文档内容
解密 19 基因工程
考点热度 ★★★★★
内容索引
核心考点 1 重组 DNA 技术的基本工具
基因工程定义
有关核酸的方向性问题
重组 DNA 技术的基本工具
DNA 的粗提取与鉴定
核心考点 2 基因工程的基本操作程序
转基因抗虫棉的主要四个步骤
相关的基本概念
PCR 技术
探究 · 实践 DNA 片段的扩增及电泳鉴定
核心考点 3 基因工程的应用
核心考点 4 蛋白质工程
核心考点 5 生物技术的安全性与伦理问题
转基因产品的安全性
关注生殖性克隆人
禁止生物武器
2022 年高考题
202 1 年高考题
考点 由高考知核心知识点 预测
（2022 浙江卷）29.农杆菌转化法
（2022 全国乙卷）12.PCR技术、蛋白质工程
（2022 山东卷）13.DNA的粗提取与鉴定
（2022 山东卷）25. 基因工程
（2022 北京卷）13. DNA的粗提取与鉴定
（2022 北京卷）21. 基因工程
（2022 广东卷）12. 基因工程
（2022 广东卷）22. 基因工程
基因工程是选修教材中的重点
（2022 海南卷）20. 基因工程
考察内容之一，基因工程的基
（2022 河北卷）24. 基因工程
基 因 工 本操作程序、蛋白质工程的原
程
（2022 湖南卷）22.基因工程、蛋白质工程
理是重高频考点，山东卷北京
（2022 湖北卷）22. 基因工程
卷兼顾了实验“DNA的粗提取
（2022 江苏卷）24. 基因工程
与鉴定”。
（2021 湖北卷）7基因工程.
（2021 山东卷）4. 基因工程
（2021 山东卷）5. 基因工程
（2021 山东卷）13.DNA的粗提取与鉴定
（2021 天津卷）11、12.基因工程
（2021 全国卷 甲）12.基因工程
（2021 全国卷 乙）12.基因工程
（2021 浙江卷）29.细胞工程、基因工程（2021 北京卷）16. 基因工程
（2021 广东卷）22.基因工程
（2021 海南卷）25.基因工程
（2021 河北卷）24. 基因工程
（2021 湖南卷）22.基因工程、细胞工程
（2021 辽宁卷）24. 基因工程
（2021 天津卷）16.基因工程核心考点 1 重组 DNA 技术的基本工具
基因工程：
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的
遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从
技术操作层面看，由于基因工程是在 DNA 分子 水平上进
行设计和施工的，因此又叫作 重组 DNA 技术 。
有关核酸的方向性问题：
① 核苷酸：
5
1’碳连碱基
2’碳（脱氧核糖连无氧；核糖有
4 1 氧）
3’碳连羟基（-OH）
3 2 5’碳连磷酸
② 一条脱氧核苷酸链（DNA单链）:
一端的3’碳上有游离的羟基（-OH），叫
3 ’端 ；
另一端的5’碳上有游离的磷酸基团，叫
5 ’端 。
③ DNA是由两条脱氧核苷酸链，按反向平行的方式构成
④ DNA聚合酶： 总是从 引物的 3 ’端连接脱氧核苷酸 （沿着模板链的
5’-3’方向合成子链）
⑤ RNA聚合酶： 总是从 引物的 3 ’端连接核糖核苷酸 （沿着模板链的5’-3’方
向合成子链）
⑥ tRNA的 3 ’端 结合氨基酸
⑦ 翻译时核糖体的移动方向：沿着 mRNA 的 5 ’ -3 ’ 方向移动
⑧ 限制性内切核酸酶识别的序列：沿 5 ’ -3 ’ 方向读取重组 DNA 技术的基本工具
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
DNA连接酶——“分子缝合针”
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”限制性内切核酸酶——“分子手术刀”：
1、来源：主要是原核生物
2、对原核生物的作用：防止外来病原物的侵害,将外源
DNA 切割保证自身安全
3、作用：
作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每
一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
结果：切割DNA成为 两个 DNA 片段
识别的序列： ① 沿 5’-3 ’ 方向读取
② 大多数限制酶的识别序列由6 个核苷酸组成，少数4个、8个。
③ 多数为回文序列
（因此，切割形成的黏性末端碱基序列：既相同，又互补）
当限制酶在它识别序列的中心轴线
( 图中虚线）两侧 将DNA分子的两条
黏性末端： 链分别切开时，产生的是黏性末端；
黏性末端特点：既相同，又互补
当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
平末端：DNA连接酶——“分子缝合针”
① 从大肠杆菌中分离得到
E.coli DNA连接酶： ② 只能连接黏性末端 ，不能连接平末端
③ 恢复磷酸二酯键
① 从T4噬菌体中分离出来
② 既能连接黏性末端，又能连接平末端，但
T4 DNA连接酶： 连接平末端的效率相对较低
③ 恢复磷酸二酯键
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
最常用的载体：
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细
胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制
能力的 环状双链 DNA 分子 。
质粒适合做载体的特点（载体必需具备的特点）：
① 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA
片段（基因）插入其中；
② 能在受体细胞中进行自我复制，或可整合到受
体细胞 DNA 上 ，随受体DNA同步复制；
③ 这些质粒上常有特殊的标记基因，四环素抗性
基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组
DNA 分子的筛选 ；
④ 对受体细胞无害。
（真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上
进行过人工改造的。）
在基因工程中使用的载体除质粒外，还
有噬菌体，动植物病毒等。DNA 的粗提取与鉴定
一、原理
1、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
2、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不
同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液
DNA的溶解度
O 0.14 mol/L NaCl浓度
3、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈
现蓝色
二、过程
洋葱（30g）+研磨液（10mL）
研磨
方法一： 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液
取上清液 过滤到烧杯中，在 4 ℃ 冰箱中放置
几分钟后，再取上清液。
方法二： 直接将研磨液倒入塑料离心管中，
在1500r/min 的转速下离心5min，
再取上清液放入烧杯中。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精
析出DNA
溶液(体积分数为95%)，静置2~3min，溶
液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA
方法一：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝
取出DNA 状物，并用滤纸吸去上面的水分
方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在
10000 r/min的转速下离心 5min，取
沉淀物（弃上清液）
溶解DNA 2mol/L的NaCl溶液
实验组： 2mol/L的NaCl溶液+DNA+二苯胺
鉴定DNA 试剂4mL→沸水浴5min
对照组：
2mol/L 的 NaCl 溶液+二苯胺试剂
4mL→沸水浴5min
核心考点 2 基因工程的基本操作程序转基因抗虫棉的主要四个步骤：
目的基因的筛选与获取
人工合成；
获取目的基因的方法：
利 用 PCR 技术扩增 ；
通过构建基因文库获取
筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因
中进行筛选是较为有效的方法之一
科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，
也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋
白有了较为深入的了解
利用PCR获取和扩增目的基因：
基因表达载体的构建
构建目的：
让目的基因在受体细胞中：
①稳定存在；
②遗传给下一代；
③表达和发挥作用
构建过程：
① 首先用一定的限制酶切割载体，使它出
现一个切口；
② 然后用同种限制酶或能产生相同末端的
限制酶切割 含有目的基因的 DNA 片段 ；
③ 再利用 DNA 连接酶 将目的基因片段拼接
到载体的切口处，这样就形成了一个重
组DNA分子
基因表达载体的组成：启动子： 启动子是一段有 特殊序列结构的 DNA 片段 ，位
于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是
RNA 聚合酶识别和结合的部位 。
诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑
制目的基因的表达。
终止子：终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要
的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有
特殊序列结构的 DNA 片段 。
目的基因： （如，Bt抗虫蛋白基因）位于启动子和终止子之间。
标记基因： （如，抗生素抗性基因）将含有目的基因的
细胞筛选出来
将目的基因导入受体细胞
导入植物细胞：
①花粉管通道法：
可以用微量注射器将 含目的基因的 DNA
溶液直接注人子房中；
可以在植物受粉后的一定时间内，剪去
柱头，将 DNA 溶液 滴加在花柱切面上
使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
②农杆菌转化法：
导入动物细胞： 显微注射法
利用显微注射将目的基因注入动物的
受精卵中(图3-8)，这个受精卵将发育
成为具有新性状的动物
导入原核细胞： 一般先用 Ca 2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞
处于一种 能吸收周围环境中 DNA 分子 的生
理状态，然后再将重组的基因表达载体导
入其中。目的基因的检测与鉴定
首先是分子水平的检测，包括：
① 通过 PCR 等技术检测棉花的染色体
DNA上是否插入了 Bt 基因
② 检测Bt基因是否转录出了mRNA；
③ 从转基因棉花中提取蛋白质，用相应
的抗体进行抗原一抗体杂交，检测Bt
基因是否翻译成 Bt 抗虫蛋白 等。
其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定：
例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以
及抗性的程度。
相关的基本概念：
目的基因：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基
因。
定义： 它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生
产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（也可以是一些具
有调控作用的因子）
获取目的基因的有效方法：
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
是较为有效的方法之一
扩增目的基因的方法：
PCR 技术
引物：
定义： 引物是一小段能与 DNA 母链 的一段碱基序列互补配对
的短单链核酸。（复制一段DNA需要两种引物）
①长度通常为 20 ～ 30 个核苷酸
特点： ②PCR需要 2 种 引物
③有方向性
④G-C 碱基对越多，复性温度越高，pcr反应越
快。
作用： 使 DNA 聚合酶能够从引物的 3 ’ 端开
始连接脱氧核苷酸Bt抗虫蛋白基因
（简称Bt基因）
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏
鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。当 Bt 抗虫蛋白被分解为多肽
后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，
最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中
才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异
性受体。因此， Bt 抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 。
农杆菌转化法
1、转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且
在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2、农杆菌转化法的原理：
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自
然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大
多数单子叶植物没有侵染能力。
农杆菌细胞内含有 Ti 质粒 ，当它侵染植物细胞
后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转
移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的
染色体 DNA 上。
根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入
Ti 质粒的 T-DNA 中 ，通过农杆菌的转化作用，
就可以使目的基因进入植物细胞。
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉
米等多种单子叶植物也取得了成功。
3、具体操作方法：
① 可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆
菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
② 可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一
段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛
选、鉴定等。PCR 技术
1、PCR：是聚合酶链式反应的缩写
2、PCR的原理： DNA 半保留复制的原理
DNA复制所需的基本条件：
DNA母链——提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸——合成DNA子链的原料
DNA聚合酶——合成DNA子链的原料
解旋酶——（断开氢键）打开DNA双链
PCR所需的基本条件：
DNA母链：一般是含目的基因的DNA
4种脱氧核苷酸： 四种脱氧核苷酸
（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
引物：2种
控制温度
缓冲溶液： 一般要添加 Mg 2+ ，DNA聚合酶
都需要Mg2+激活
3、PCR过程：（在PCR扩增仪（PCR仪)中自动完成）
90℃以上： 双链 DNA 解聚为单链
变性
50℃左右：
复性 两种引物通过碱基互补配对
与两条 单链 DNA 结合。
30次左右
72℃左右：
延伸 溶液中的 4 种脱氧核苷酸（ dNTP ） 在耐
高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基
互补配对原则 合成新的 DNA 链 。
即： 将 4 种脱氧核苷酸加到引物的 3 ’ 端
4、结果a*2n（a：初始数量；n：循环的次数）
5、常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物应用实例：
扩增某DNA片段：将引物设计在DNA片段的
两端
从某一DNA上扩增其中的一部分：将引物设计在
要扩增的DNA片段的两端
定 点 在突引物的外侧（5’端）加上需要的序列
变： （如，限制酶切割位点，特定的启动子等）
图中的酶a、酶b分别是限制酶酶a、酶b的识别序列探究·实践 DNA 片段的扩增及电泳鉴定
PCR原理：（DNA半保留复制原理）
利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解
聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次
PCR一般要经历30 次循环。
琼脂糖凝胶电泳原理：
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上
正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带
电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼
脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓
度、 DNA 分子的大小和构象 等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，
可以在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来。
方法步骤：（略）
注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离
心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装
成小份，并在 -20 ℃储存 。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，
放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，
移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
核心考点 3 基因工程的应用基因工程菌： 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
一般称为基因工程菌。
基因工程在农业方面的的应用
转基因生物 目的基因 优点
转基因抗虫植物 Bt抗虫蛋白基因 减少虫害、减少农药污染
转基因抗病植物 某些病毒、真菌等的抗病基因 减少病害、减少农药污染
转基因抗除草剂植 降解或抵抗某种除草剂的基因（如，
抗除草剂、提高农田管理效率
物 抗草甘膦基因）
必需氨基酸多的蛋白质编码基因；植
改良植物的的品质 提高玉米的营养价值；改良花卉
物花青素代谢有关的的基因
提高动物的生长速
外源生长激素基因 提高鲤鱼的生长速率
度
使转基因奶牛的乳汁中减少乳糖含
改善畜产品的品质 肠乳糖酶基因 量，以利于乳糖不耐受的人食用牛
奶。
基因工程在医药卫生领域的应用
利用大肠杆菌或酵母菌生产干扰
利用转基因微生物
素
将药用蛋白基因与乳腺中特异表
达的基因的启动子重组在一起，
生产基因工程药品
利用转基因动物 培育转基因克隆动物作为乳腺
（乳房）生物反应器，生产医用
蛋白
利用转基因植物
转基因克隆猪作为器官移植的的来 在猪的基因组中导入某种调节因
器官移植
源，可以避免免疫排斥反应 子，以抑制抗原决定基因的表达
基因工程在食品工业方面的应用
大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋
白质。
将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌
的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶
淀粉酶、脂酶等： 通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。
降解多种污染物的“超级细菌”，也是通过基因工程生产的核心考点 4 蛋白质工程
蛋白质工程
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功
能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，
或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，
是包含多学科的综合科技工程。
蛋白质工程崛起的缘由
基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白
质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物
种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
天冬氨酸途径合成赖氨酸：
天冬氨酸
抑制
天冬氨酸激酶
天冬氨酰磷酸
天冬酸β半醛
抑制
二氢吡啶二羧酸合成酶
二氢吡啶二羧酸
L-赖氨酸
如果我们将天冬氨酸激酶中第 352 位的苏氨酸变成异亮氨酸 ，将二
氢吡啶二羧酸合成酶中第 104 位的天冬酰胺变成异亮氨酸 ，就可以
使玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍蛋白质工程的基本原理
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最
终还必须通过改造或合成基因来完成。
从预期的蛋白质功能出发
设计预期的蛋白质结构
推测应有的氨基酸序列
蛋白质工程的基本思路：
找到并改变相对应的脱氧
核苷酸序列（基因）或合
成新的基因
获得所需要的蛋白质
蛋白质工程的应用
问题、解决方法 实现途径
问题： 改造胰岛素基因 ：
天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮 使编码胰岛素B链第28
下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单 位脯氨酸的碱基序列替
速效胰岛素 体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。 换成编码天冬氨酸序列
解决方法： 或重新编码B链28、
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29 29位氨基酸的序列使之
位的赖氨酸交换位置 成为赖氨酸、脯氨酸
问题：
干扰素在体外保存相当困难
干扰素 改造 干扰素 基因
解决方法：
将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸
问题：
会使人产生免疫反应，从而导致它的治疗效果
小鼠单克隆抗 大大降低
改造抗体基因
体 解决方法：
将小鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的
抗体上核心考点 5 生物技术的安全性与伦理问题
转基因产品的安全性
转基因成果令人叹为观止
微生物适于进行基因改造的优点：
微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素
敏感和容易进行遗传物质操作等优点
理性看待转基因技术
2016年，中央一号文件《中共中央国务院关于落实发
展新理念加快农业现代化实现全面小康目标的若干意
见》提出：加强农业转基因技术研发和监管，在确保
安全的基础上慎重推广。同年8月，国务院印发的
《“十三五”国家科技创新规划》指出：“十三五”
期间要持续攻克转基因关键核心技术，其中包括建成
规范的生物安全性评价技术体系，确保转基因产品安
全。目前，我国已经逐步建立了与国际接轨并适合我
国国情的转基因安全评价体系，这是世界上最严格的
安全评价体系之一。
理性看待转基因技术
不是人云亦云 ，更不是诋毁科学创新、造谣惑众
而是需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技
术的原理和操作规程；
还应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素
的影响；
最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。《农业转基因生物安全管理条例》
《农业转基因生物安全评价管理办法》
《农业转基因生物进口安全管理办法》
相关的法规： 《农业转基因生物标识管理办法》
《农业转基因生物加工审批办法》
《进出境转基因产品检验检疫管理办法》
关注生殖性克隆人
生殖性克隆人面临的伦理问题
生殖性克隆：是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
治疗是性指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它
克隆： 们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治
疗疾病的目的。
大多数人对生殖性克隆人的研究持否定态度：
生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都
不健全的人，严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术
的滥用。
克隆技术还不成熟：
生殖性克隆人会面临些问题：流产、死胎和畸形儿等，
这显然与人类传统的伦理道德是背道而驰的。
我国禁止生殖性克隆人
不赞成
不允许
我国政府一再重申四不原不支持 任何生殖性克隆人实验
则： 不接受
原因如下：
①克隆人只是某些人出于某种目的制造出的“产品”，没有
“父母”，这可能导致他们在心理上受到伤害；
②由于技术问题，可能孕育出有严重生理缺陷的克隆人；
③克隆人的家庭地位难以认定，这可能使以血缘为纽带的父
子、兄弟和姐妹等人伦关系消亡；
④生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关
系的伦理道德观念；
⑤生殖性克隆人是对人类尊严的侵犯；
⑥生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性，不利于
人类的生存和进化。《人类辅助生殖技术管理办法》
《人类辅助生殖技术规范》
《人类辅助生殖技术和人类精子库伦理原则》
我国的相关法
《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》
规：
《干细胞临床研究管理办法（试行）》
例如：《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》规定：利用体外受精、体细胞核移植
等技术获得的囊胚，其体外培养期限 自受精或核移植开始不得超过 14 d；不得将这
样获得的已用于研究的人囊胚植入人或任何其他动物的生殖系统。
禁止生物武器
生物安全：
生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经
济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在
风险。消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是
生物安全防控的重要方面。
前事不忘，后事之师
侵侵华华日日军军组建了从事细菌战的731部队和100部队，
并在我国领土上修建了几十座细菌武器工厂，大量
培养鼠疫、霍乱、伤寒和炭疽等一系列致命的传染
性疾病的病原体。为了检验生产出来的细菌武器的
效能，侵华日军曾用数千名中国人做实验。他们还
曾在我国20多个地区使用了细菌武器，造成几十
万老百姓死亡。
美国1军95队0年12月至1951年1月，在中国人民志愿军的打击
下，美军从“三八线”南撤。在此过程中，他们散布了
大量的天花病毒，使约3500人患上天花，约350人死
亡。1952年初，美军又在志愿军控制区投下了细菌弹，
散布了大量苍蝇、跳蚤等昆虫。经我国军事医学专家鉴
定、这些昆虫带有可引起鼠疫、霍乱、伤寒、痢疾、脑
膜炎和回归热等疾病的10多种致病菌。随后，美军又
将细菌战扩大到我国东北的抚顺、安东、凤城、宽甸和
临江等地。对生物武器的威胁，不能掉以轻心
威胁： 1978年，天花就已经在地球上消失，但是某些国家至今仍
然保存着天花病毒毒株。
有报道称，有的国家已经研制出新型的鼠痘病毒，
在实验室里，有人通过转基因技术把蜡状杆菌改造成像炭
疽杆菌一样的致病菌；有人将生物毒素分基因与流感病毒的基因拼
接在一起，然后再用基因工程的方法进行批量生产；
也有人对流感病毒基因进行改造，以使具有某种易感基因
的民族感染上这种病毒，而施放国的人却不易感染。
应对措1施97：2年4月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁止试制、生产
和储存并销毁细菌（生物）和毒剂武器公约》(简称《禁止生物武器公
约》)，该公约于1975年3月生效。1984年11月，我国也加入了这一公
约。
1998年6月，中美两国元首在关于《禁止生物武器公约》议定书的联合
声明中，重申了在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反
对生物武器及其技术和设备的扩散。2022年高考题
29. 回答下列（一）、（二）小题：（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
（4）在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生
长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在
转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。
（5）为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对
培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过
观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。
（6）植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长
短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。
【答案】
（4） ①. 农杆菌 ②. 过低 ③. 敏感性
（5） ①. 再生 ②. 细胞核 ③. 形态特征和数量
（6） ①. 培养时间 ②. 受精卵
【解析】
（二）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据
农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的
基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌→导入植
物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
【小问1详解】
产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水制成枯草杆菌
悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。
【小问2详解】
将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草
杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I ，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能
2
利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，
比值大的说明该菌株产酶性能较高。
【小问3详解】
要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀
粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。
【小问4详解】
野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T—DNA中插入一种抗生素抗性基因。
抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农杆
菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T-DNA中抗性基因的细胞能
在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，
因此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。
【小问5详解】
转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性较强
的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过
观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，
分析染色体组型是否改变。
【小问6详解】
植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时间长
短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表达
能力最高。
（2022 全国乙卷）12. 新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答
下列问题。
（1）新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原
理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。
根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
（2）为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。
PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果
为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______（答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳
性，说明______。
（4）常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原
性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的
基本操作流程是______。
【答案】（1）逆转录酶##反转录酶
（2） ①. 特异性核苷酸序列 ②. 退火##复性（3） ①. 曾感染新冠病毒，已康复 ②. 已感染新冠病毒，是患者
（4）获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
（检测受体能否产生S蛋白）
【解析】
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变
性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：
引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【小问1详解】
分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆
转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。
【小问2详解】
PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒
核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每
次循环分为3步，分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的一
步是复性（或退火）。
【小问3详解】
某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该
个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但
由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均
为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已
经感染新冠病毒，为患者。
【小问4详解】
基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导
入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程
为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
（检测受体能否产生S蛋白）。
（2022 山东卷）13. 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A. 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质
【答案】B
【解析】
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度
的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将
蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正
确；
B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；
C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；
D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿
析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
故选B。
（2022 山东卷）25. 某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可
通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋
白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使
融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
（1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条
件是_______、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序
列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。
（2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，
其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，
翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现
该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改
方案是______。
（3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组
样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙
所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由
②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。（4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。
【答案】（1） ①. 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸
②. 5'端
（2） ①. P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA
的密码子被错位读取。
②. 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基
（3） ①. 增强FLAG-P与UBC的结合 ②. 参与P与UBC的结合
（4）药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。
【解析】
【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右
时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4
种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【小问1详解】
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要
两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，
为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。
【小问2详解】
融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸
序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后
两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可
通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证
P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
【小问3详解】
①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组
添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④
组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推
测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
【小问4详解】
根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治
疗的目的。
【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。
（2022 北京卷）13. 下列高中生物学实验中，对实验结果不要求精确定量的是（ ）A. 探究光照强度对光合作用强度的影响
B. DNA的粗提取与鉴定
C. 探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度
D. 模拟生物体维持pH的稳定
【答案】B
【解析】
【分析】探究光照强度对光合作用强度的影响，自变量是光照强度，因变量是光合作用强度，需要精确
测定不同光照强度下光合作用强度，要求精确定量。
【详解】A、探究光照强度对光合作用强度的影响，需要测定不同光照强度下光合作用强度，要求精确定
量，A错误；
B、DNA的粗提取与鉴定属于物质提取与鉴定类的实验，只需观察是否有相关现象，不需要定量，故对实
验结果不要求精确定量，B正确；
C、探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度，需要明确不同生长素类调节剂浓度下根的生长情况，
要求定量，C错误；
D、模拟生物体维持pH的稳定，需要用pH试纸测定溶液pH值，需要定量，D错误。
故选B。
（2022 北京卷）21. 生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼
类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等
存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快
速的水体E物质监测方法。
（1）将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是_______。
（2）为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS
是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1相比，方案2的主要优势是_______，因而被用于制备监测鱼（MO）。（3）现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，
需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请
将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：____。
①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌）
Ⅱ.基因：______
A．GFP B.Gal4 C.雌激素受体基因（ER） D.仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
（4）SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后_______造成不育。
（5）使拟用于实际监测的SM不育的目的是_______。
【答案】（1）显微注射
（2）监测灵敏度更高 （3） ①. ② ②. D
（4）激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡
（5）避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【解析】
【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细
胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注
射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【小问1详解】
将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是
显微注射法。
【小问2详解】
由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。
【小问3详解】
MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，
MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。
【小问4详解】
成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱
导dg表达，使生殖细胞凋亡。
【小问5详解】
监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不
育。
（2022 广东卷）12. λ噬菌体的线性双链DNA两端各有一段单链序列。这种噬菌体在侵染大肠杆菌后其
DNA会自连环化（如图），该线性分子两端能够相连的主要原因是（ ）
A. 单链序列脱氧核苷酸数量相等
B. 分子骨架同为脱氧核糖与磷酸
C. 单链序列的碱基能够互补配对
D. 自连环化后两条单链方向相同
【答案】C
【解析】
【分析】双链DNA的两条单链方向相反，脱氧核糖与磷酸交替连接构成DNA分子的基本骨架，两条单链之
间的碱基互补配对。
【详解】AB、单链序列脱氧核苷酸数量相等、分子骨架同为脱氧核糖与磷酸交替连接，不能决定该线性
DNA分子两端能够相连，AB错误；
C、据图可知，单链序列的碱基能够互补配对，决定该线性DNA分子两端能够相连，C正确；
D、DNA的两条链是反向的，因此自连环化后两条单链方向相反，D错误。
故选C。
（2022 广东卷）22. “绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭
菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO 等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，
2
通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。回答下列问题：
（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对________________，利用PCR技术，在优化反
应条件后扩增得到目标酶基因。
（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的
合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
________________，终止子的作用是________________。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是
________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中
和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】（1）引物 （2） ①. 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 ②. 终止
转录，使转录在需要的地方停下来
（3）二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
（4） ①. 废物的资源化 ②. 不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
【解析】
【分析】（1）PCR技术的原理是DNA半保留复制，是在体外大量复制DNA的技术，该技术的关键是Taq
酶可以从引物的3’端延伸子链。
（2）减缓温室效应，一方面要减少二氧化碳的排放，另一方面通过植树造林等手段增加大气中二氧化碳
的消耗。
【小问1详解】
利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链
结合后，Taq酶才能从引物的3’端延伸子链。
【小问2详解】
基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可
终止转录，使转录在需要的地方停下来。
【小问3详解】
重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。
【小问4详解】
根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术,以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原
料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术生产丙酮的过程不仅不
排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，
所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
（2022 海南卷）20. 以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A的
缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为
诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡
遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。
（1）CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用
___________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加______________等天然
成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（2）体外获取OSNL的方法有______________（答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，
需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和______________等。启动
子是______________识别和结合的部位，有了它才能驱动____________________________。
（3）iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是______________。
（4）诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________。
（5）该实验流程中用到的生物技术有________________（答出2点即可）。
【答案】（1） ①. 胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 ②. 动物血清
（2） ①. PCR技术、人工合成法 ②. 终止子 ③. RNA聚合酶 ④. 目的基因转录出
mRNA，最终表达出所需要的蛋白质
（3）基因的选择性表达
（4）诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵
母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术
（5）基因工程、动物细胞培养
【解析】
【分析】胚胎干细胞（ES细胞）具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、人类疾病的发病机
理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。iPS细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动
物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为ES细胞样的细胞，即iPS细胞。
【小问1详解】
动物细胞培养时，鸡胚组织剪碎后需用胰蛋白酶处理，以获得单细胞悬液。动物细胞培养时一般需要在
合成培养基中添加血清等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
【小问2详解】
OSNL为目的基因，体外获取目的基因可通过PCR技术大量扩增或通过人工合成法来合成。基因表达载体
中除目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点和标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA
片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获
得所需要的蛋白质。
【小问3详解】
据图可知，由iPS细胞诱导形成iPGCs细胞经过了细胞分化，该过程遗传物质没有改变，导致其细胞的形
态、结构和功能不同的根本原因是基因的选择性表达。
【小问4详解】
诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为
诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细
胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术。
【小问5详解】
由图可知，该实验流程中将OSNL基因导入鸡胚成纤维细胞利用了基因工程技术，诱导多能干细胞过程利
用了动物细胞培养的技术。
（2022 河北卷）24. 蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂
（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列
问题：
（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是________。
（2）________是实施基因工程的核心。
（3）利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的________上，此方法的不足之处是________。
（4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有________（写出
两点即可）。（5）确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的________以鉴定其抗性程度。下图为
三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析________（填“NaPI”或“StPinlA”或
“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是________。
（6）基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生________。导致
昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗
胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是________（写出两点即可）。
【答案】（1）调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的
（2）#基因表达载体的构建##表达载体的构建#
（3） ①. T-DNA ②. 该方法不适用与单子叶植物
（4）基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术
（5） ①. 效果 ②. NaPI
③. 饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃数较对照组少
（6） ①. 定向改变 ②. 由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率
逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋
白酶抑制剂
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了
mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的。
【小问2详解】
基因工程的核心是基因表达载体的构建。
【小问3详解】
农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的
DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，
就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。其不足之处是该方法不适用与单子叶植物。
【小问4详解】
目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因、是否
能转录处目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗虫性、
抗病性、活性等。即可利用基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术等。
【小问5详解】
抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的效果以鉴定其抗性程度。由图
可知，NaPI转基因棉花的抗虫效果最佳，因为饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃数较
对照组少。
【小问6详解】
在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。由于害虫发生
基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的
能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂。
（2022 湖南卷）22. 水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有
良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
（1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质b可能不同，
合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________。
（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________、__________
和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是____________________。
（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如
图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______（填“种类”或“含量”）有关，
导致其活性不同的原因是______________________________。（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简
要写出实验设计思路________________________________________。
【答案】（1） ①. 氨基酸序列多肽链 ②. mRNA ③. 密码子的简并性
（2） ①. 从基因文库中获取目的基因 ②. 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 ③.
DNA双链复制
（3） ①. 种类 ②. 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结
构有不同程度破坏
（4）取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；
用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入 1、2、3号三支试管中，
静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
【解析】
【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有
的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列；
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，
对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质
工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
【小问1详解】
据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋
白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。
【小问2详解】
蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通
过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。
【小问3详解】
将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均
上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活
性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处
理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解
时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
【小问4详解】
若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设
计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水
蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试
管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
（2022 湖北卷）22. “端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程
育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为
了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验；
【实验一】遗传特性及杂交育种的研究
在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。
杂交组合 F 表现型 F 表现型
1 2
甲×乙 不甜 1/4甜、3/4不甜
甲×丙 甜 3/4甜，1/4不甜
13/16甜、3/16不
乙×丙 甜
甜
【实验二】甜度相关基因的筛选
通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。
【实验三】转S基因新品系的培育
提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出
转S基因的新品系。
根据研究组的实验研究，回答下列问题：
（1）假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则乙、丙杂交的F 中表现为甜的植株基因型有_____种。品
2
系乙基因型为_______。若用乙×丙中F 不甜的植株进行自交，F 中甜∶不甜比例为_____。
2 3
（2）下图中，能解释（1）中杂交实验结果的代谢途径有___________。
（3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用_____________酶切割S基因的cDNA和载体。
（4）用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是________。
（5）除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育
种方法还有___________（答出2点即可）。
【答案】（1） ①. 7 ②. aabb ③. 1∶5
（2）①③ （3）XbaⅠ、HindⅡ
（4）通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞
（5）单倍体育种、诱变育种
【解析】
【分析】农杆菌转化法：取Ti质粒和目的基因构建基因表达载体、将基因表达载体转入农杆菌、将农杆
菌导入植物细胞、将植物细胞培育为新性状植株。
杂交育种：杂交→自交→选优；诱变育种：物理或化学方法处理生物，诱导突变；单倍体育种：花药离
体培养、秋水仙素加倍；多倍体育种：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗；基因工程育种：将一种生物
的基因转移到另一种生物体内。
【小问1详解】
甲为纯合不甜品系，基因型为AAbb，根据实验一结果可推得乙基因型为aabb，丙基因型为AABB，乙、丙
杂交的F 基因型有3×3=9种，假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，F 中表现为甜的植株基因型有7
2 2
种。若用乙×丙中F 不甜的植株进行自交，F 中不甜比例=1/3+2/3×3/4=5/6，F 中甜∶不甜比例为
2 3 3
1∶5。
【小问2详解】
不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，只有A导致不甜，当A与B同时存在时，表现为甜，故选①③。
【小问3详解】
为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最
好选用XbaⅠ、HindⅡ酶切割S基因的cDNA和载体。
【小问4详解】
用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，可以通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞。【小问5详解】
除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方
法还有单倍体育种、诱变育种。
（2022 江苏卷）24. 纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成
的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
（1）纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的
功能是__________________。
（2）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR
扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合 D的NA分离出来，溶
液中添加NaC1至2．0mo1/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化
下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
（3）为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，
可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在
EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中 ①选择图Ⅱ引物_____________；
融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ②PCR目的产物约为_____________bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连
接处上游含有Hind III+EcoR V的识
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序列编号）
别序列，下游含有EcoR V+BamH I的
识别序列
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，
检测融合蛋白定位 发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基
部，说明________________________。
（4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水
平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量
相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环
数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
_____________倍。
【答案】（1）与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心）
（2） ①. 溶解DNA ②. 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） ③. 3'
（3） ①. a、b ②. 1100 ③. Q3 ④. X蛋白参与中心体的形成
（4） ①. 逆转录 ②. 32
【解析】
【分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的
操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动
解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【小问1详解】
中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。
【小问2详解】
从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2．0mo1/L的
NaC1溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1至
2．0mo1/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引
物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
【小问3详解】
PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图II中的引物a和引物
b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR
V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点
插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有Hind III和BamH I识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q3。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有
绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。
【小问4详解】
研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集
样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，
健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人
基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论
上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。2021年高考题
（2021 湖北卷）7. 限制性内切酶EcoRI识别并切割 双链DNA，用EcoRI完全酶切
果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A. 6 B. 250 C. 4000 D. 24000
【答案】C
【解析】
【分析】限制性核酸内切酶能识别特定的DNA序列，切割特定的位点，在特定的碱基之间切割磷酸二酯
键。
【详解】据图可知，EcoRI的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某
一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制
酶EcoRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。C符合题意。
故选C。
（2021 山东卷）4. 我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功
将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用于研究人
类起源及进化。下列说法正确的是（ ）
A. “引子”的彻底水解产物有两种
B. 设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA
C. 设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列
D. 土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别
【答案】C
【解析】
【分析】根据题干信息“利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其
微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来”，所以可以推测
“因子”是一段单链DNA序列，根据碱基互补配对的原则去探测古人类 DNA中是否有与该序列配对的
碱基序列。
【详解】A、根据分析“引子”是一段DNA序列，彻底水解产物有磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基，共
6种产物，A错误；
B、由于线粒体中也含有DNA，因此设计“引子”的 DNA 序列信息还可以来自线粒体DNA，B错误；
C、根据题干信息“利用现代人的 DNA 序列设计并合成了引子”，说明设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列，C正确；
D、土壤沉积物中的古人类双链 DNA 需要经过提取，且在体外经过加热解旋后，才能与“引子”结合，
而不能直接与引子结合，D错误。
故选C。
【点睛】
（2021 山东卷）5. 利用农杆菌转化法，将含有基因修饰系统的 T-DNA 插入到水稻细胞 M 的某条染色
体上，在该修饰系统的作用下，一个 DNA 分子单链上的一个 C 脱去氨基变为 U，脱氨基过程在细胞
M 中只发生一次。将细胞 M 培育成植株 N。下列说法错误的是（ ）
A. N 的每一个细胞中都含有 T-DNA
B. N 自交，子一代中含 T-DNA 的植株占 3/4
C. M 经 n（n≥1）次有丝分裂后，脱氨基位点为 A-U 的细胞占 1/2n
D. M 经 3 次有丝分裂后，含T-DNA 且脱氨基位点为 A-T 的细胞占 1/2
【答案】D
【解析】
【分析】根据题干信息“含有基因修饰系统的 T-DNA 插入到水稻细胞 M 的某条染色体上，在该修饰系
统的作用下，一个 DNA 分子单链上的一个 C 脱去氨基变为 U，脱氨基过程在细胞 M 中只发生一次”，
所以M细胞含有T-DNA，且该细胞的脱氨基位点由C-G对变为U-G对，DNA的复制方式是半保留复制
原料为脱氧核苷酸（A、T、C、G）。
【详解】A、N是由M细胞形成的，在形成过程中没有DNA的丢失，由于T-DNA 插入到水稻细胞 M
的某条染色体上，所以M细胞含有T-DNA，因此N的每一个细胞中都含有 T-DNA，A正确；
B、N植株的一条染色体中含有T-DNA，可以记为+，因此N植株关于是否含有T-DNA的基因型记为+-，
如果自交，则子代中相关的基因型为++∶+-∶--=1∶2∶1，有 3/4的植株含 T-DNA ，B正确；
C、M中只有1个DNA分子上的单链上的一个 C 脱去氨基变为 U，所以复制n次后，产生的子细胞有
2n个，但脱氨基位点为 A-U 的细胞的只有1个，所以这种细胞的比例为1/2n，C正确；
D、如果M 经 3 次有丝分裂后，形成子细胞有8个，由于M细胞 DNA 分子单链上的一个 C 脱去氨基
变为 U，所以是G和U配对，所以复制三次后，有4个细胞脱氨基位点为C-G，3个细胞脱氨基位点为
A-T，1个细胞脱氨基位点为U-A，因此含T-DNA 且脱氨基位点为 A-T 的细胞占 3/8，D错误。
故选D。
【点睛】
（2021 山东卷）13. 粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进
行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物
的处理方式是（ ）A. 加入适量的木瓜蛋白酶
B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟
的
C. 加入与滤液体积相等 、体积分数为 95%的冷却的酒精
D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L
【答案】A
【解析】
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl
溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂
的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后
在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；
B、37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温
10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误；
C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分
数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；
D、加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L
的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。
故选A。
【点睛】
阅读下列材料，完成下面小题。
为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取如下措施：
①基因策略：包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等。例如，早期种植的抗虫棉只
转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现在经常将两种或两种以上Bt基同时转入棉花。
②田间策略：主要是为棉铃虫提供底护所。例如我国新疆棉区，在转基因棉田周围种植一定面积的非转
基因棉花，为棉铃虫提供专门的庇护所：长江、黄河流域棉区多采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其
他棉铃虫寄主作物混作的方式，为棉铃虫提供天然的庇护所。
③国家宏观调控政策：如实施分区种植管理等。
11. 关于上述基因策略，下列叙述错误的是（ ）
A. 提高Bt基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度
B. 转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律
C. 若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，则两种基因互为等位基因
D. 转入多种Bt基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向12. 关于上述田间策略，下列叙述错误的是（ ）
A. 转基因棉田周围种植非抗虫棉，可降低棉铃虫抗性基因的突变率
B. 混作提高抗虫棉的抗虫持久性，体现了物种多样性的重要价值
C. 为棉铃虫提供底护所，可使敏感棉铃虫在种群中维持一定比例
D. 为棉铃虫提供庇护所，可使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓
【答案】11. C 12. A
【解析】
【分析】1、自由组合定律的实质：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；
在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合
2、生物多样性的价值：（1）直接价值：对人类有食用、药用和工业原料等使用意义，以及有旅游观赏、
科学研究和文学艺术创作等非实用意义的。（2）间接价值：对生态系统起重要调节作用的价值（生态功
能）。（3）潜在价值：目前人类不清楚的价值。
3、根据题意：混作可以使对毒蛋白敏感的个体存活，由于敏感型个体和抗性个体之间存在种内斗争等因
素，因此可以降低抗性个体的数量，从而提高抗虫棉的抗虫持久性。
【11题详解】
A、提高Bt基因表达量，使抗虫蛋白含量增加，可以使更多的棉铃虫被淘汰，所以可以降低棉铃虫的种
群密度，A正确；
B、如果两种Bt基因都转入一条染色体上，则其遗传不遵循自由组合定律，B正确；
C、如果两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，两个基因位于一条染色体上，不是等位基因，
等位基因位于一对同源染色体上，C错误；
D、由于棉铃虫基因突变频率低且不定向，转入多种Bt基因可以降低棉铃虫抗Bt毒蛋白的能力，从而提
高抗虫持久性，D正确。
故选C。
【12题详解】
A、基因突变可以自发发生，且具有不定向性，突变频率与环境没有直接关系，所以在转基因棉田周围种
植非抗虫棉，不能降低棉铃虫抗性基因的突变率，A错误；
B、采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其他棉铃虫寄主作物混作，可以使敏感型个体存活，同时具有抗
的
毒蛋白 棉铃虫生存空间变小，提高了抗虫棉的抗虫持久性，保护了环境，同时也具有经济价值，所以
体现了物种多样性的直接和间接价值，B正确。
C、在转基因棉田周围种植一定面积的非转基因棉花，为棉铃虫提供底护所，使敏感型的个体可以生存，种群中维持一定比例，C正确；
D、混作使具有抗毒蛋白和敏感型个体都得以生存，由于二者之间存在种内斗争，因此使棉铃虫种群抗性
基因频率增速放缓，D正确。
故选A。
【点睛】
（2021 北京卷）12. PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行
了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采
集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是_________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中
复性的结果是_______ 。
的
（3）为了做出正确 诊断，PCR反应所用的引物应该能与_______ 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】 ①. ④②③① ②. Taq酶（热稳定DNA聚合酶） ③. 延伸 ④. Taq酶从引物起
始进行互补链的合成 ⑤. 两条单链DNA ⑥. 一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【解析】
【分析】PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大
量扩增目的基因。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根
据这一序列合成引物。
【详解】（1）PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④
采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
（2）在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是
Taq酶（热稳定DNA聚合酶），PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果
是Taq酶从引物起始进行互补链的合成。
（3）DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结
合。
（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技
术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【点睛】本题考查PCR技术及应用，难度较小，解答本题的关键是明确PCR技术的原理，具体反应过程，
以及在临床病原菌检测中的应用。
12. 用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和TDNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA
4
片段可以用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用TDNA连接酶连
4
接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在
受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子
上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是
______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
【答案】 ①. EcoRI、PstI ②. EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV ③. 磷酸二酯键 ④. 自我复
制 ⑤. 一至多个限制酶切位点 ⑥. 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有
质粒载体的宿主细胞 ⑦. 位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能
驱动转录过程
【解析】
【分析】基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
【详解】（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，
E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，
而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI
和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA
片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用TDNA连接酶连接。
4
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键 。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在
受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导
入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基
培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作
步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
（2021 浙江卷）29.（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监
测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体
__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标
监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载
体形成_______，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的
基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有__________（答出2点即可）。提取质粒后，采用____法，
将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散
细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎
细胞克隆的形成率。
答案：
（1）富营养化
（2）重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射
（ ）胰蛋白酶；原代；饲养层细胞
解3析
（二）
（1）生活污水富含N、P，未经处理就大量排放，会导致水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华或
赤潮。
（2）具有相同粘性末端的目的基因和载体DNA（如质粒），经DNA连接酶处理后，会形成重组DNA
分子。与目的基因相同的限制性核酸内切酶识别序列，可以确保限制性内切酶处理后与目的基因形成相
同的粘性末端，以便于和目的基因的连接。标记基因（抗生素抗性基因）的存在，便于筛选含有目的基
因的受体细胞。动物基因工程，通常采用显微注射法将重组DNA分子导入动物受精卵中。
（3）使用胰蛋白酶处理囊胚的内细胞团，借助酶的专一性，可分解细胞间质的蛋白质，让细胞分散，便
于培养。将分散的细胞初次在卡氏瓶中培养，称之为原代培养。提高细胞克隆形成率的措施有：选择适
宜的培养基、添加血清（胎牛血清最好）、饲养层细胞（滋养细胞如经射线照射本身失去增殖力的小鼠
成纤维细胞）支持生长、激素（胰岛素等）刺激、使用CO 培养箱、调节pH等。
2
【点睛】1、熟练掌握微生物的筛选、分离和保存，以及微生物固定化方法是解题的关键；2、熟练掌握基因工程的基本操作步骤，并了解每一步的目的是解题的关键。
（2021 北京卷）16. 新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全
球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗
（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病
毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通过_______得到cDNA，经_______获取S基因，酶切后再连接到载
体。
（2）重组疫苗中的S基因应编码________。
A. 病毒与细胞识别的蛋白 B. 与病毒核酸结合的蛋白
C. 催化病毒核酸复制的酶 D. 帮助病毒组装的蛋白
（3）为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍
然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗
→________→_________→诱发特异性免疫反应。
（4）重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其
DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因________。
【答案】（1） ①. 逆转录/反转录 ②. PCR扩增 （2）A
（3） ①. （重组腺病毒）进入细胞 ②. 表达抗原
（4）重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统。
【解析】
【分析】重组腺病毒疫苗必须具备的条件：能够将新冠病毒抗原基因（目的基因）带入到受体细胞；在
受体细胞中表达出抗原蛋白；不会导致疾病发生。
【小问1详解】
新冠病毒是RNA病毒，其遗传物质是RNA，若要得到与其对应的cDNA，则要进行逆转录。用cDNA扩
增出目的基因——S基因，需要利用PCR扩增技术。
【小问2详解】
重组疫苗作为抗原需要被人体免疫系统识别，而重组疫苗中的 S基因是从新冠病毒中提取的，所以重组
疫苗中的S基因应编码病毒与细胞都能识别的蛋白，A正确，BCD错误。
故选A。
【小问3详解】
重组疫苗对人体来说属于外来异物，即抗原，故人体接种疫苗后，重组腺病毒进入人体细胞，其在人体
细胞内表达出抗原，引发机体产生特异性免疫——细胞免疫和体液免疫，因此该疫苗发挥作用的过程是：
接种疫苗→（重组腺病毒）进入细胞→表达抗原→诱发特异性免疫反应。【小问4详解】
接种疫苗后，由于长时间内接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA，而DNA会不断表达出S蛋白，S蛋
白作为抗原刺激机体，故机体会反复针对抗原产生特异性免疫应答。
【点睛】本题以新冠肺炎为问题情境，考查重组腺病毒疫苗和免疫的相关知识，考查考生运用所学知识
解决实际问题的能力。
（2021 广东卷）22. 非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目
标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成
路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严
重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有
___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋
白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体
转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的
方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变
___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】 ①. 基因文库中获取、人工合成法 ②. 盐析法、酶解法或高温变性 ③. 感受态
④. 抗原-抗体杂交技术 ⑤. 有的酶失活而使反应中断 ⑥. 基因的碱基序列
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--
DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成
蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获
得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋
白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或
高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体
转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其
易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白
质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子
水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论
与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
（2021 海南卷）25. CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子
剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，
然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
（3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否
成功所采用的方法是____________，基因敲除成功的判断依据是____________。
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得
重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得
到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入
到基因组DNA的编辑过程：________________________。
【答案】（1）DNA连接酶
（2）感受态细胞法 （3） ①. 碱基互补配对原则 ②. 目标DNA特定的核苷酸序列
（4） ①. DNA分子杂交技术 ②. 出现杂交带
（5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9
蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因
组DNA中。
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细
胞；目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建
CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶
切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
【小问2详解】
大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【小问3详解】
根据题图可知：在 CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导 RNA，准确引导
Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原
因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA
与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA
特定的核苷酸序列。
【小问4详解】
可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除 是否成功，若出现杂交带，则说明基因敲除成功。
【小问5详解】根据图示可知：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产
物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插
入到基因组DNA中。
【点睛】本题以基因编辑技术为情境，考查DNA分子的结构、碱基互补配对、基因工程等相关知识，考
查学生综合应用能力及科学思维的核心素养。
（2021 河北卷）24.采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技
术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土
壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因
导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，
这个群体称为__________。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载
体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是
__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是
______________________________。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同
器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐
性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最
为方便有效。
（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应
高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复
植物的优势在于___________（写出两点即可）。
【答案】 ①. 基因组文库 ②. 限制酶和DNA连接酶 ③. 便于目的基因的筛选和鉴定 ④.农杆菌转化法 ⑤. 避免目的基因在自然界中的扩散 ⑥. 耐性 ⑦. 茎叶 ⑧. YCF1可通过主
动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 ⑨. 杨树具有发达的根系和高
大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【解析】
【分析】1、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是
部分基因文库。
2、据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因
植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。
【详解】（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群
体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性
末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1
基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安
全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株
在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高
于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓
解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞
液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树
具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便
运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意
在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际
问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。
（2021 湖南卷）22. M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA
片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因
克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是_________，这类酶能将特定部位
的两个核苷酸之间的_________断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目
的是_________。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_________。从早期胚胎中
分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_________（答出两点即可），功能上具有_________。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的_________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，
制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路
_________。
【答案】 ①. 限制性核酸内切酶（限制酶） ②. 磷酸二酯键 ③. 清除代谢产物，防止细胞代
谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养 ④. 动物胚胎细胞分化程度低，恢复
其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 ⑤. 细胞体积小，细胞核大，核
仁明显（任选两点作答） ⑥. 发育的全能性 ⑦. B ⑧. 取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，
分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交
【解析】
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--
DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成
蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、核移植：
（1）概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个
新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物；
（2）原理：动物细胞核的全能性；
（3）动物细胞核移植可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核
移植。原因：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能
性十分困难。
【详解】（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），故在构建含有片段F的
重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作
用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为
黏性末端和平末端。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目
的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
（3）由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十
分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细
胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细
胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
（4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B
细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗
体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克
隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路为：取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，
分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交。
【点睛】本题结合图示考查基因工程、核移植、胚胎移植、单克隆抗体的相关知识，涉及知识点较多，
但难度不大，要求考生掌握基础知识，属于考纲中识记与理解层次。
（2021 辽宁卷）24. PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细
胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb
（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序
列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和
__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用
__________（填“E．coliDNA连接酶”或“TDNA连接酶”）。
4
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
A↓AGCTT G↓AATTC
HindⅢ EcoRI
TTCGA↑A CTTAA↑G
CAG↓CTG CTGC↓AG
PvitⅡ PstI
GTC↑GAC GA↑CGTC
G↓GTACC G↓GATCC
KpnI BamHI
CCATG↑G CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl 处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。
2
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、
3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
（5）将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞
周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的
原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G”或“S”或“G/M”）期。
1 2
【答案】（1）逆转录 （2） ①. EcoRI ②. PvitⅡ ③. T DNA连接酶 （3）感受态
4
（4）3
（5）G/M
2
【解析】
【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI在质粒上
有两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。
图4中G 期和S期细胞减少，而G 期细胞数目明显增多。
1 2
将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。
【小问1详解】
利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。
【小问2详解】
根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在
于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用TDNA
4
连接酶连接质粒和目的基因。
【小问3详解】
转化时用CaCl 处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
2
【小问4详解】
由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和
质粒，如果用EcoRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2
基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。
【小问5详解】
比较图4中G 期和S期细胞减少，而G 期细胞数目明显增多，说明了G 期和S期细胞可以进入G 期，
1 2 1 2
而G 期的细胞没有能够完成分裂进入G 期，因此PHB2蛋白应该作用于G/M期。
2 1 2
【点睛】本题考察基因工程的知识，需要考生分析质粒的酶切位点，结合目的基因转入的位置进行分析，
结合题干中目的基因的大小分析电泳图。
（2021 天津卷）16. 乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，
但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。
下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为___________。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通
过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑___________和
___________。②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有
____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动
转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列___________（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在___________的固体培养基上筛选出转基因酿
酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一
步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A. 进一步优化发酵条件 B. 使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C. 敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D. 对转基因酿酒酵母进行诱变育种
【答案】（1）细胞质基质
（2） ①. 包含BamHI的识别序列 ②. 将GTG改为ATG ③. 原核生物复制原点 ④. 不能
⑤. 缺失尿嘧啶 （3）B
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--
DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成
蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。
【小问2详解】
①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好
的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含
BamHI的识别序列。
②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子
存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。
③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母
菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。
【小问3详解】
A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；
B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；
C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；
D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。
故选B。
【点睛】本题以获得能产生乳酸的工程菌株为背景，考查基因工程的相关内容，重点考查基因表达载体
的构建，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，识记PCR技术的原理和过程，能结合所学的知识准确
答题。
