了分析，过程如图2。已知T-DNA的一条单链序列为：5-GCAATGCGTAGCCTCT……
AACTATGCGCTCATGA-3（虚线处省略了部分核苷酸序列）。应选下列引物中的 （填序号）用于步骤
Ⅲ，引物的作用是 。
A．5'-CGCGAGTACT-3' B．5'-GCGCTCATGA-3' C．5'-CGTAGCCTCT-3' D．5'-TACGCATTGC-3'
【答案】(1) c、d 雄性不育 TRIM序列的插入引起启动子序列改变，导致M基因在花药发
育早期表达
(2) 不需要 野生型小麦本身具有bd，不需要另外导入
(3) BD 使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸【分析】据题干信息分析，本实验的实验目的是研究TRIM序列与雄性不育之间的关系，自变量是野生型
小麦是否携带有TRIM序列，检测指标是植株的表型（雄性是否不育）以及M基因的表达情况
【详解】（1）本实验的实验目的是研究TRIM序列与雄性不育之间的关系，因此野生型小麦需要选择插入
TRIM序列的M等位基因启动子，即c，TRIM序列的M等位基因启动子的作用是启动M基因的表达的，
因此在构建载体组成I、Ⅱ时需要在插入TRIM序列的M等位基因启动子之后加入M编码区，故表中①处
应分别选择c、d。已知所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且第一组实验结果和第四组的
实验结果中M基因表达情况是相同的，因此②处植株表型是雄性不育。第二组实验野生型小麦M基因在
花药发育各时期均不表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达，而第四组和第一组雄性不育植株中M基因仅
在花药发育早期表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达，综上推测导致雄性不育的原因是TRIM序列的插
入引起启动子序列改变，导致M基因在花药发育早期表达。
（2）由于野生型小麦本身具有bd，不需要另外导入b．M等位基因启动子和d．M编码区。
（3）反向PCR技术指的是扩增T-DNA的两侧序列，以T-DNA的一条单链序列5'-
GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA-3'为模板，扩增其5'一侧序列，因此对应的引物是5'-
TACGCATTGC-3'，以T-DNA的另一条单链序列3'-CGTTACGCATCGGAGA……
TTGATACGCGAGTACT-5'为模板，扩增其5'一侧序列，因此对应的引物是5'-GCGCTCATGA-3'，故选
BD。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。
8．谷氨酸脱羧酶能以谷氨酸钠为前体产生γ-氨基丁酸，蛋白质复合物SNOI-SNZI能提高谷氨酸脱羧酶的
活性。将谷氨酸脱羧酶基因gadB(1401bp)和基因SNOI(675bp) 、SNZI (894bp) 导入大肠杆菌， 以探究该
复合物对其生产能力的影响。请回答下列问题：
(1)构建基因表达载体前，需先通过PCR 分别扩增目的基因片段，扩增反应体系应添加引物、模板、 、
缓冲液等，添加引物量不宜过多，原因主要是 。
(2)表1 是相关基因扩增所用引物的部分序列，表2是多种限制酶的识别序列和切割位点。构建重组质粒时，
先将gadB 和 pTrc99a质粒(4176bp)分别用限制酶 进行双酶切， 并连接得到重组质粒 pTrc99a-
gadB。将基因 SNOI 和基因SNZI 分别连接到重组质粒 pTrc99a-gadB 上时， 均需用 (填限制酶)和
DNA 连接酶处理，最终得到重组质粒 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI，如图1所示。表1
基因 引物1部分序列(5'→3') 引物2部分序列(5'→3')
gadB TCGCCCATGGCCATGATAAG CTTCGGTACCTTAGGTATGT
SNZ1 CTAAGGATCCGAAGGAGATA CCTTCTCTAGATTACCACCC
SNO1 TCGCGGTACCAAGGAGATAT CTTCGGATCCTTAATTAGAA
表2
识别序列
限制酶
和酶切位点
Xba Ⅰ T↓CTAGA
Kpn Ⅰ GGTAC↓C
Nco Ⅰ C↓CATGG
BamH Ⅰ G↓GATCC
(3)采用电泳的方法对 pTrc99a 质粒、重组质粒 pTrc99a-gadB 和重组质粒 pTrc99a-gadB-SNO1-SNZI 进行
鉴定。若构建成功， 用限制酶KpnI单酶切后电泳获得图2-A，则可推测泳道2是 的电泳结果；用限
制酶 酶切后电泳可获得图2-B泳道3 结果。
(4)将质粒 pTrc99a、pTrc99a-gadB 和 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI 分别转化至处于 的大肠杆菌细胞中，分别获得菌株R 、R 、R ，培养后分别接种于含一定量 的发酵培养基中，一段时间后测定γ-氨基丁
1 2 3
酸含量。结果如图3所示。结果表明，与导入谷氨酸脱羧酶基因的菌株比，SNOI-SNZI基因的导入
了其生产γ-氨基丁酸的能力，从能量代谢的角度分析，其原因有 。
【答案】(1) TaqDNA 聚合酶、四种脱氧核苷酸 易引起非特异性扩增
(2) NcoI和KpnI BamHI
(3) 重组质粒pTre99a-gadB BamHI和Xba1
(4) 感受态(能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态) 谷氨酸钠 降低 SNOI-SNZI 基因
表达及其引起的细胞代谢过程消耗了大量的能量，导致γ-氨基丁酸的生产能力下降
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取：利用PCR技术扩增和人工合成。基因表达载体的构
建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导
入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）利用PCR获取目的基因时，PCR反应体系需要加入缓冲液、模板DNA、引物、4种脱氧核
苷酸、耐高温的DNA聚合酶等。若引物量添加过多，则引物会与非扩增序列中模板结合，易引起非特异
性扩增。
（2）根据表1中GadB基因的引物1中含有序列CCATGG，引物2中含有序列GGTACC，结合表2可知，
要将GadB基因插入质粒，需要用限制酶NcoI和KpnI将目的基因和质粒切出黏性末端，并用DNA连接酶
连接得到重组质粒 pTrc99a-gadB。SNOI 基因的引物2和SNZI基因的引物1上均含有GGATCC序列
（BamHI的识别序列），且重组质粒pTrc99a-gadB上也含有BamHI切割位点，结合表2可知，将基因
SNOI和基因SNZI分别连接到重组质粒pTrc99a-gadB上时，均需用BamHI和DNA连接酶处理，最终得到
重组质粒pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI。
（3）pTrc99a质粒为4176bp，gadB为1401bp，二者连接时需要使用NcoI和KpnI限制酶处理，因此构建
的重组质粒长度=4176+1401－265－286=5026，接近5000bp，重组质粒pTre99a-gadB上含有一个限制酶
KpnI识别位点，故用限制酶KpnI单酶切后得到一个线性DNA，故推测图2-A中泳道2是重组质粒
pTre99a-gadB电泳的结果。图2-B的泳道3中含有约1500bp左右长度的片段，是基因SNOI(675bp)和SNZI
(894bp)的长度之和，图2-B泳道3中还含有接近5000bp的片段，结合（2）构建重组质粒pTrc99a-gadB-
SNO1-SNZ1所使用的限制酶可推测是使用限制酶BamHI和XbaI酶切后电泳获得的图2-B泳道3结果。
（4）将重组质粒导入大肠杆菌常用钙离子处理大肠杆菌，使其处于感受态，根据题意“谷氨酸脱羧酶能
以谷氨酸钠为前体产生γ-氨基丁酸”，因此培养基应加入谷氨酸钠。据图可知，R 组的γ-氨基丁酸的含量
3
低于R 组，说明与导入谷氨酸脱羧酶基因的菌株比，SNOI-SNZI基因的导入降低了其生产γ-氨基丁酸的能
2
力，从能量代谢的角度分析，其原因可能是SNOI-SNZI 基因表达及其引起的细胞代谢过程消耗了大量的能量，导致γ-氨基丁酸的生产能力下降。
9．细胞中NF-kB蛋白的活性水平与肿瘤的发生发展密切相关。为了高效地筛选出以NF-kB为靶点的抗肿
瘤药物，利用基因工程构建NF-kB的报告基因载体。具体原理为把已确定的NF-kB基因的调控序列（响应
元件）正确地剪切到报告基因GFP（其表达产物荧光蛋白可被实时检测）上，使报告基因能与NF-kB基因
同步表达，其工作模式见下图。构建载体过程中，报告基因GFP由pcDNA3．1-Flag-GFP质粒提供，NF-
kB基因由pGL6-NF-kB-Luc质粒提供。请回答下列问题：
(1)构建pGL6-NF-kB-CFP报告基因质粒时，首先以pcDNA3．1-Flag-GFP质粒为模板，利用PCR技术扩增
GFP基因，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、 （至少答两点）等。在PCR循环的3
个步骤中，温度设置最高的是 。
(2)用BamHI和HindⅢ限制性核酸内切酶（二者切割后的黏性末端不同）对上述PCR产物及pGL6-NF-kB-
Luc质粒进行双酶切，该方法的优点是 ，然后还需要使用 酶，才能得到
pGL6-NF-kB-GFP报告基因质粒。
(3)将pGL6-NF-kB-CFP报告基因质粒导入肿瘤细胞常用的方法是 ；体外培养肿瘤细胞除了
需要使用合成培养基外，还需要加入 等一些天然成分；再放入气体组成成分为
的培养箱中进行培养。
(4)将转染成功的肿瘤细胞置于含待检测抗肿瘤药物的培养基中培养一段时间，并通过特定方法检测细胞中
GFP蛋白表达量的变化，以显示NF-kB的活性水平。若药物抗肿瘤效果显著，可观测到的现象为
。
【答案】(1) 引物、热稳定性的DNA聚合酶（或Taq酶）、4种脱氧核苷酸（原料） 变性
(2) 避免质粒和GFP基因自身环化，避免GFP基因反向连接（或确保目的基因和质粒正确连接）
DNA连接
(3) 显微注射法 血清、血浆 95%空气和5%CO
2
(4)添加该药物的培养基中，肿瘤细胞GFP蛋白表达量显著下降
【分析】1、PCR技术过程包括：变性，当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链；复性，当温度
下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；延伸，当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
2、一般来说，动物细胞培养需要满足以下条件：
（1）营养：细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。将细胞所需的营养物质按
种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清
楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。培养动物细胞一般使用液体培养基，
也称为培养液。
（2）无菌、无毒的环境：在体外培养细胞时，必须保证环境是无菌、无毒的，即需要对培养液和所有培
养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代
谢物积累对细胞自身造成危害。
（3）温度、pH和渗透压：维持细胞生存必须有适宜的温度。哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5 °C为
宜。多数动物细胞生存的适宜pH为7.2~ 7.4。此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要
环境参数。
（4）气体环境：动物细胞培养所需气体主要有O 和CO。O 是细胞代谢所必需的，CO 的主要作用是维
2 2 2 2
持培养液的pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和
5%CO 的混合气体的CO 培养箱中进行培养。
2 2
【详解】（1）利用PCR技术扩增GFP基因，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、引物、热稳定性的
DNA聚合酶（或Taq酶）、4种脱氧核苷酸（原料）等。在PCR循环的3个步骤中，变性温度在90℃以上，
复性温度50 ℃左右，延伸温度72℃左右，所以温度设置最高的是变性。
（2）由题意可知，用两种切割后形成不同黏性末端的限制酶切割质粒和GFP基因，可以避免质粒和GFP
基因自身环化，也可以避免GFP基因反向连接。该反应系中还需要加入DNA连接酶才能将切割完的
pGL6-NF-kB-Luc质粒与GFP基因连接成pGL6-NF-kB-GFP报告基因质粒。
（3）将外源基因导入动物细胞常用显微注射法。体外培养肿瘤细胞除了需要使用合成培养基外，由于人
们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此通常需要加入血清等一些天然成分。培养箱中的气体具
体组成成分为95%空气+5%CO ，其中O 是细胞代谢所必需的，CO 的主要作用是维持培养液的pH。
2 2 2
（4）本研究的目的是高效地筛选出以NF-kB为靶点的抗肿瘤药物，由于GFP基因是NF-kB基因的报告基
因，因此抗肿瘤效果显著的药物使用后会使NF-kB表达量显著下降，与NF-kB基因具有相同响应元件的
GFP基因表达量也显著下降，因此会观测到肿瘤细胞GFP蛋白表达量显著下降的现象。
10．遗传学技术在突变检出领域中有着重要的贡献与作用。
(1)Muller-5技术常用于果蝇X染色体上突变的检出，已知果蝇棒眼对圆眼为显性，红眼对杏色眼为显性，
且控制这两对相对性状的基因皆位于X染色体上。下图为利用Muller-5品系雌果蝇检测基因突变的过程图。不考虑交叉互换。
为检测出果蝇X染色体上是否发生了突变，F 代需进行 （填“自由交配”“自交”或“单对交
1
配”）获得F 代。现有某纯合致死突变基因被检出，则在F 代中，最好选取性状为 果蝇进一步研究
2 2
该突变基因的作用。
(2)PCR扩增法可用于基因点突变的检出，其基本原理是，如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用耐
热DNA聚合酶无法延伸。已知某变异果蝇品种在Badh2基因的EXON7区出现了一个8bp的碱基对缺失和
三个位置的碱基替换（其他序列与野生型一致），为了检测该变异，现设计以下四条引物进行PCR（如图
所示）。
除了题干中提到的引物、耐热DNA聚合酶和DNA模板外，PCR反应体系中还需添加 。若在8bp缺
失型的DNA样本中同时加入四条引物进行PCR扩增，实验结束后应使用 技术对产物进行检测，且理
论上可以得到 种序列不同的DNA片段。
(3)在检出突变基因后，科学家往往利用基因工程的方式获得该基因对应的蛋白质并进行下一步研究。如图
为构建重组质粒的流程示意图，在该过程中，应使用 对质粒S进行酶切。将重组质粒通过转化导入
亮氨酸合成缺陷细菌后，应使用 （填“添加亮氨酸”或“不添加亮氨酸”）的选择培养基，同时挑
取 （填“有绿色荧光”或“没有绿色荧光”）的菌落进行进一步鉴定。【答案】(1) 单对交配 棒眼红眼雌
(2) 四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）、缓冲溶液 琼脂糖凝胶电泳 2 /两
(3) BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 不添加亮氨酸 没有绿色荧光
【分析】1、根据题意，Muller-5技术常用于果蝇X染色体上突变的检出，由于突变具有随机性和不定向性，
为了准确判断X染色体是否发生突变，宜用子代单对交配。
2、在构建重组质粒时，使用两种酶切出不同黏性末端有利于目的基因正向插入。
【详解】（1）根据题意，Muller-5技术常用于果蝇X染色体上突变的检出，由于突变具有随机性和不定向
性，为了准确判断X染色体是否发生突变，F 代需进行单对交配获得F 代。假设控制棒眼/圆眼和红色
1 2
眼/杏色眼的相关基因用A/a、B/b表示，则图中亲本基因组合为XAbXAb×XaBY，F 基因型为XAbXaB、XAbY，
1
F 雌雄交配，F 基因型为XAbXAb、XAbXaB、XAbY、XaBY,已知有某纯合致死突变基因被检出，则XaBY个体
1 2
死亡，则在F 代中，最好选取性状为棒眼红眼雌（XAbXaB）果蝇进一步研究该突变基因的作用。
2
（2）在进行PCR扩增时，PCR反应体系中需添加引物、耐热DNA聚合酶、DNA模板、四种脱氧核糖核
苷酸（dNTP）和缓冲溶液。若在8bp缺失型的DNA样本中同时加入四条引物进行PCR扩增，实验结束后
应使用琼脂糖凝胶电泳技术对产物进行检测，根据题意如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用耐热
DNA聚合酶无法延伸，引物3的碱基能够与8bp缺失型右端序列完全互补配对，即引物1和引物3组合能
成功扩增，而引物2的3'端碱基不能与8bp缺失型另一条链互补配对，无法延伸，无论EXON7区是否缺失
或者替换，引物1和引物4都能够成功扩增，所以理论上可以得到2种序列不同的DNA片段。
（3）根据目的基因两端的粘性末端可知，初步可以选出BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和Bgl Ⅱ，当选择Hind Ⅲ和Bgl
Ⅱ时，无法判断受体细胞中的质粒是否插入目的基因，而选择BamH Ⅰ和Hind Ⅲ时，GFP基因被破坏，无
法发出绿色荧光，可以通过荧光有无判断受体细胞中的质粒是否插入目的基因，故应使用BamH Ⅰ和Hind
Ⅲ对质粒S进行酶切。将重组质粒通过转化导入亮氨酸合成缺陷细菌后，由于重组质粒含有亮氨酸合成基
因，应使用不添加亮氨酸的选择培养基，又因为GFP基因被破坏，无法发出绿色荧光，应挑取没有绿色荧
光的菌落进行进一步鉴定。
11．人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶
性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题：
注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，
只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。
(1)图示hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并
保证连接的方向性，可在其两端添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷
酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序
列是5＇ -3＇。
(2)图示 hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。从生产控制的角度分析，选用
AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。
(3)阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌 的特点，从而实现重组DNA的扩增，然后在含有
的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。
(4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （a.氨苄青霉素
b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此
菌株扩大培养后，离心取上清液，依据 原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ
基因得以表达。
【答案】(1) XhoⅠ、Mum Ⅰ CTCGAGCCTTTCAGCT
(2) 有利于hCGβ进入内质网加工 可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因
表达
(3) 繁殖快，易培养、遗传物质少 氨苄青霉素
(4) a、b 抗原和抗体特异性结合
【分析】图中Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的
重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。
【详解】（1）hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身
环化并保证连接的方向性，可在其两端添加限制酶识别序列，Sma Ⅰ会破坏目的基因，不能添加Sma Ⅰ识别序列；EcoR Ⅰ会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因（标记基因），不能添加EcoR Ⅰ识别序列；Sal Ⅰ会
破坏质粒上的组氨酸合成酶基因，不能添加Sal Ⅰ识别序列；Xho Ⅰ识别序列与Sma Ⅰ识别序列相似，会破
坏目的基因，不能添加Sal Ⅰ识别序列。因此，在hCGβ基因两端应添加XhoⅠ、Mum Ⅰ限制酶识别序列。
根据转录方向和质粒AOX1启动子位置确定，在①处插入了Xho Ⅰ的识别序列CTCGAG，则①处的碱基序
列为5＇-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3＇，互补链中，碱基序列为3＇-GAGCTCGGAAAGTCGAGT -5＇,
对其设计引物序列为5＇-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3＇，由于经实验得知该基因扩增引物长度为10个核
苷酸时特异性强、效率高，加上Xho Ⅰ的识别序列CTCGAG，总共16个碱基，因此设计该端对应引物的序
列是5＇-CTCGAGCCTTTCAGCT-3＇。
（2）甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构
建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外。AOXⅠ为甲醇氧化酶基因
的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以
通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成。
（3）由于线性质粒上含有氨苄青霉素基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应
在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
（4）由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含
有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨
苄青霉素（即a和b），但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。 hCGβ是一种分
泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取
上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测，即抗原—抗体杂交法，原理为抗原与
抗体特异性结合。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因在酵母菌细胞中得到表
达，并能分泌到细胞外。
