文档内容
押辽宁卷非选择题（黑龙江、吉林适用）
押第 25 题 生物技术与工程模块
押题探究：题号定位、考点押题，高效冲刺
解题秘籍：传统发酵食品的制作+微生物的利用+细胞工程+胚胎工程+基因工程
真题回顾：回顾历年真题，循规探秘，临考提升
押题冲关：临考必刷，高效抢分
核心考点 考情统计 押题预测 备考策略
1发酵技术及微生物培养。
1.发酵技术、细胞工程、胚胎工程的 2.植物组织培养和植物体细
命题多以选择题呈现，基因工程的命 胞杂交技术。3.动物细胞工
2023·辽宁卷25
2022·辽宁卷24
题多以简答题呈现。 程。4.胚胎工程的理论基础
发酵工程、
2021·辽宁卷24
2.试题情境以下列几种居多：(1)以单 及应用。5.基因工程的基本
生物工程 2024九省联考东三省 克隆抗体为情境考查细胞工程。 工具、操作程序及应用。
25 (2)以胚胎移植为情境考查胚胎工程。 6.DNA的粗提取与鉴定。
(3)最新的文献资料为情境考查基因工 7.DNA片段的扩增及电泳鉴
程。 定。8.蛋白质工程。9.生物
技术的安全性与伦理问题。
1．传统发酵食品的制作
(1)果酒制作的三个方面
①菌种来源：酒精发酵的菌种来自附着在果皮上的野生酵母菌。
②发酵原理：酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸并进行大量繁殖，在无氧条件下进行无氧呼吸产生酒精。③酒精的检测：在酸性条件下，重铬酸钾可与酒精反应呈现灰绿色。
(2)果醋的制作原理：醋酸发酵是需氧发酵，需要不断通入无菌空气。
(3)泡菜制作
①菌种来源：制作泡菜的菌种主要来自植物体表面的天然的乳酸菌。
②发酵原理：乳酸菌在无氧条件下能将葡萄糖分解成乳酸。
2．微生物的利用
(1)培养基
①培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
②培养基的营养成分：培养基可为微生物提供碳源、氮源、无机盐和水等主要营养物质。
(2)无菌技术
①措施：无菌技术的主要措施包括消毒和灭菌。
②常用方法：培养基灭菌常采用湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法，接种环灭菌常采用灼烧灭菌法。
(3)微生物的纯化与计数
①纯化微生物的方法：常用平板划线法和稀释涂布平板法。
②微生物的计数方法：常用显微镜直接计数法和稀释涂布平板法。
(4)微生物的筛选
①尿素分解菌的筛选：以尿素为唯一氮源的选择培养基可以筛选能分解尿素的细菌。
②尿素分解菌的鉴别：在以尿素为唯一氮源的选择培养基中添加酚红指示剂，可以鉴别分解尿素的细菌。
3．发酵工程的基本环节
选育菌种→扩大培养→配制培养基→灭菌→接种→发酵罐内发酵→分离、提纯产物→获得产品。
4．植物细胞工程——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根
的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。
5．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
(1)原生质体融合成功的标志是再生出细胞壁。植物体细胞杂交完成的标志是培育出杂种植株。
(2)植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，这样不仅能为原生质体
提供营养，还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。
6．动物细胞培养(以贴壁细胞为例)——原理：细胞增殖
(1)动物细胞培养过程
①保障无菌、无毒的措施：对培养液和培养用具进行灭菌处理以及在无菌条件下进行操作，定期更换
培养液。
②动物细胞培养所需气体主要有O 和CO。O 是细胞代谢所必需的，CO 的主要作用是维持培养液的pH。在
2 2 2 2
进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO 的混合气体的CO 培
2 2
养箱中进行培养。
③动物细胞培养过程中两次使用胰蛋白酶的作用不同。第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；
第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞。④区分原代培养和传代培养的关键：是否分瓶培养。
(2)干细胞
诱导多能干细胞(iPS细
比较项目 胚胎干细胞(ES细胞) 成体干细胞
胞)
由高度分化的组织细胞诱
来源 早期胚胎 成体组织或器官内
导形成
具有分化为成年动物体
具有组织特异性，只能 类似胚胎干细胞；诱导过
内的任何一种类型的细
分化成特定的细胞或组 程无须破坏胚胎，理论上
特点 胞，并进一步形成机体
织，不具有发育成完整 可以避免免疫排斥反应，
的所有组织和器官甚至
个体的能力 应用前景更广泛
个体的潜能
7．卵裂期胚胎发育过程中物质和体积变化的规律
(1)有机物：胚胎没有和母体建立联系，不能从母体获取有机物，而呼吸消耗一直进行，因此有机物总量
减少。
(2)细胞数目和体积：胚胎总体积不增加，但细胞数目增多，每个细胞体积减小。
(3)细胞中DNA含量：伴随细胞分裂，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中核DNA含量保持相对
稳定。
8.胚胎移植中的四个注意点
第一次：用孕激素对受、供体进行同期发情处理；
两次激素使用
第二次：用促性腺激素处理使供体超数排卵
第一次：对收集的胚胎进行检查；
两次检查
第二次：对受体母畜是否妊娠进行检查
牛、羊要培养到桑葚胚或囊胚阶段；
移植时间不同 小鼠、家兔培养到桑葚胚前；
几乎所有动物都不能培养到原肠胚阶段再移植
胚胎由受精卵形成，属于有性繁殖；
繁殖方式
胚胎由核移植或胚胎分割形成，属于无性繁殖
9．PCR
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
(3)扩增过程
过程 说明 图解
变性 温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过
复性
碱基互补配对与两条单链DNA结合
温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种
脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作
延伸
用下，根据碱基互补配对原则合成新的
DNA链
(4)PCR过程的两点提醒
①复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两
条链的结合。
②PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA
片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
10．蛋白质工程
(1)目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
(2)操作手段：改造或合成基因。
(3)设计流程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变
相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
11．DNA的粗提取与鉴定的注意事项
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
可选用鸡血细胞作为材料。
(3)鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加入物质的量浓度为 2 mol/L
的NaCl溶液；在实验组试管中加入DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看
到加入DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
12．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压
灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需
试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污
染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
1. （2023·辽宁卷25）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β−淀粉酶基因，并将改造的基因与pln23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β−淀粉酶。回答下列
问题：
（1）上述过程属于_________________工程。
（2）PCR中使用的聚合酶属于_________________（填写编号）。
① 以DNA为模板的RNA聚合酶 ② 以RNA为模板的RNA聚合酶
③ 以DNA为模板的DNA聚合酶 ④ 以RNA为模板的DNA聚合酶
（3）某天然β−淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热
性明显提升。在图1所示的β−淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_________________（填
写编号）。
（4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pln23质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_________________。
（5）目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1.5kb，将其插入BamH Ⅰ位点。用EcoR Ⅰ酶切来自
于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是
________________。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为________________kb。
（6）采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_________________反应
获得PCR的模板。
【答案】
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术
扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检
测与鉴定：（1）分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA
分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译
成蛋白质—抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）【答案】蛋白质
【解析】根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β−淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）【答案】③
【解析】PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模
板。
（3）【答案】② ③
【解析】根据β−淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩
增在内，则所用的引物是② ③ 。
（4）【答案】标记基因
【解析】作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终
止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）【答案】筛选导入目的基因的大肠杆菌；5.7
【解析】目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定
DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一
个EcoR Ⅰ酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）【答案】逆转录
【解析】转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则
需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。
2.（2022·辽宁卷24）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克
隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1所示：Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2所示：
（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是_________。用脂质体将重
组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 _________（填“双分子层中”或
“两层磷脂分子之间”）。
（2）质粒在包装细胞内组装出由_________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化
N蛋白胞外段。
（3）用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用_________酶处理，制成细胞悬液，置
于含有混合气体的_________中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行_________培
养。用_________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂
交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集_________，提取单克隆抗体。
（5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成_________，实现特异性治疗。
【答案】
（1）【答案】用于筛选病毒包装细胞 双分子层中
【解析】构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是在含有氨苄青霉素
的培养基可以筛选出病毒包装细胞，脂质体是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质
体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒
导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体双分子层中。
（2）【答案】核酸和蛋白质
【解析】质粒在包装细胞内组装出由核酸和蛋白质组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并
分离、纯化N蛋白胞外段。
（3）【答案】胰蛋白 二氧化碳培养箱
【解析】小鼠脾组织用胰蛋白酶处理，使其分散，制成细胞悬液，置于含有混合气体（95%空气和5%
二氧化碳）的二氧化碳培养箱中培养。
（4）【答案】单独 抗原—抗体 细胞培养液
【解析】用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，每个孔尽
量只接种一个杂交细胞，进行单独培养，利用抗原—抗体杂交法筛选，经体外扩大培养，收集细胞培
养液，提取单克隆抗体。
（5）【答案】ADC（抗体—药物偶联物）
【解析】利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成ADC（抗体—药物偶联物），实现特异性治疗。3. （2021·辽宁卷24）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈
癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称pℎb2基因），大小为
0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取pℎb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 _________ 过程得到cDNA，将其作为
PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。（1分）
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使pℎb2基因（该基因序
列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的pℎb2基因两端分别引入 _________ 和
_________ 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的pℎb2基因和载体进行连接时，可选用
_________ （填“E.coliDNA连接酶”或“T DNA连接酶”）。
4
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
HindⅢ A↓AGCTT EcoRI G↓AATTC
TTCGA↑A CTTAA↑G
PvitⅡ C AG↓CTG PstI CTGC↓AG
GTC↑GAC GA↑CGTC
K pnI G↓GTACC BamHI G↓GATCC
CCATG↑G CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点（3分）
（3）转化前需用CaCl 处理大肠杆菌细胞，使其处于 _________ 的生理状态，以提高转化效率。（1
2
分）
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
_________ 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中（1分）
（5）将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞
周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能
的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 _________ （填“G ”或“S”或“G /M”）期。
1 2
（1分）
（1）【答案】逆转录
【解析】利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。
（2）【答案】EcoRI PvitⅡ T DNA连接酶
4
【解析】根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两
者之间存在于三种限制酶切点，但是由于K pnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI和
PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载
体时，应该用T DNA连接酶连接质粒和目的基因。
4
（3）【答案】感受态
【解析】转化时用CaCl 处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
2
（4）【答案】3
【解析】由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了
目的基因和质粒，如果用EcoRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条
条带，由于pℎb2基因大小为0.9kb，所以对应电泳图是菌落3。
（5）【答案】G /M
2【解析】比较图4中G 期和S期细胞减少，而G 期细胞数目明显增多，说明了G 期和S期细胞可以进入
1 2 1
G 期，而G 期的细胞没有能够完成分裂进入G 期，因此PHB2蛋白应该作用于G /M期。
2 2 1 2
4.（2024九省联考东三省25）植物在高于胞内Na+浓度的环境下，SOS3和SOS2激活位于质膜上的转运
蛋白SOS1，SOS1通过SOS信号通路与胞质内Na+结合并将其排出细胞外，维持其正常生命活动。
回答下列问题：
（1）植物利用SOS信号通路将Na+排出细胞外，这种运输方式的特点是_______________________。
（2）通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。
① 为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过_________________获得模板
DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。
② 测序表明，SOSI基因编码序列含有3444个核苷酸，其中A+T含量占53%，模板链中C含量为
26%，那么SOSl基因双链序列中G+C的含量为_________________%。
③ 构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOSI基因。序列分析发现SOSI基
因内部有XbaI的识别序列，为使载体中SOSI基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOSl基因两
端分别添加_________________两种限制酶的识别序列，将SOSI基因插入载体前，应选用
_________________两种限制酶对载体酶切。
（3）重组质粒转化水稻后，选取可发绿色荧光的植株，鉴定其抗盐能力是否增强，采取的操作是
________________________________________________。
（4）若发现水稻中过量表达SOSI基因并不能明显提高其抗盐能力，从信号通路角度分析，可能的原因是
_______________________________________________。
【答案】
【分析】转运蛋白可以分为载体蛋白和通道蛋白两种类型：
（1）载体蛋白只容许与自身结合部位相适应的分子或离子通过而且每次转运时都会发生自身构象的改
变；
（2）通道蛋白只容许与自身通道的直径和形状相适配、大小和电荷相适宜的分子或离子通过。分子或离子通过通道蛋白时，不需要与通道蛋白结合。
（1）【答案】需要能量、需要载体
【解析】由题干信息“在高于胞内Na+浓度的环境下，SOS1通过SOS信号通路与胞质内Na+结合并
将其排出细胞外”可知，植物利用SOS信号通路将Na+排出细胞外是逆浓度梯度的运输，因此运输方
式为主动运输，特点是需要转运蛋白，需要能量。
（2）【答案】逆转录 47 Spe Ⅰ、EcoR Ⅰ Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ
【解析】① 为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过逆转录获得模板DNA，
再经PCR获得SOSI基因片段。
②SOSI基因编码序列中A+T含量占53%，则G+C含量为47%。
③ 由图可知，荧光蛋白基因内部存在Spe Ⅰ和BamH Ⅰ两种限制酶切序列，因此对载体酶切时不能
选择这两种酶，并且不能选择限制酶Sma Ⅰ，否者会导致载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因不能
正确表达，故选择Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶对载体酶切，由于SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序
列，故不能选择限制酶XbaⅠ对目的基因酶切，但需要目的基因有与载体相同的黏性末端，故可在
SOSⅠ基因两端分别添加Spe Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶两种限制酶的识别序列。
（3）【答案】将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na+浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况。
【解析】鉴定水稻抗盐能力是否增强，采取的操作是将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na 浓
⁺
度的环境下，观察两种水稻的生长状况。
（4）【答案】过量表达SOSⅠ基因使转运蛋白SOS1含量增多，SOS1通过SOS信号通路将胞质内的
Na+过多地排出细胞外，影响细胞本身对Na+的利用
【解析】过量表达SOSⅠ基因使转运蛋白SOS1含量增多，SOS1通过SOS信号通路与胞质内的Na
⁺
过多地排出细胞外，影响细胞本身对Na+的利用。
1.工业上所说的发酵是指微生物在有氧或无氧条件下通过分解与合成代谢将某些原料物质转化为特定产品
的过程。利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如图。回答下列问题:
(1)米曲霉发酵过程中,加入大豆、小麦和麦麸可以为米曲霉的生长提供营养物质,大豆中的
可为米曲霉的生长提供氮源,小麦中的淀粉可为米曲霉的生长提供 。
(2)米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖,大量分泌制作酱油过程所需的酶类,这些酶中的
、 能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分,如将蛋白质分解为小分
子的肽和 。米曲霉发酵过程需要提供营养物质、通入空气并搅拌,由此可以判断米曲霉属于
(填“自养厌氧”“异养厌氧”或“异养好氧”)微生物。
(3)在发酵池发酵阶段添加的乳酸菌属于 (填“真核生物”或“原核生物”);添加的酵母菌在无氧
条件下分解葡萄糖的产物是 。在该阶段抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素,据图分
析该阶段中可以抑制杂菌生长的物质是 (答出1点即可)。
答案 (1)蛋白质 碳源 (2)蛋白酶 脂肪酶 氨基酸 异养好氧 (3)原核生物 乙醇和CO 食盐
2
解析 (1)微生物培养基成分一般包括碳源、氮源、无机盐、水、生长因子等。含有氮元素且能被微生物
利用的物质称为氮源,大豆中的蛋白质可为米曲霉的生长提供氮源,含有碳元素且能被微生物所利用的物质
称为碳源,小麦中的淀粉属于多糖,含有C、H、O,可为米曲霉的生长提供碳源。(2)蛋白酶可将大分子的蛋
白质分解成小分子的肽和氨基酸,脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。米曲霉发酵过程需提供营养物质,
需要通入空气并搅拌,故米曲霉的代谢类型为异养好氧型。(3)乳酸菌属于细菌,为原核生物。酵母菌为异
养兼性厌氧型生物,在无氧条件下分解葡萄糖可生成乙醇和CO 。发酵过程中加入的食盐可以抑制杂菌的生
2
长。
2.黄酒源于中国,与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外,也产生不利
于人体健康的氨基甲酸乙酯(EC)。EC主要由尿素与乙醇反应形成,各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。
回答下列问题:
(1)某黄酒酿制工艺流程如图所示,图中加入的菌种a是 ,工艺b是 (填“消毒”或“灭
菌”),采用工艺b的目的是 。
(2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂,根据颜色变化,可以初步鉴定分解尿素的细菌。
尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素,脲酶固定化后稳定性和利用效率提高,固定化方法有
(答出两种即可)。
(3)研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌 L,在不同条件下分批发酵生产脲酶,结果如图所示。推测是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素,理由是 。
(4)某公司开发了一种新的黄酒产品,发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路
。
答案 (1)酵母菌 消毒 杀死黄酒中的大多微生物,延长保存期 (2)酚红 化学结合法、物理吸附法
(3)培养pH pH约为6.5时脲酶活力最高 (4)在发酵酒的酿造过程中添加适量尿素分解菌,其产生的脲酶
分解尿素,抑制尿素与乙醇反应生成EC,从而降低EC含量
解析 (1)酒精发酵所需菌种为酵母菌。黄酒富含微生物生长所需的多种营养成分,灌装时容易造成杂菌污
染,因此需要进行消毒处理,以延长保存期。(2)脲酶催化尿素分解产生氨,使pH升高,酚红指示剂变红。常
用的固定化技术有化学结合法、物理吸附法和包埋法,固定化酶一般采用前两种方法,固定化细胞一般采用
包埋法。(3)两图中脲酶活力最高点均为pH约为6.5时,这说明培养pH是决定工程菌L高脲酶活性的关键
因素。(4)在发酵酒的酿造过程中添加适量尿素分解菌,其产生的脲酶分解尿素,抑制尿素与乙醇反应生成
EC,从而降低EC含量。
3.番茄灰霉病菌严重影响番茄生产,枯草芽孢杆菌可以产生对多种病原菌具有抑制作用的蛋白质。为探究
枯草芽孢杆菌能否用于番茄灰霉病的生物防治,研究者设计了相关实验。
回答下列问题:
(1)检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用时,取适量 菌液涂布于固体培养基上,
将无菌滤纸片(直径5 mm)在 菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心,数秒后取出滤纸片,培
养皿倒置培养后测量 大小以判定抑菌效果。
(2)枯草芽孢杆菌为好氧微生物,液体培养时应采用 (填“静置”或“摇床震荡”)培养。培养过
程中抽样检测活菌数量时,应采用 (填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”),其原因是 。
(3)电泳分离蛋白质混合样品的原理是 。利用SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳测定枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白分子量时,SDS的作用是
。
(4)枯草芽孢杆菌长期保藏时,常以其 作为保藏对象。
答案 (1)番茄灰霉病菌 枯草芽孢杆菌 抑菌圈 (2)摇床震(振)荡 稀释涂布平板法 用稀释涂布平板
法在培养基上看到的每一个单菌落都来自一个活细胞,而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计
算在内 (3)利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生
不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离 消除净电荷对迁移率的影响;使蛋白质发生完全变性
(4)菌液
解析 (1)检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用时,应将适量番茄灰霉病菌菌液均匀涂布于固体培
养基上,再把用枯草芽孢杆菌菌液浸泡后的无菌滤纸片覆盖于固体培养基中心,数秒后取出滤纸片,培养皿
倒置培养后测量抑菌圈大小以判定抑菌效果。(2)枯草芽孢杆菌为好氧微生物,摇床振荡培养既可以增加培
养液中溶解氧的含量,又增大了菌种和营养物质的接触面积,有利于枯草芽孢杆菌的增殖。培养过程中抽样
检测活菌数量时,应采用稀释涂布平板法,其原因是使用稀释涂布平板法,培养基上生长的每一个单菌落都
来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计菌落数,可得出样品中大约含多少活菌。而显微镜直接计数法会
将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内,影响结果的准确性。(3)根据不同蛋白质分子带电性质的差异及分子本
身的大小、形状等不同,电泳时蛋白质分子可产生不同的迁移速度,利用这一原理,可以分离蛋白质混合样
品。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定抗菌蛋白分子量时,SDS的作用是消除蛋白质所带净电荷对迁移率的
影响,同时能使蛋白质发生完全变性,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。(4)长期保藏菌种常用甘油管
冷冻保藏法,该方法是将培养的菌液转移到灭菌后的甘油中,与甘油充分混匀后,放在-20 ℃的冷冻箱中保
存。故枯草芽孢杆菌长期保藏时,常以其菌液作为保藏对象。
4.番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的,具有较强的侵染力和破坏力。番茄青枯病可通过以根际促生菌作
为拮抗微生物抵御青枯雷尔氏菌进行生物防治。因此,发掘新的能高效拮抗青枯病病原菌的促生微生物具
有重要意义。回答下列问题。
(1)进行样本采集及拮抗细菌菌株分离纯化时,应采集某地番茄青枯病发病果园中 (填“健康”
或 “ 患 病 ” ) 植 株 根 际 土 壤 , 在 番 茄 青 枯 病 发 病 果 园 中 取 样 的 原 因 是
。先称取1 g土壤添加到盛有 的三角瓶中均匀振荡后,置于恒温水浴15 min。经分离培养后,挑
取单菌落进行划线纯化。
(2)进行拮抗细菌的分离筛选时,为比较不同根际微生物纯化菌液对青枯病病原菌的拮抗作用效果,科研人员配制了含有青枯病病原菌的平板,在含青枯病病原菌的平板上滴加 ,在相同且适宜的条
件下培养一段时间,观察并比较抑菌圈的大小,拮抗作用越强则 。
(3)通过对拮抗细菌产酶活性进行测定,筛选出4株菌株,随后进行青枯病预防实验。现有番茄幼苗、4种菌
液 、 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 液 、 无 菌 水 等 。 请 设 计 实 验 比 较 菌 株 的 预 防 效 果
(写出实验思路)。
8.海洋塑料垃圾每年造成数十万海洋动物死亡,其中聚乙烯(PE)塑料因缺乏有效降解的微生物和酶类而难
以降解,危害巨大。2021年,中科院海洋所首次发现能有效降解PE塑料的海洋微生物菌群。
(1)要获得能有效降解PE塑料的海洋微生物菌群,应选择在 的环境中去筛选。
(2)研究人员利用 法纯化降解PE塑料的微生物菌群,使其生长出单个菌落。然后根据菌落
的 (至少写出两种)等特征来进行初步区分,从中获得了3株能稳定降
解PE塑料的菌种P1、P2和P3。
(3)研究人员将红色PE塑料粉碎成粉末,均匀混合在无碳固体培养基中,之后再接种经过稀释的三种菌液,一
段时间后可测得透明圈直径大小(D)与菌圈直径大小(d)(如图所示)。如使用单一菌种进行扩大培养,应选
用 菌种,理由是 。
(4) 与 传 统 填 埋 、 焚 烧 相 比 , 该 微 生 物 菌 群 对 PE 塑 料 的 降 解 具 有
的优点。
答案 (1)沿海中富含PE塑料 (2)平板划线或稀释涂布平板 形状、大小(或颜色、隆起程度等) (3)P1
P1的D/d值最大,对PE塑料的降解效果最佳 (4)不会造成二次污染
解析 (1)要获得能有效降解PE塑料的海洋微生物菌群,应选择在沿海中富含PE塑料的环境中去筛选,这样
有利于成功筛选出目标菌种。(2)分离纯化菌种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。研究人员通常可
根据菌落的形状、大小、颜色、隆起程度等特征来初步区分不同种的微生物,其原因是在一定的培养条件
下,不同微生物表现出的菌落特征通常不同。(3)降解PE塑料的菌种能分解PE塑料使得菌落周围会出现透
明圈,在固体培养基中分离培养出降解PE塑料的菌种后,需通过测量透明圈直径大小(D)与菌圈直径大小
(d),比较它们的值以确定其降解PE塑料的能力,从而筛选出目标菌种。由图分析可知,三种菌种对PE塑料
的降解效果为P1>P3>P2,因此若使用单一菌种进行扩大培养,应选用P1。(4)填埋会造成土壤等污染,焚烧会
引起大气等污染,所以与传统填埋、焚烧相比,该微生物菌群对PE塑料的降解具有不会造成二次污染的优点。5.某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时,参照品种B的最佳激素配比(见下表)进
行预实验。
品种B组织 细胞分裂素 生长素
培养阶段 浓度(μmol/L) 浓度(μmol/L)
Ⅰ 诱导形成愈伤组织 m n
1 1
Ⅱ 诱导形成幼芽 m n
2 2
Ⅲ 诱导生根 m n
3 3
据表回答:
(1)Ⅰ阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体,原因是 。
(2)在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段中发生基因选择性表达的是 阶段。
(3)为确定品种A的Ⅰ阶段的最适细胞分裂素浓度,参照品种B的激素配比(m>2.0),以0.5 μmol/L为梯度,
1
设计5个浓度水平的实验,细胞分裂素最高浓度应设为 μmol/L。
(4)Ⅲ阶段时,科研人员分别选用浓度低于或高于n μmol/L的生长素处理品种A幼芽都能达到最佳生根效
3
果,原因是处理幼芽时,选用低浓度生长素时的处理方法为 ,选用高浓度生长素
时的处理方法为 。
(5)在 阶段用秋水仙素对材料进行处理,最易获得由单个细胞形成的多倍体。
答案 (1)细胞分化程度低,容易诱导产生愈伤组织 (2)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ (3)m+1.0 (4)浸泡法(长时间处理)
1
沾蘸法(短时间处理) (5)Ⅰ
解析 (1)在植物组织培养时,一般选茎尖、幼叶等作为外植体的原因是这些部位的细胞分化程度低,容易
诱导其脱分化形成愈伤组织。(2)细胞分化的实质是基因的选择性表达,在形成愈伤组织、幼芽、根的过程
中都有细胞分化,所以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段都发生了基因的选择性表达。(3)为了确定品种A的Ⅰ阶段细胞分裂
素的最适浓度,以品种B的激素配比为参照,m>2.0,以0.5 μmol/L为梯度设计5个浓度水平实验,即m-
1 1
1.0、m-0.5、m 、m+0.5、m+1.0,所以最高浓度为m+1.0。(4)生长素处理幼芽生根的方法有很多,比较简
1 1 1 1 1
单的两类方法是浸泡法和沾蘸法,前者是把幼芽浸泡在配好的生长素溶液中,要求生长素溶液的浓度较低;
后者是要求幼芽在浓度较高的生长素溶液中蘸一下,处理时间较短。(5)秋水仙素诱导多倍体的原理主要是
抑制纺锤体的形成,导致染色体不能移向两极,从而引起染色体数目加倍,形成多倍体。Ⅰ阶段形成愈伤组
织的过程中细胞发生了脱分化,分裂能力较强,所以更易获得多倍体。
6.以我国科学家为主的科研团队将OSNL(即4个基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A的缩写)导入黑羽鸡胚成纤
维细胞(CEFs),诱导其重编程为诱导多能干细胞(iPS),再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞(iPGCs),然后将
iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中,最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代,实验流程如图。回答下列问题。
(1)CEFs 是从孵化 9 天的黑羽鸡胚中分离获得的,为了获得单细胞悬液,鸡胚组织剪碎后需用
处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加 等天然成分,以满足细胞对某些细胞因子的需
求。
(2)体外获取OSNL的方法有 (答出1种即可)。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白,需构建
基因表达载体,载体中除含有目的基因和标记基因外,还须有启动子和 等。启动子是
识别和结合的部位,有了它才能驱动 。
(3)iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是 。
(4)诱导 iPS 细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是
。
(5)该实验流程中用到的生物技术有 (答出2点即可)。
答案 (1)胰蛋白酶、胶原蛋白酶 血清 (2)基因文库法、PCR技术、人工合成法(任答1种) 终止子
RNA聚合酶 目的基因转录出mRNA,最终表达出所需要的蛋白质 (3)基因的选择性表达 (4)诱导iPS细胞
的技术是将已分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞(iPS),再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞
(iPGCs)的技术;体细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中,使这个重新组合的
细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体的技术 (5)基因工程、动物细胞培养
解析 (1)动物细胞培养时,动物组织剪碎后需要用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理一段时间,以便获得单个细
胞。使用合成培养基培养动物细胞时,通常需要添加血清等天然成分,以满足细胞对某些细胞因子的需求。
(2)体外获取目的基因的方法有多种,如基因文库法、PCR技术、人工合成法。基因表达载体的组成包括目
的基因、标记基因、启动子、终止子等结构,启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了启动子才能驱动
目的基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。(3)iPGCs细胞是由iPS细胞增殖、分化而来的,两者在形
态、结构和功能方面不同的根本原因是基因的选择性表达。(4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术存
在明显的区别,主要表现在诱导iPS细胞的技术是将已分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞(iPS),
再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞(iPGCs)的技术;而体细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中,使这个重新组合的细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体的技术。(5)分析题意可知,
该实验流程中用到的生物技术有基因工程、动物细胞培养等技术。
7.M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验,将外源DNA片段F插入M基因的特定
位置,再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得 M基因失活的转基因克隆动物A,流程如图所示。回
答下列问题:
(1)在构建含有片段F的重组质粒过程中,切割质粒DNA的工具酶是 ,这类酶能将特定部位的
两个核苷酸之间的 断开。
(2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时,需要定期更换培养液,目的是
。
(3)与胚胎细胞核移植技术相比,体细胞核移植技术的成功率更低,原因是 。
从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞,在形态上表现为 (答出两点即可),功能上具有
。
(4)鉴定转基因动物:以免疫小鼠的 淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合,筛选融合杂种细胞,制备M蛋
白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活的实验思路 。
答案 (1)限制酶(限制性核酸内切酶) 磷酸二酯键 (2)清除代谢产物,防止细胞代谢产物积累对细胞自
身造成危害 (3)体细胞分化程度高,恢复其全能性十分困难 细胞体积小,细胞核大,核仁明显 发育的全
能性 (4)B 提取此克隆动物的肝脏蛋白,作为抗原,与M蛋白的单克隆抗体进行抗原—抗体杂交,若未出现
杂交带,证明M基因已失活
解析 (1)限制酶识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸间的
磷酸二酯键断开。(2)动物细胞体外培养需要无菌、无毒等适宜环境,因此动物细胞培养的培养液及所有培
养用具使用前应进行无菌处理;通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。此外,
应定期更换培养液,以便清除代谢产物,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。(3)哺乳动物核移植分为
胚胎细胞核移植和体细胞核移植,其中胚胎细胞核移植较易成功,因为与胚胎细胞相比,动物体细胞分化程
度高,恢复其全能性十分困难。胚胎干细胞简称ES细胞,是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。
ES细胞具有胚胎细胞的特性,在形态上表现为体积小、细胞核大、核仁明显;在功能上具有发育的全能性。
(4)制备单克隆抗体时,应将从免疫小鼠中得到的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并筛选出可大量产生M蛋白抗体的杂交瘤细胞。为确定克隆动物A中M基因是否失活,可利用抗原—抗体特异性结合的原理,将制备的
M蛋白的单克隆抗体与转基因动物肝脏中提取的蛋白质混合,观察是否产生杂交带,若未出现杂交带,说明M
基因已失活。
8.科学家通过转基因技术获得了含有人生长激素基因的奶牛,要加速转基因奶牛的繁育,可以对此转基因奶
牛进行克隆(如图),请结合图示回答下列问题:
(1)通常用幼龄或早期胚胎进行动物细胞培养,原因是 ;在进行细胞培养时,要对取自
转基因奶牛的组织细胞进行分散处理,形成单个细胞,这个过程中可利用 酶处理。
(2)在对转基因奶牛细胞进行性别鉴定时最有效的方法是SRY-PCR法,该方法用牛Y染色体上的性别决定基
因SRY作为特异性探针来检测PCR扩增产物,检测方法为 技术,此过程需要设计引物,引物的作
用是 。
(3)将重组细胞在培养液中培养成的重构胚移入受体母牛后,该母牛生出的犊牛与供体奶牛相比并不是100%
的复制,原因可能是 。
(4)上述转基因奶牛的克隆成功,说明了动物 具有全能性。
答案 (1)细胞分裂能力强 胰蛋白酶或胶原蛋白 (2)分子杂交 与DNA母链通过碱基互补配对结合后,使
耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (3)生物性状受细胞核基因和细胞质基因的
共同控制;生物的性状还受环境因素的影响 (4)体细胞的细胞核
解析 (1)通常用幼龄或早期胚胎进行动物细胞培养,原因是这类细胞的分化程度低,分裂能力强;将组织细
胞分散成单个细胞可利用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。(2)由“该方法用牛Y染色体上的性别决定基因SRY
作为特异性探针来检测PCR扩增产物”,可知是通过碱基互补配对来检测有无相应的杂交带,检测方法为
DNA分子杂交技术,此过程需要设计引物,引物的作用是与DNA母链通过碱基互补配对结合后,使耐高温的
DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。(3)由于生物的性状受细胞核基因和细胞质基因共同控
制以及生物的性状还受环境因素的影响,因此重构胚移入受体母牛后,该母牛会生出与供体奶牛遗传物质基
本相同的犊牛,但也不是100%的复制。(4)转基因奶牛的克隆成功,说明了动物体细胞的细胞核具有全能性。
9.为进一步优化生育政策,我国现实施一对夫妻可以生育三个子女的政策。目前,我国每年试管婴儿数量逾
20万例次。如图为试管婴儿的培育过程示意图。回答下列问题:
(1)常用 激素刺激排卵。试管婴儿涉及的生物工程技术主要有
(答出两点即可)。
(2)胚胎在植入前会进行基因检测,需利用PCR技术扩增DNA。PCR技术需使用的酶是 ,引物
的作用是 。若要筛查血友病基因,则该基因探针的设计方法是
。
(3)胚胎在植入前还要进行染色体检查,请分析该技术对人口优生的益处与对性别比例的潜在影响:①对优
生的益处是 ;②对性别比例的潜在影响是 。(列出一点即可)
答案 (1)促性腺 体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植 (2)Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶) 在
含有血友病基因的DNA片段上用放射性同位素标记 (3)规避染色体病 可能用于选择胎儿性别
解析 (1)试管婴儿是通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精并通过培养发育为早期胚胎后,
再经移植产生后代,可见试管婴儿涉及的技术主要包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植技术;常用促性
腺激素刺激排卵。(2)PCR技术需使用的酶是Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶),引物的作用是与DNA母
链通过碱基互补配对结合后,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸;基因探针是指
一段带有检测标记,且顺序已知的、与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA),所以若要筛查血友病基因,则
该基因探针的设计方法是在含有血友病基因的DNA片段上用放射性同位素标记。(3)根据染色体检查可以规
避染色体病,预防患儿的出现,同时也可检测出性别,可能用于选择胎儿性别。
10.人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的
表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。
科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定
BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,
在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本
实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋
白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因
是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物
的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点
序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是
。
答案 (1)SalⅠ EcoRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4
与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位
点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位
点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的
区段上
解析 (1)观察图示可知,荧光蛋白基因的左侧为终止子,为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白
基因表达,扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧,而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切割位点,
分别是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ的切割位点,但因为用EcoRⅠ会破坏荧光蛋白基因,所以只能用MunⅠ和
XhoⅠ切割载体,切割后载体的部分序列如图所示:扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的 DNA片段能够替换上图载体中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位
点之间的片段,并能与左侧的荧光蛋白基因片段及右侧的片段连接起来。由题图中终止子及基因的位置可
知,F1~F7末端添加序列后应与XhoⅠ切割的末端相连,R末端添加序列后应与MunⅠ切割的末端相连。由于
调控序列及启动子中有XhoⅠ限制酶切割位点,所以需寻找切割后的末端能与XhoⅠ限制酶切割后的末端连
接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,SalⅠ符合这一要求,所以在F1~F7末端添加的序列所对
应的限制酶是SalⅠ;由于调控序列及启动子中含有 MunⅠ的切割位点,所以需寻找切割后的末端能与
MunⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,EcoRⅠ符合这一要求,所以
在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ。扩增后的产物的两端添加的限制酶识别序列如图所示:
本实验中,用EcoRⅠ和SalⅠ切割扩增产物,用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,故从产物扩增到载体构建完成的
整个过程需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA连接酶共6种酶。(2)将构建的载体导入除去
BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,说明
F1~F6与R扩增产物含完整的启动子,荧光蛋白基因表达;含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光,说明F7与
R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素,雌激素能诱导P发
挥作用,使BCL11A基因表达。构建的载体含有BCL11A基因,导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。
含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,说明F1~F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调
控启动子,荧光蛋白基因不表达),因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);而含F5~F6与R扩增
产物的受体细胞仍有荧光,说明F5~F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白的结合位点(荧光蛋白基因能表达),
由此可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所
对应序列之间的区段上。11.“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,
有研究者以某些工业废气(含CO 等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,
2
构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对 ,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到
目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。
该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是 ,
终止子的作用是 。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是
,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了 ,体现了循环经济特点。从“碳中和”
的角度看,该技术的优势在于 ,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案 (1)引物 (2)便于筛选含有目的基因的受体细胞 使转录在所需要的地方停下来 (3)酶蛋白的大
量合成消耗了大量物质和能量 (4)废弃物的资源化 减少了碳排放
解析 (1)利用PCR技术扩增目的基因的前提是已知目的基因两端的核苷酸序列,根据这一序列设计并合成
一对引物。(2)抗生素抗性基因作为标记基因,作用是鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的
基因的受体细胞筛选出来。终止子相当于一盏红色信号灯,位于基因的下游,可使转录在所需要的地方停下
来。(3)酶蛋白的大量合成消耗大量的物质和能量,导致重组梭菌用于自身生长、繁殖的物质和能量减少,
菌体生长迟缓。(4)该技术使一个系统产出的污染物,能够成为本系统或另一个系统的生产原料,从而实现
了废弃物的资源化。从“碳中和”的角度看,该技术减少了碳排放。
12.水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。
拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,
合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、
和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所
示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致
其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写
出实验设计思路 。
答案 (1)多肽链 mRNA mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成
DNA半保留复制 (3)种类 酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同 (4)在相同条件下,
将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固
所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大
解析 (1)蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸
序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由于mRNA上决
定氨基酸的密码子具有简并性,因此mRNA不同,翻译形成的多肽链中氨基酸序列有可能是相同的,再盘曲、
折叠形成相同结构的蛋白质。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、人工合成和
利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的原理是DNA半保留复制。(3)由图可知,水蛭蛋白经两种蛋白酶处理后,
酶解产物的肽含量差别不大,但是抗凝血活性有所差异,所以推测该差异主要与肽的种类有关,两种处理后
酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同,从而导致两种处理后抗凝血活性有差异。(4)在相同条件
下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大。
13.纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要
意义。请回答下列问题。
图Ⅰ
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,
中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与
产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加
NaCl至2.0 mol/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的
端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指
示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位
点插入片段)。请完成下表。
图Ⅱ图Ⅲ
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M ①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整
检测融合蛋白定位
个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。
采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,
健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,
在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
答案 (1)脂质和蛋白质 发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合
酶) 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④蛋白X定位于纤毛基部 (4)逆转录 32
解析 (1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝
分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度
的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA
聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚合酶提供3'-OH,使该酶能够从引物的
3'端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子
条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正
确连接,则上游连接处含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,即5'…AAGCTT…GATATC…3',即Q4,下游含有EcoR
Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,即5'…GATATC…GGATCC…3',即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧
光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对
照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,
可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧
光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量
相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并
不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,
x×215=y×220,PCR 扩 增 20 个 循 环 的 产 物 中 , 健 康 人 样 品 的 目 的 产 物 大 约 是 病 人 的
(x×220)÷(y×220)=(x×220)÷(x×215)=25=32倍。
知识拓展 在基因工程中常用绿色荧光蛋白基因作为标记基因或报告基因,用以检测目的基因是否完成表
达,同时也可以检测目的蛋白在细胞中的分布及含量。
14.蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白
酶抑制剂(StPin1A)的基因单独或共同转化棉花,获得了转基因植株。
回答下列问题:
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入质粒的 上,此方法的不足之处是
。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译 ,可采用的检测技术有
(写出两点即可)。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后,还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。图为三种
不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果,据结果分析 (填“NaPI”或“StPin1A”或
“NaPI+StPin1A”)转基因棉花的抗虫效果最佳,其原因是 。(6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生 ,导致昆虫
朝着一定的方向不断进化。据此推测,被蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗蛋白酶抑
制 剂 的 能 力 , 其 分 子 机 制 可 能 是
(写出两点即可)。
答案 (1)抑制害虫胰蛋白酶活性,从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的 (2)基因表达载体的构
建 (3)T-DNA 该方法一般不适用于单子叶植物 (4)PCR技术、抗原—抗体杂交技术 (5)接种试验
NaPI+StPin1A NaPI+StPin1A的转基因棉花的虫体质量最低且每株棉铃数最多 (6)定向改变 昆虫在胰
蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力;昆虫的胰蛋白酶
基因发生突变,原有的胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用
解析 (1)蛋白酶抑制剂可与害虫消化道内的蛋白酶结合形成复合物,从而阻断或降低蛋白酶的活性,使昆
虫不能正常消化食物中的蛋白质,从而达到抗虫的目的。(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建。(3)
农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,可将Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞,并将其整合到受
体细胞的染色体DNA上。故利用农杆菌转化法时,需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上。但农杆菌一般只
感染双子叶植物和裸子植物,故其不足之处是该方法一般不适用于单子叶植物。(4)在分子水平上可通过
PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞染色体DNA上或检测目的基因是否转录出了mRNA;是否翻译出相应
的蛋白质则需要使用抗原—抗体杂交技术。(5)抗虫基因导入植物细胞后,要鉴定其是否赋予植物抗虫特性,
需要做抗虫接种试验。题图中,NaPI+StPin1A转基因棉花的虫体质量最低,每株棉铃数最多,故其抗虫效果
最佳。(6)昆虫种群本来就存在抗虫性强或弱的变异,在抗虫剂(蛋白酶抑制剂)的选择作用下,昆虫种群的
基因频率会发生定向改变,使昆虫朝着一定的方向不断进化。蛋白酶抑制剂通过与害虫消化道内的蛋白酶结合使害虫不能消化蛋白质而死亡。昆虫具有抗胰蛋白酶抑制剂的能力可能是因为昆虫的胰蛋白酶发生突
变,产生一种新胰蛋白酶,其不能与原有的胰蛋白酶抑制剂结合,使原有胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用;也可
能是昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力。
15.非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核
心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(图13),可直接用淀
粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。
图13
回答下列问题:
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有
。 (答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方
法有 。
(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化
大肠杆菌时,首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有
。
(4)依图13所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若
这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是 。在分子水平上,可以通过改
变 ,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。
答案 (1)从基因文库中获取、用化学方法人工合成 (2)蛋白酶水解法、盐析法、60~75 ℃恒温水浴法
(3)感受态 抗原—抗体杂交 (4)部分酶失活,无法获得肌醇 基因结构
解析 (1)目前获取目的基因常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、用化学方法人工合成等。
(2)制备高质量DNA模板时,可直接在滤液中加入蛋白酶分解蛋白质,而不破坏DNA。中性盐对蛋白质的溶解
度有显著影响,当盐浓度较高时,蛋白质的溶解度下降并析出,这种现象称为盐析。利用DNA对高温的耐受性,
严格控制温度范围,使蛋白质变性沉淀而DNA分子不发生变性,可将DNA与蛋白质分离。(3)将表达载体导入
大肠杆菌细胞最常用的转化方法是首先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。然后将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促
进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。为了检测目的基因是否表达出相关的酶蛋白,可以从转基因生
物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已表达出蛋白质产品。
(4)酶的作用条件较温和,在温度过高、过酸、过碱的环境中会失活,不同酶的最适温度、最适pH一般不同,
将4种酶放在同一体系中,控制温度、pH等条件一致,则部分酶可能会因温度或者pH不适宜而失活,不能达
到实验目的,即无法获得肌醇。基因指导蛋白质的合成,可以通过改造酶基因的结构,从而改变蛋白质的结
构,进而实现对酶特性的改造和优化。
16.环境中常检出残留的四环素类抗生素,科学家采用基因工程技术构建出一种能高效降解四环素的基因工
程菌,如图所示。将四环素降解酶基因tetX经过PCR扩增后,与经过酶切的质粒pET28a融合,构建重组质粒
并导入大肠杆菌BL21,筛选后得到工程菌ETD-1,ETD-1可通过发酵工程大量生产四环素降解酶并应用于生
产实践。SapⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、NdeⅠ是几种不同的限制酶。回答下列问题:
(1)利用PCR技术扩增tetX基因需要设计引物,引物的作用是 ;若扩增n次,需要的引物数量至
少是 。
(2)图中pET28a的启动子和终止子的作用分别是 。
(3)为了将tetX基因准确地整合到质粒的插入位点,在对tetX基因进行扩增时,需在A、B两端引入限制酶
的识别序列,原因是 。
(4)将重组质粒导入大肠杆菌之前,需要用一定浓度的Ca2+处理大肠杆菌BL21,使细胞处于 。筛选
工程菌ETD-1的培养基中需加入的抗生素是 。
答案 (1)使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 2n+1-2 (2)RNA聚合酶的识别和
结合位点,驱动tetX基因的转录;使转录在需要的地方停下来 (3)BamHⅠ、NdeⅠ 在tetX基因的两端引
入这两种酶的酶切位点,不会破坏tetX基因本身的碱基序列,同时引入这两种酶的酶切位点可以使tetX基
因定向插入启动子和终止子之间 (4)感受态 卡那霉素
解析 (1)PCR过程中引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA的复
制是半保留复制,扩增过程中引物的数量和子链的数量是相同的,因此若扩增n次,需要引物的数量是2n+1-2个。(2)质粒上的启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点,作用是启动转录过程,终止子的作用是终止转录过
程。(3)为了将tetX基因准确地整合到质粒的插入位点,在对tetX基因进行扩增时,需在A、B两端引入限
制酶BamH Ⅰ、Nde Ⅰ的识别序列,其原因是Sap Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶会破坏目的基因,且BamH Ⅰ和Nde
Ⅰ位于启动子和终止子之间。(4)一定浓度的Ca2+处理大肠杆菌BL21的目的是使细胞处于感受态,使重组质
粒更容易进入。重组质粒上的卡那霉素抗性基因可作为标记基因,因此可以在筛选工程菌ETD-1的培养基中
加入卡那霉素以便筛选。
17.7岁的哈桑患有一种罕见皮肤疾病,他的皮肤非常脆弱,轻微摩擦就会导致皮肤破损,继而感染各种病原
微生物。医生检测发现哈桑的LAMB3基因有2个碱基对错误,导致无法表达正常的层黏连蛋白。研究团队对
哈桑进行了基因治疗,取下哈桑的一小块皮肤,在体外大量培养。然后利用逆转录病毒载体将正常的LAMB3
基因插入细胞的基因组内,筛选出成功导入目的基因的细胞后,继续培养这些细胞,形成若干块单层“人造
皮肤”,对哈桑进行皮肤移植,最后哈桑终于过上正常人的生活。
(1)哈桑经常感染各种病原微生物的原因是 。
(2)图中①表示 过程。过程②将gag、pol、env等分离后需构建重组表达载体,并将其导入小鼠胚
胎细胞。过程②④中用到的工具酶有 ,过程⑤常用的导入方法是
。
(3)天然的逆转录病毒RNA上有3组序列,A序列含有调节基因和启动子,调控病毒RNA的转移及表达;B序列
编码逆转录酶、外壳蛋白等病毒蛋白质;C序列是包装信号序列,能被病毒蛋白识别,引发病毒的组装。操作②中保留的LTR属于 序列。过程⑤中导入病毒的gag、pol、env序列的目的是 。
这种逆转录病毒载体作为一种基因表达载体,其优点是 。
答案 (1)皮肤是人体的第一道防线,可阻挡病原体入侵机体,若被破坏则各种病原微生物容易入侵人体
(2)逆转录 限制酶、DNA连接酶 显微注射法 (3)A 合成组装病毒的蛋白质 能将目的基因整合到受体
细胞染色体中,使得目的基因能够稳定存在,并能表达和遗传给子代细胞
解析 (1)皮肤是人体的第一道防线,可阻挡病原体入侵机体,若被破坏则各种病原微生物容易入侵人体,哈
桑皮肤容易破损,所以会经常感染各种病原微生物。(2)逆转录病毒的遗传物质是RNA,在构建逆转录病毒载
体时,需先获得含逆转录病毒遗传信息的cDNA,由图知,经过程①单链RNA变为了双链结构,故过程①为逆转
录;过程②和过程④涉及DNA的切割和DNA片段的连接,需要用到限制酶、DNA连接酶;将目的基因导入动物
细胞的常用方法是显微注射法。(3)构建好的逆转录载体可以让目的基因插入宿主细胞的染色体中,并且正
常表达,据题干可知A序列含有调节基因和启动子,调控病毒RNA的转移及表达,故需要将目的基因插入A序
列之间,题图中目的基因位于两个LTR之间,故LTR属于A序列。经过程⑤小鼠胚胎细胞中含gag、pol、env
序列,LTR及目的基因LAMB3等拼接成的序列。由图知,LTR及目的基因LAMB3等拼接成的序列可转录形成重
组病毒核酸,图中还含有病毒蛋白质,推测gag、pol、env属于B序列,可以合成组装病毒的多种蛋白质。逆
转录病毒载体与农杆菌Ti质粒的T-DNA作用类似,都能将目的基因整合到受体细胞染色体中,使得目的基因
能够稳定存在,并能表达和遗传给子代细胞。
18.2022年1月7日,美国马里兰州的医生首次将基因编辑猪的心脏移植到人类患者身上。如果异种移植可
以实现,将可明显缓解器官紧缺的问题。请回答下列问题:
(1)进行器官移植手术后,免疫系统会把来自其他人的器官当作 成分进行攻击,这就是器官移植容
易失败的原因。在免疫排斥中起主要作用的是 免疫。
(2)为了更好地减少免疫排斥反应,研究者在猪的培育过程中,进行了基因编辑。敲除了三个和人类可能会
产生排斥的基因,同时添加了6个帮助人类免疫系统接受猪心脏的基因。常用的基因编辑系统是 CRISPR/
Cas9基因编辑系统。该系统主要包含向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分:sgRNA能特异性识别特定的DNA
序列,能引导Cas9蛋白到相应位置切割DNA,最终实现对靶基因序列定点编辑。
①科学家运用基因工程删除了猪细胞中和人产生排斥的基因,添加了6个帮助人类免疫系统接受猪心脏的基
因。从变异的角度看,这种变异属于 (填“可遗传变异”或“不可遗传变异”)。
②CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”,sgRNA的识别序列越短,基因编辑的
脱靶率越高。请分析原因: 。
答案 (1)“非己”/抗原 细胞 (2)①可遗传变异 ②sgRNA的识别序列短,特异性差,容易与其他片段结
合造成编辑出错解析 (1)进行器官移植手术后,免疫系统会把来自其他人的器官当作抗原进行攻击,在免疫排斥中起主要
作用的是细胞免疫。(2)①该变异删除了某些基因,又添加了6个基因,属于可遗传变异。②CRISPR/Cas9基
因编辑技术中,sgRNA能通过碱基互补配对特异性识别特定的DNA序列,sgRNA的识别序列越短,特异性越差,
更容易与其他片段结合造成编辑出错。
19.一种天然蛋白t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓,是心梗和脑血栓的急救药,但是心梗患
者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实,将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低
其诱发出血的副作用。据此,先对天然t-PA基因的碱基序列进行改造,然后再采取传统的基因工程方法表达
该改造后的基因,可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。如图1表示相关的目的基因、载体及限制酶识别序
列和切割位点,pCLY11为质粒,请回答下列问题:
(1)可以先提取细胞的 来合成总cDNA,再从cDNA文库中获取t-PA基因。通过改造t-PA基因制造出
性能优异的改良t-PA蛋白的技术被称为 工程。
(2)若改造后的t-PA基因的黏性末端如图1所示,则需要选用限制酶 切割质粒pCLY11,保证
质粒与t-PA改良基因高效连接。再用DNA连接酶催化形成 键,构建重组质粒。
(3)以大肠杆菌作为受体细胞,在含新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株,原因是
。成功获取能生产改良t-PA蛋白的工程菌株后,利用 (填“固体”或“液体”)培养基在发酵罐中
进行大量生产。
(4)除了用工程菌株,还可以用下列方法从转基因牛乳汁中获得改良t-PA蛋白:
过程②常用的方法是 ;在过程④前需要取囊胚的 细胞做DNA分析进行性别鉴定;为
了保证t-PA改良基因能在乳腺细胞中表达,构建基因表达载体需要将其与 等调控
元件重组在一起。答案 (1)(总)RNA(或mRNA) 蛋白质 (2)Xho Ⅰ和Bgl Ⅱ 磷酸二酯 (3)导入未连目的基因的质粒(或
pCLY11或空质粒或普通质粒)的大肠杆菌也可以在这种培养基上生长 液体 (4)显微注射法 滋养层 乳
腺中特异表达的基因的启动子(或乳腺蛋白基因的启动子)
解析 (1)构建cDNA文库主要包括从组织细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA,与适当载体连接后转化宿主,这
种包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。对天然的t-PA基因进行改造,
以制造出性能优异的改良t-PA蛋白的技术称为蛋白质工程。(2)根据碱基互补配对原则,t-PA基因的左端
黏性末端为CCGG—,为Xho Ⅰ酶切得到,t-PA基因的右端黏性末端为CTAG—,为Bgl Ⅱ酶切得到,质粒需要
用相同的酶进行酶切以得到与目的基因相同的黏性末端,因此质粒pCLY11需选用限制酶Xho Ⅰ和Bgl Ⅱ切
割。通过DNA连接酶连接两种不同DNA分子片段之间的磷酸二酯键,构建重组质粒。(3)导入未连目的基因
的质粒的大肠杆菌也可以在含新霉素的培养基中生长,因此形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株(含有目
的基因的大肠杆菌)。培养基按物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基,液体培养基常用
于扩大培养,因此利用液体培养基在发酵罐中进行大量生产。(4)将目的基因导入哺乳动物细胞常用显微注
射法。囊胚期细胞开始出现分化 ,内细胞团将来发育成胎儿的各种组织,滋养层细胞将发育成胎膜和胎盘,
做DNA分析进行性别鉴定时常取囊胚期的滋养层细胞。为了保证t-PA改良基因能在乳腺细胞中表达,构建
基因表达载体需要将其与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
20.家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。巢式PCR扩增在两次PCR中使用两组不同引物,
先使用外引物对目标区域DNA片段进行第一次PCR扩增,产生中间产物,然后使用内引物对中间产物进行第
二次PCR扩增,产生目标产物。如图是巢式PCR工作原理示意图,请回答:
(1)巢式PCR体系中需要加入模板、 、 、引物、Mg2+、缓冲液等。
(2)相比于常规PCR获得的产物而言,巢式PCR获得的产物特异性 ,原因是如果利用外引物扩增产生
了错误片段,再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率 。
(3)巢式PCR通常在一个试管中进行第一阶段反应,然后将中间产物等转移到第二个试管中进行第二阶段反
应,不在同一试管完成的主要原因是 。
(4)科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因
(CSN1S1),进行早期胚胎的性别鉴定,并将鉴定后的胚胎进行移植。如表是主要实验步骤,请完成表格:实验目的 方法步骤要点
胚胎样品DNA提取 选取囊胚的① 细胞提取DNA
PCR引物的设计和合
根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成② 对引物
成
PCR过程 预变性→③ →退火(复性)→延伸
观察扩增结果 电泳分析
受体牛④ 处
对受体牛注射前列腺素
理
胚胎移植 将筛选出的胚胎移植到受体牛的子宫内
(5)电泳结果如图所示,1~5号为取自不同胚胎的DNA样品进行巢式PCR的产物。A和B条带中代表CSN1S1
的是 条带。可以确定1~5号中 号胚胎为雌性。
(6)牛胚胎性别的鉴定除了可以利用PCR外,下列方法也可行的有 。
①差速离心法
②核酸探针杂交法
③染色体核型分析法
④H-Y抗血清免疫学法(H-Y抗原编码基因位于Y染色体上)
答案 (1)热稳定的DNA聚合酶 dNTP (2)更强 降低 (3)防止引物配对特异性不强造成的非特异性扩
增的污染 (4)①滋养层 ②4 ③变性 ④同期发情 (5)A 1、2、4 (6)②③④
解析 (1)PCR扩增包括三个基本步骤:模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火(复性)、引物的延伸。PCR
体系的成分有引物、热稳定的DNA聚合酶、dNTP(原料)、模板DNA、Mg2+缓冲液等。(2)巢式PCR通过两轮
PCR扩增,使用两组引物扩增DNA片段,第二对引物称为巢式引物,结合在第一次PCR产物内部,使得第二次
PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于如果第一次扩增产生了错误片段,则第二次能在错误片
段上进行引物配对并扩增的概率很低,因此相比于常规PCR获得的产物而言,巢式PCR获得的产物特异性更
强。(3)巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的,因此两个阶段反应不在同一试管完成的主要原因是防止引
物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。(4)对胚胎进行性别鉴定时,宜取囊胚期的滋养层细胞。本
实验用巢式PCR技术,用的是两轮PCR,因此扩增一种目的基因片段需要设计2对引物,而扩增两种目的基因
片段则需要设计4对引物。PCR过程一般是预变性→变性→退火(复性)→延伸。在胚胎移植前需要对受体牛进行同期发情处理,便于移植。(5)题中利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和
常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)并进行电泳,雌性个体没有SRY,只有一条带,雄性有两条带,因此1、2、4
号是雌性,3、5号是雄性,雌性和雄性共有的是常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),因此A条带是CSN1S1,B
条带是SRY。(6)①差速离心法可用于分离各种细胞器,不能鉴定性别;②利用核酸探针杂交法,可以将Y染
色体上的雄性决定基因(SRY)制成探针鉴定性别;③X、Y染色体形态不同,因此可以用染色体核型分析法进
行性别鉴定;④H-Y抗血清免疫学法(H-Y抗原编码基因位于Y染色体上),也可以进行性别鉴定。
