文档内容
第 18 讲 基因工程
目录
01 题型突破练
【题型一】基因工程的基本工具
【题型二】基因工程的基本操作程序
【题型三】PCR技术及其应用
【题型四】蛋白质工程的原理和应用
02 重难创新练
03 真题实战练
题型一 基因工程的基本工具
1．[经典题]质粒是基因工程最常用的运载体，下列有关质粒的说法，错误的是（ ）
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为运载体时，应具有标记基因和一至多个限制酶切割位点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核（区）外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存。并在宿主细胞内复制
2．在基因工程操作中限制酶是不可缺少的工具。下列关于限制酶的叙述错误的是（ ）
A．限制酶主要是从原核细胞中获取的
B．每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列
C．限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的氢键
D．同一种限制酶切割不同的DNA分子可产生碱基互补配对的黏性末端
3．[经典题]下表为4种限制酶的识别序列和切割位点(↓表示切割位点),下列叙述正确的是（ ）
限制酶1 —↓GATC—
限制酶2 —CATG↓—
限制酶3 —G↓GATCC—
限制酶4 —GG↓CGCC—A．在使用限制酶的同时还需要解旋酶
B．限制酶1和3切割DNA分子产生的黏性末端相同
C．图中限制酶的识别序列都由4个核苷酸组成
D．限制酶4作用后产生的是平末端
4．[改编题]某DNA分子大小为4kb，用限制酶Ⅰ和Ⅱ进行充分酶切，酶切结果如图所示。下列叙述错误的
是（ ）
A．该DNA分子含有两个游离的磷酸基团
B．DNA分子上有1个酶Ⅰ的切割位点，3个酶Ⅱ的切割位点
C．限制酶切割的化学键是磷酸二酯键
D．酶Ⅰ和酶Ⅱ的识别序列一定不同，但可能产生相同的黏性末端
5．[经典题]以下是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列有关叙述，正确的是
（ ）
A．以上DNA片段是由5种限制酶切割后产生的，切割产生①片段的限制酶识别序列由5个碱基对构成
B．限制酶只存在于原核生物，作用的化学键为磷酸二酯键和氢键
C．上述能进行连接的两个黏性片段，其连接后形成的DNA分子是
D．两个③片段只能被EcoliDNA连接酶催化连接形成重组DNA
题型二 基因工程的基本操作程序
6．[新情境]将具有抗肿瘤作用的细胞因子IFNγ基因连接到Egr-1基因启动子上后，利用Egr-1基因启动
子的放射诱导性，在X射线等电离辐射诱导下，启动Egr-1基因启动子，进而诱导与其连接的IFNγ基因
表达。这样在肿瘤部位可以通过射线和IFNγ的双重作用杀伤肿瘤细胞。图示为重组质粒的构建过程，下列叙述正确的是（ ）
A．重组质粒上的Egr-1基因启动子可以被肿瘤细胞核糖体识别
B．通过PCR扩增cDNA进行30轮时，共需要消耗的引物数量为230个
C．将外源IFNγ基因送入到肿瘤细胞的载体还可以是动物的病毒
D．T4DNA连接酶能连接质粒和IFNγ基因双链之间的氢键和磷酸二酯键
7．[经典题]将荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中，其表达产物既具有荧光蛋白的特性，又
保持了目的基因表达产物的活性，因此可通过检测荧光强度来检测目的基因的表达水平。下列有关叙述错
误的是（ ）
A．荧光蛋白可以用于检测目的基因表达产物在植物体内的转移和分布情况
B．将荧光蛋白基因转入叶绿体中可防止其逃逸到亲缘关系较近的植物体内
C．连接荧光蛋白基因和目的基因时，通常用同种限制酶对二者进行切割
D．需要将荧光蛋白基因和目的基因分别连接在质粒中的不同启动子后面
8．[改编题]某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，已知质粒中存在两
个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大肠杆菌本身不
带有任何抗性基因。下列叙述正确的是（ ）
A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件
C．成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长
D．能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求
9．某基因表达载体构建过程中，需将目的基因1和目的基因2按照下图所示导入整合区域。用四种产生的
黏性末端各不相同的限制酶将目的基因1和目的基因2切割，先后插入ZS质粒时，最佳的限制酶使用方案是（ ）
A．①③ B．①④ C．②③ D．②④
10．由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基
因接入载体E，下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（ ）
A．选择 EcoRV或SmaI对载体P 进行酶切，再用TDNA 连接酶连接目的基因和载体P
4
B．为防止载体E自身环化，可选用XhoⅠ和 PstⅠ对重组载体 P 和载体 E 进行酶切
C．载体E中的a 是终止密码子序列，其作用是使转录在所需要的地方停下来
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体 E成功导入受体细胞
题型三 PCR技术及其应用
11．[新情境]RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚合酶链式反应（PCR）
相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
A．过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中碱基配对方式相同B．图中A、B两种引物在72°C时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个
12．PCR技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称
为引物的Tm值。下列叙述正确的是（ ）
A．引物与模板链的结合属于延伸过程
B．变性过程的温度一般要低于复性过程
C．复性过程的温度应设置为略低于Tm值
D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合
13．[新情境]双脱氧测序法是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP
进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比
较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA
聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延
伸终止；若配对的为dATP，继续延伸。
A．上述PCR反应体系中模板链需要足够多 B．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
C．5'－TAGTGCCCATC－3'为对照个体的一段序列 D．沿电泳方向，核苷酸链长
度逐渐减小
14．关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．PCR体系中G-C碱基对含量将影响使DNA解链的所需温度
B．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
C．扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
D．待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA跑出凝胶
15．Sanger测序是一种用于确定DNA序列的经典方法。核心原理是在DNA复制过程中引入一种特殊的化学
物质——ddNTP来中断DNA链的延伸。遵循碱基互补配对原则，ddNTP与dNTP均能结合在延伸的子链上，
当ddNTP结合在子链上时，DNA合成终止。对得到的长短不一的DNA片段进行凝胶电泳，即可确定序列信息。其过程如下图所示，下列说法错误的是（ ）
A．离心管中除加入图中所示物质外，还需加入耐高温的DNA聚合酶、含Mg2+
B．ddNTP掺入子链导致DNA合成终止的原因是其3'端无-OH，无法形成磷酸二酯键
C．根据电泳结果可知待测序列为5'-CGTGACGCTA-3'
D．dNTP既可以作为DNA复制的原料，也可为DNA复制提供能量
题型四 蛋白质工程的原理和应用
16．[新情境]人工智能（AI）技术通过大数据分析、机器学习、深度学习等方法，为生物医药研究、药物
开发、临床诊断和治疗等带来革命性的变化。下列关于AI技术在生物医药领域的应用，下列叙述错误的是
（ ）
A．AI技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，且基因序列中不包含启动
子和终止子
B．AI技术通过智能穿戴设备和移动应用程序可实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相
应的诊断和治疗建议
C．AI技术对大量的基因组数据进行处理和分析，可以识别疾病相关的基因突变，为精准医疗提供支
持
D．AI技术对大量的蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，
该过程属于蛋白质工程技术
17．科学家利用现代生物技术将小鼠单克隆抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的抗体上，获得的人鼠嵌
合抗体引起的免疫副作用显著降低。制备人鼠嵌合抗体需要从根本上改造（ ）
A．小鼠单克隆抗体 B．抗体合成基因
C．人体特异性抗体 D．编码抗体的mRNA
18．天然β淀粉酶耐热性差，不利于工业化应用。研究人员将某种天然β淀粉酶的第476位天冬氨酸替
换为天冬酰胺后，其耐热性明显提升。下列叙述正确的是（ ）A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．该改造首先要预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，这是因为结构与功能相适应
C．该工程根据中心法则推断出的新的天然β淀粉酶的脱氧核苷酸序列是唯一的
D．该改造过程是在分子层次上进行的，要对天然β淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造
19．AlphaFold是一个人工智能程序，它能通过深度学习技术来预测蛋白质的三维结构。 经过多轮的预测
和调整后，AlphaFold最终生成一个高精度的三维模型。 用AlphaFold研究蛋白质时不需要人为提供
（ ）
A．氨基酸的种类 B．氨基酸的排列顺序
C．氨基酸的数量 D．氨基酸的组成元素
20．[新情境]控制合成凝血因子Ⅷ的基因主要在肝脏中表达，A型血友病是凝血因子Ⅷ基因发生突变，导致
凝血因子Ⅷ含量降低或功能异常所致。研究人员发现，用丝氨酸替换凝血因子第309位的丙氨酸，可以增
加凝血因子Ⅷ的分泌量，从而达到基因治疗的目的。下列相关说法错误的是（ ）
A．对凝血因子Ⅷ的改造属于蛋白质工程，需要在分子水平对基因进行操作
B．基因工程和上述改造工程的相同点之一是均只能生产自然界存在的蛋白质
C．进行基因治疗时需要将改造后的凝血因子Ⅷ基因构建的表达载体导入患者肝细胞中
D．通过选择肝脏特异性启动子，可以实现凝血因子Ⅷ基因只在肝细胞中特异性表达
1．（2025·云南曲靖·一模）酒精是高中生物学实验中常用的化学试剂，在不同实验中可能有不同的作
用，下列叙述正确的是（ ）
A．“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，酒精只能用来冲洗卡诺氏液
B．“绿叶中色素的提取和分离”实验中可用95%的酒精直接提取色素
C．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，可用95%的酒精初步分离DNA和蛋白质
D．“检测生物组织中的脂肪”实验中，常用50%的酒精使组织细胞相互分离
2．（2025·福建厦门·一模）RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚合酶
链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）A．过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中碱基配对方式相同
B．图中A、B两种引物在72°C时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个
3．（2025·广东深圳·一模）为探究DNA片段P与O 蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P不同位点的
2
突变体M、M 和M，用O 蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。
1 2 3 2
下列分析正确的是（ ）
注：“－”表示未添加，“+”表示添加，指示探针的浓度很低
A．条带1越宽说明O 蛋白与待测物的结合越强
2
B．显示条带2就说明O 蛋白与P无法结合
2
C．M 的突变位点几乎不影响O 蛋白的结合
1 2
D．M 和M 与O 蛋白的结合强度相同
2 3 2
4．（2025·湖北武汉·一模）PCR技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成
的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值。下列叙述正确的是（ ）
A．引物与模板链的结合属于延伸过程
B．变性过程的温度一般要低于复性过程
C．复性过程的温度应设置为略低于Tm值
D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合5．（2025·山东菏泽·一模）肝脏是生物实验中的常见材料。下列关于肝脏操作处理与目的不相符的是
（ ）
A．在离心后肝脏研磨液的上清液中加入等量冷却的酒精溶液——粗提取DNA
B．向2mL过氧化氢溶液中滴入2滴肝脏研磨液——检测过氧化氢酶的催化效率
C．在25mL肝匀浆中滴入5滴HCl溶液后测pH——比较不同pH下酶的活性
D．在2mL鲜肝提取液中先后加入双缩脲试剂A液1mL和B液4滴——检测蛋白质
6．（2025·四川巴中·一模）科学家发现一未知DNA分子，该DNA分子存在多种限制酶切位点。研究人员
利用三种限制酶对该DNA分子进行不同的酶切处理，将处理后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图
所示。据图推断，下列选项最可能为该DNA分子原始图谱的是（ ）
A． B．
C． D．
7．（2025·新疆·一模）cDNA文库是利用某一生物体特定发育时期细胞内的mRNA为模板，合成互补单链
cDNA，再以单链cDNA为模板合成双链cDNA，将这些双链cDNA片段插入到适当的载体中，再转入宿主细胞
所构建的文库。从cDNA文库中可筛选出所需要的目的基因片段。下列叙述不合理的是（ ）
A．构建cDNA文库过程中需使用逆转录酶、限制酶和DNA聚合酶
B．从不同组织细胞中提取的mRNA建立的cDNA文库不完全相同
C．通过定向改变cDNA序列进而改造蛋白质结构属于蛋白质工程
D．从cDNA文库中筛选出的目的基因与真核生物中的原基因相同8．（2025·陕西西安·一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的
叙述，正确的是（ ）
A．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关
B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．选用植物细胞提取DNA时，研磨后用滤纸进行过滤
D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
9．（2025·河北·一模）科学家为了探究光呼吸的关键基因——羟基丙酮酸还原酶编码基因(NbHPRI基
因) 的表达模式，通过PCR扩增的手段克隆得到NbHPRI 基因5'端上游的启动子序列。通过构建融合表达
载体并进行农杆菌遗传转化，获得NbHPRI启动子驱动的GUS基因的转基因材料。染色结果表明，在本氏烟
草的上胚轴、叶中均检测到GUS信号，其中叶片的表达量较高。用到的质粒如图所示，质粒的相关信息如
表。回答下列问题：
启动子 无
复制子 pVS1 oriV、ori
终止子 NOS terminator
质粒大小 10657 bp
原核抗性 KanR(卡那霉素抗性)
真核抗性 HygR(潮霉素抗性)
(1)研究表明，光呼吸的其中一个作用在于它可以消耗过剩的NADPH和ATP， 据此推测，光照
(填“过强”或“过弱”)时容易发生光呼吸。
(2)启动子的作用是 ，本实验中PCR扩增时要根据 设计引物。(3)构建基因的表达载体时，需要将启动子连接在GUS基因的 端，科学家利用限制性内切核酸酶
PstI、EcoRI对pCAMBIA1391进行双酶切，其优点有 。
(4)GUS基因就是β-葡萄糖苷酸酶基因，以X-Gluc作为反应底物，可将X-Gluc水解生成蓝色产物，所以
GUS基因属于表达载体中的 ，在分子水平，检测GUS的方法为 。
(5)利用农杆菌转化植物的原理是 ，可用 基因烟草。
10．（2025·山东菏泽·一模）北京紫眼果蝇（基因型hh）是从野生型红眼果蝇（基因型HH）中分离出来
的隐性突变体。对控制果蝇眼色的H、h基因进行了相关研究。F1、F2、F3、P1、P2、P3这六种引物及H
基因结构如图1所示。
(1)为获取h基因，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA作为 ，用图1中F1、P1作为引物进行PCR，推
测这对引物中与α链结合的引物碱基序列为5’- -3'（写出前6个碱基），扩增得到的DNA片段长
度超过7000bp，说明北京紫眼的h基因是由于H基因中插入外来片段形成的。
(2)根据图1，运用PCR继续探究突变位点在H基因上的大致位置，简要写出实验思路： 。
(3)为验证H基因突变是北京紫眼性状产生的原因，运用UAS-GAL4转基因体系将H基因导入北京紫眼果蝇
中，流程如图2。GAL4基因的表达产物是一种转录因子，UAS是一段特殊的具有调控功能的DNA片段。UAS
上有GAL4蛋白的结合位点，只有当GAL4和UAS存在于同一个体时，GAL4才能激活与UAS相连接的下游基
因的转录。
①H基因在品系1、2中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，H基因应该插入到位点 （填
“a”、“b”或“c”）。
②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，品系1和品系2杂交的F 代中红眼果蝇所占比例
1
为 ，F 代红眼果蝇雌雄杂交得到的F 代中红眼所占比例可能为 。
1 2
11．（2025·广东汕头·一模）成骨不全症(OI)是一类病因复杂的遗传性骨疾病，可由仅位于X染色体上
的PLS3基因发生突变引起。研究人员对某一OI家系(下图)进行研究，以探索该病的遗传方式和致病机理。回答以下问题：
(1)研究人员分别提取Ⅱ 、Ⅱ 、Ⅲ 多种体细胞的mRNA，在 酶作用下合成cDNA，之后利用
2 3 1
特异性地对PLS3基因的cDNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行电泳鉴定，结果如下图a。
(2)据图a分析，成骨不全症(OI)的遗传方式为 ；若Ⅱ 、Ⅱ 计划生二胎，在不考虑新发突变
2 3
的情况下，二胎患OI的概率是 。
(3)临床观察发现，Ⅲ 的患病程度比相同病因的男性患者轻，原因可能是 。采用抗原-抗体杂
1
交技术对特定对象体细胞(多种)中的PLS3蛋白进行检测，请补充图b横线处的相关信息，并在电泳图中将
对应的位置涂黑以证明该猜测正确 。
12．（2024·湖南·一模）柑橘是广受欢迎的水果之一，无核是其作为鲜食水果的优良经济性状之一。柑
橘为雌雄同株植物。位于线粒体DNA上的雄性不育基因CMS使植株形成无核果实（传粉受精后，种子不能
正常发育导致无核）。位于染色体上的一等位基因R和r对育性起调控作用，其中R可以让育性恢复使植
株产生有核果实，r无此效应。研究人员通过设计特定的引物对不同品种的柑橘细胞的DNA进行PCR，然后
检测细胞中CMS和R基因的数量，结果如表所示。
品
A B C D E F
种
CM
+ + + — — —
S
+ +
R + — + —
+ +
注：“+”代表有此基因及数量，“—”代表无此基因。(1)CMS基因的遗传 （填“遵循”或“不遵循”）分离定律。利用PCR技术扩增CMS基因和R基因
需要设计 对引物。
(2)表中所列的六个品种中结无核果实的是 （填字母）。
(3)等量品种C与品种D间行种植，随机授粉。收获C植株上所结的全部F，理论上其体细胞中
1
（填“有”或“无”）CMS基因，核基因型为 。D植株上收获的果实中，有核果实所占的比例为
。
(4)培育三倍体是获得无核品种的另一条有效途径，科研工作者以二倍体柑橘为母本，以四倍体柑橘为父
本培育了57株三倍体柑橘。用分子标记技术对亲本及子代群体进行PCR扩增及凝胶电泳，结果如下图所示。
若父本产生配子时染色体随机组合，两两分离，则母本和父本的基因型分别为 ，理论上F 的基因
1
型及比例为 。
1．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵
母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1
次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序
列，如图所示，回答下列问题：
(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳
分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同
试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。
(2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是
__________。
A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染
B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点
C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝
D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连
接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR
产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二
次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2 B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和
P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基
因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用
酿酒酵母高效合成甘油的目的。
2．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验
模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，
同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，
恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题：注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的
M基因称为floxM。
(1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于
引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，
连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，
需要限制酶切割载体后，再进行 。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。
(3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/
+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交
后最终获得基因型为 实验模型小鼠。
(4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动
子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。
3．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出
现多重抗药性Sa。
(1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。
(2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1
构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，
并发生交换）敲除Sa的R基因。①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，
再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。
②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培
养获得含质粒2的Sa单菌落。
③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛
选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，
若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。
④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已
被敲除的是 。
4．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。回答下列问题：
(1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，
应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因
是 。
5．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产
等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题：
(1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用
于制作果酒等。
(2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。
(3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有
和 。
(4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相
关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是 ，预期菌株
A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为 。(5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了
XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，
且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路 。
6．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP 片段插入pET-SOD
50
构建重组质粒pET-SOD-ELP ，以融合表达SOD-ELP 蛋白，过程如图1。其中，ELP 是由人工合成的DNA
50 50 50
片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答
下列问题：
(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。
(2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含
有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP 的大肠杆菌，应选用的一对引物是
50
。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP 蛋白。已知蛋白质中氨基酸
50
残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP 蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP 蛋白纯化效果
50 50
的影响，部分结果如图3。
（ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。
（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。
（ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP 蛋白的优点有 。
50
7．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建
过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌
体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因）(1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程
中，用于繁殖F 的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，
1
诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，
经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。
(2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1的原理，若将图2中所有
基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是 （填序号）。
(3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相
同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合
的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。
8．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国
研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基
因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19
图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳
时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农
杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因
S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子
大的原因是 。
9．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基
因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡
萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。
检测用菌
蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中）
株
野生型 + + +
野生型 — — —
突变体 + — —
转基因菌
+ + +
株
回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定
的指标是 （答出1点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组
DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩
增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基
因序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV
基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
10．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组
织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包
含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表
达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图
B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活
报告基因的表达（图C）。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR
扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的
插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其
在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是
基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载
体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应
检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕
获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因
功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
