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第 6 课时 基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体
三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达
载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步
骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电
泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一 重组 DNA 技术的基本工具
1．基因工程的概念
别名 ________技术
操作环境 生物体外
操作对象
操作水平 ________水平
结果 创造出更符合人们需要的新的________________和________________
2.基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体
之间________。
(2)DNA双螺旋结构的提出和______________的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)________________的破译。
(5)基因转移载体和________________________________的发现为DNA的切割、连接以及功
能基因的获得创造了条件。
(6)________体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9)________技术的发明。
(10)________________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)(2)DNA连接酶
(3)载体
(1)源于选择性必修3 P “旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
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_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(2)源于选择性必修3 P “旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶________(填“是”或
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“不是”)一回事。原因是①DNA连接酶连接的是________________，而DNA聚合酶是把
单个的______________连接到已有的DNA片段上。②________________起作用时需要以一条DNA链为模板，而________________不需要模板。
延伸应用 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所
以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，
如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列
和切点是 ，根据图示分析回答下列问题：
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________1．下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说
法错误的是( )
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
2．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体 DNA上才会随后者的复制而复
制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
归纳提升 与DNA有关的几种酶的比较
考点二 基因工程的基本操作程序1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞_______________或获得预期
________________等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知________________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用________________和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR________和扩增目的基因
a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据________________的原理，在体外提供参与DNA复
制的各种________与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行________________的技术。
b．PCR 反应的条件：一定的______________、DNA 模板、2 种______________、4 种
________________、________________DNA聚合酶，以及能自动调控__________的仪器。
c．PCR扩增的过程
d．PCR产物的鉴定：常采用________________来鉴定。
③通过构建____________来获取目的基因。
(1)源于选择性必修3 P “相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠
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道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈________，肠道细胞也无特异性受体。
因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
(2)源于选择性必修3 P “相关信息”： 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。
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因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序
列互补配对的________________。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因________________________________，同时，使目的基因能够表达和
发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用(3)构建过程
提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
RNA聚合酶识别和
使转录在所需要 翻译的起始信号 翻译的结束信号
功能 结合的部位，驱动
的地方停下来 (编码氨基酸) (不编码氨基酸)
基因转录出mRNA
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
农杆菌转化法、
常用方法 显微注射法 ____处理法
___________
受体细胞 原核细胞
将含有目的基因的表达 Ca2＋处理细胞→细胞
将目的基因插入Ti质粒的T
载体提纯→取卵(受精 处于一种能吸收周围
－DNA中→农杆菌→导入植
转化过程 卵)→显微注射→受精卵 环境中DNA分子的生
物细胞→整合到受体细胞的
发育→获得具有新性状 理状态→基因表达载
染色体DNA上→表达
的动物 体导入
辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此
处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入
目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4．目的基因的检测与鉴定
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条
件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列
有关引物的问题：
(1)什么是引物？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(2)PCR技术为什么需要引物？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是
什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获
得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要
消耗多少个引物数？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________3．(2023·湖北宜昌高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变
化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮 PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，
第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启
动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变
C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
4．下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是( )
A．过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B．过程B需要用CaCl 处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性
2
C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定
归纳提升 (1)PCR技术和DNA复制的比较(2)PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的
1 3 7 2n－1
DNA分子数
同时含引物A、B
0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
的DNA分子数
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2考点三 DNA 的粗提取与鉴定和 DNA 片段的扩增与电泳鉴
定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
(2)操作流程
注意 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA
分子不能形成絮状沉淀。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了________________原理。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓
度、DNA分子的________________等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______的紫外灯下被检
测出来。
1．在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪些？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
2．如何来评价扩增的效果？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
5．(2023·江苏苏州高三期末)下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙
述，正确的是( )
A．洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量
B．滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加
C．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质
D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化
6．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的
是( )A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色
1．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引
物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异
条带的产生，以下措施中有效的是( )
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
2．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
3．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金
属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转
基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR
扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
4. (2022·江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研
究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体
由 中 心 体 转 变 而 来 ， 中 心 体 在 有 丝 分 裂 中 的 功 能 是
_____________________________________
_______________________________________________________________________________
。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X
进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋
白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是______________________
_______________________________________________________________________________
。
PCR扩增时，需在____________________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，
获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具
有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒
Y，构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。请完成下表。分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合 ①选择图Ⅱ引物__________；
片段M中有白色的箭头，代表方向) ②PCR目的产物约为__________bp
确保M及连接处序列正确，Y－M的连接
处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选
列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别 填序列编号)
序列
④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒
Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞
均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基
检测融合蛋白定位
部，说明
__________________________________
______________________________________
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因
Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经______________形成cDNA作为模板，PCR扩
增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值
是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的
产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。
1．判断关于基因工程的基本工具的叙述
(1)限制酶只能用于切割目的基因( )
(2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( )
(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( )
2．判断关于基因工程的基本操作程序的叙述
(1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因( )(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( )
(3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点( )
(4)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应( )
3．判断关于DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定的叙述
(1)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件
下储存( )
(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( )
(3)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换( )
(4)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，遇甲紫会呈现红色( )
4．填空默写
(1)(选择性必修3 P )基因工程：___________________________________________________
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_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。
(2)(选择性必修3 P )限制酶能够识别双链DNA分子的________________序列，并且使每一
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条链中特定部位的______________________断开。
(3)(选择性必修3 P )载体上有特殊的标记基因，便于________________________________。
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(4)(选择性必修3 P )PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供______________、
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________________、4种________________和耐高温的________________。
(5)(选择性必修3 P )基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有
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________________等。
(6)(选择性必修3 P )转化：_______________________________________________________
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_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。
