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大题05 生物技术与工程
内容导航
【命题解码·定方向】命题趋势+3 年高考真题热点角度拆解
【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式
【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分
命题
·
趋势
·
定位
1.重过程推演：从“识工具”转向基因工程四步流程的时序推导、单克隆抗体制备的链式逻辑、发酵条件
的动态优化机制推导。
2.重层级差异：基因水平操作+细胞水平培养/个体水平筛选/群体水平发酵叠加，强化微观操作与宏观产
出间的尺度转化考查。
3.重信息转译：以质粒图谱与限制酶切位点、PCR 扩增曲线、细胞融合筛选示意图、发酵参数变化表为核
心载体。
4.重综合关联：与疾病诊疗、作物育种、环境修复、生物制药、伦理安全深度融合，突出科技向善与社会
责任。
热点
·
角度
·
拆解
热点角度01 基因工程
的操作流程与表达载体
构建及筛选应用
2025·黑吉辽蒙：限制酶选择、PCR 原理、目的基因检测鉴定、基因表达载体构
建；
2024·黑吉辽蒙：DNA 粗提取和鉴定实验及基因工程和蛋白质工程技术。
2023·辽宁：蛋白质工程技术，基因工程技术的基本步骤；
热点角度02 微生物工
程与代谢调控及合成生
物学应用
24-25 高三上·吉林·月考：分离提纯葡萄皮上的野生酵母菌；微生物培养及技术过
程。
25-26 高三上·黑龙江哈尔滨·期末：本题目以黄皮甜米酒酿造为背景，结合流程
图、实验数据折线图考查发酵工程原理。图片中两张折线图分别展示了不同酵母
接种量对酒精度和还原糖含量的影响。
1
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热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用
析典例
·
建模型
1.（2025·黑吉辽蒙）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外
源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询基因N 的编码序列，设计特定引物。如图1 所示，a 链为转录模板链，为保证基因
N 与质粒pYL 正确连接，需在引物1 和引物2 的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR 扩
增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA 片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基对），
假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4 号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1 和引物2 进行PCR 扩增，电泳
PCR 产物，结果如图2。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR 反应
中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理
由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨
酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA 等。a 是诱变第240 位脯氨酸编码序列的引物（GCA 为诱变序列），
b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a 的配对模板相同。据此分析，丙氨酸
2
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的密码子除GCA 外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的
改造方案。
研考点
·
通技法
限制酶选择策略：
解题步骤
核心分析要点与决策逻
辑
关键知识依据与规范作答
1. 分析目的基因
酶切位点
首先确认目的基因两端
的限制酶切点分布情况
• 完整性原则：选择切点位于目的基因两端的限制酶，避
开基因内部的切点
• 优选双酶切：使用两种不同限制酶分别切割两端，避免
单酶切导致的自身环化和反向连接
2. 分析质粒载体
结构
检查质粒上的酶切位点
分布与关键元件位置
• 保护关键元件：确保酶切位点不破坏启动子、终止子、
复制原点、标记基因
• 插入位置正确：保证目的基因能插入启动子与终止子之
间的合适位置
3. 考虑同尾酶替
换
当质粒无合适酶切位点
时考虑同尾酶替代方案
• 识别同尾酶：能产生相同黏性末端的不同限制酶（如
BamHⅠ和BglⅡ）
• 替换条件：质粒上无对应酶切位点或该位点不可用时，
可用同尾酶替换
4. Ti 质粒特殊要
求
植物转基因工程中需考
虑T-DNA 区域限制
• 必须插入T-DNA：农杆菌转化时，目的基因必须插入Ti
质粒的T-DNA 片段内
• 选择合适质粒：选择T-DNA 区域有合适酶切位点的Ti 质
粒变体
解题流程图示
目的基因分析 → 质粒结构分析 → 同尾酶替换判断 → Ti 质粒特殊要求
↓ ↓ ↓ ↓
保护基因完整 保护关键元件 末端兼容性 T-DNA 内插入
双酶切优选 正确插入位置 解决位点冲突 农杆菌转化兼容
备考锦囊
1. 优先级别：基因完整性 > 质粒元件保护 > 双酶切 > 单酶切
2. 快速判断：看到"避免自身环化" → 立即选择双酶切方案
3. 特殊记忆：植物转基因必选T-DNA 内有切位的Ti 质粒
4. 易错提醒：同尾酶产生的末端可连接，但原酶切位点可能消失
3
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破类题
·
提能力
1．（2026·辽宁抚顺·一模）条锈病是小麦的一种常见疾病，不仅会直接影响产量，更会对品质、种植成本
甚至生态环境造成深远影响。科研人员从野生二粒小麦等近缘种中找到广谱抗病基因Yr15，并欲通过基因
工程获得抗条锈病小麦。基因Yr15 及质粒的结构如图所示，相关酶的识别序列及酶切位点如表所示。回
答下列问题：
注：LB/RB 为T-DNA 的边界序列，
为卡那霉素抗性基因。
(1)科研人员利用获得的基因Yr15 的mRNA 通过___________过程获得目的基因，并通过___________技术
对目的基因进行扩增。
(2)已知不同平末端携带的化学基团不同，这导致平末端的连接具有特异性，需要由不同的DNA 连接酶催
化完成。为了将切割后的目的基因Yr15 同质粒连接形成重组质粒，需要使用SmaⅠ和___________(填表格
中限制酶)对质粒进行切割并将切割后的黏性末端补齐为平末端，不使用另外一种限制酶的原因是
___________。若只使用SmaⅠ连接目的基因和质粒，则弊端是___________。
(3)据图可知，可将导入重组质粒的小麦组织细胞放入含___________的培养基中进行初步筛选，为了使愈
伤组织朝着人为既定方向分化，通常可通过调整___________的含量来实现。
热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用
析典例
·
建模型
1.（25-26 高三下·辽宁·开学考试）研究者利用蛋白质从头设计策略，合成并筛选能与胰岛素受体结合的胰
岛素受体激动剂，如图所示。其中，荧光探针是被荧光标记的蛋白，在与靶蛋白结合后可发出荧光；Aga2
蛋白与膜锚定，使目标蛋白展示在酵母表面。回答下列问题：
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(1)构建重组表达载体时，需先用限制酶NheI 和BamHI 分别切割_____，再用_____酶处理，形成重组质粒。
切割后两者产生的_____末端可互补配对，避免质粒自身环化和_____。
(2)转化后的酵母菌先接种于CTUG 培养基中增殖，再转移至SGCAA 培养基中进行诱导表达，推测培养基
CTUG 和SGCAA 成分的主要差异是_____。
(3)荧光探针Y（通常为荧光标记的胰岛素受体或其关键结构域）与目标蛋白结合，目的是筛选出_____。
(4)若将该实验中的酵母菌换成大肠杆菌（原核生物），则目标蛋白可能无法正常发挥作用，原因是大肠杆
菌缺乏_____，不能对目标蛋白进行复杂的_____。
研考点
·
通技法
1.发酵工程的基本环节
基本环节
核心操作要点
菌种选育
筛选、诱变或通过基因工程获得性状优良的生产菌种
培养基配制
根据菌种需求，配制包含碳源、氮源、无机盐、水等的营养物质，并进行灭菌处理
灭菌
对培养基、发酵罐及所有管路、空气过滤系统进行严格灭菌，杜绝杂菌污染
扩大培养
将保存的菌种经活化后，逐级转移到种子罐中，以获得足够数量和活力的菌种
发酵过程
（中心环
节）
将种子液接种至发酵罐，严格控制温度、pH、溶氧量、营养物质流加等条件，维持菌体生长
和产物合成
分离提纯
发酵完成后，通过过滤/离心分离菌体，再采用沉淀、萃取、层析等方法获取并纯化目标产
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基本环节
核心操作要点
物
2.基因工程 vs. 蛋白质工程：
解题步骤
核心分析要点与决策逻辑
关键知识依据与规范作答
1. 审题定位，明确
操作对象
仔细阅读题干，明确题目描述的
技术操作是针对基因序列本身，
还是针对蛋白质的功能与结构。
关注关键词：
• 基因层面操作：如“切割”、“连接”、
“载体构建”、“导入”。
• 蛋白质层面目标：如“改良蛋白质特性”、
“设计新功能蛋白”。
2. 分析基因序列是
否被“实质性改造”
（核心判断标准）
判断对目的基因的操作是“照
搬”天然序列，还是进行了“人
工设计”的修改。
• 基因工程：未改变编码序列。仅将天然的基
因序列从生物体中“剪切”下来，或仅对其调
控序列（如启动子）进行加工。
• 蛋白质工程：改变了编码序列。对编码蛋白
质的序列进行了定点改造，如碱基的替换、增
添或缺失，以改变蛋白质的氨基酸序列。
3. 分析最终产物的
性质（辅助判断标
准）
判断最终生产出的蛋白质是自然
界已存在的，还是人工创造的新
蛋白质。
• 基因工程：生产的是天然蛋白质。例如，利
用工程菌生产人的胰岛素，胰岛素本身是天然
存在的。
• 蛋白质工程：生产的是非天然蛋白质或改造
蛋白。其产物与天然蛋白质在结构、功能上存
在差异，甚至是自然界中原本不存在的蛋白
质。
4. 综合判断，得出
结论
结合以上两个维度的分析，对技
术类型做出最终判断。
决策逻辑：
1. 如果基因序列未被改造且产物是天然蛋白质
→ 基因工程。
2. 如果基因序列被定向改造，旨在获得新型蛋
白质 → 蛋白质工程。
备考与易错点提醒
1. 核心关系：蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。蛋白质工程的实施，最
终必须通过改造基因来实现，因此它依赖于基因工程技术。
2. 快速判断题：
o
看到“定向改造”、“优化性能”（如提高酶的热稳定性）、“设计新蛋白”等表述，优
先考虑蛋白质工程。
o
看到“剪切目的基因”、“表达天然蛋白”等表述，优先考虑基因工程。
3. 易错点：不要因为操作过程复杂就误判为蛋白质工程。关键看编码蛋白质的基因序列是否被人工定
向修改。
破类题
·
提能力
1．（2026 高三上·吉林·月考）某研究小组分离提纯葡萄皮上的野生酵母菌时，选取了从自然界中采集到的
葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中进行培养。请回答下列问题：
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(1)该研究小组成功分离出某品种的酵母菌后，取等量菌液分别接种于3 个盛有等量液体培养基的锥形瓶中,
并分别置于转速为150 r/min、200 r/min、250 r/min 的摇床上培养，检测结果如图1 所示，摇床转速为250
r/min 的酵母菌种群密度大的原因是____________。
(2)图2 是采用血细胞计数板直接计数和稀释涂布平板法计数两种方法计数培养液中酵母菌数量时得到的结
果，其中采用稀释涂布平板法计数得到的是曲线______，下列判断依据中正确的有______（填序号）。
①稀释涂布平板法只计数活的酵母细胞，死细胞无法形成菌落
②采用血细胞计数板直接计数时，可能会将死细胞与活细胞一起计数
③采用稀释涂布平板法计数时，两个或多个细胞连在一起时，只能观察到一个菌落
④采用稀释涂布平板法计数时，可能因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
(3)通过如图3 所示的方法进行纯化培养时，用移液枪取最终的酵母菌稀释液0.1mL 滴在培养基表面，然后
将沾有少量酒精的涂布器______后再进行涂布。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的3 个平板上
菌落数分别为69 个、52 个、44 个，则可以推测原酵母菌液中每毫升含菌数为______个。计数一般要选取
____________进行计数。
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（建议用时：75 分钟）
刷模拟
1．（2026·辽宁·一模）红富士是我国北方广泛栽培的苹果优良品种，但容易感染苹果轮纹病菌。研究人员
发现一种扩展蛋白基因MdEXPA8 与苹果果实细胞壁的扩展和生长发育密切相关。为探究MdEXPA8 蛋白
在苹果生长发育及抗病性中的作用，现以红富士苹果为实验材料，利用MdEXPA8 基因以及超量表达启动
子，构建超量表达载体，并最终获得转基因植株用于研究。回答下列问题：
(1)从苹果细胞中提取mRNA，在______酶的作用下可获得互补DNA（cDNA）；mRNA 3′端的poly-A 尾是
由12～18 个腺嘌呤核糖核苷酸重复组成，获得cDNA 时需要向反应液中加入由12～18 个连续的胸腺嘧啶
脱氧核苷酸组成的短单链核酸，其功能是____________；随反应进行溶液中含量逐渐减少的物质有
____________。
(2)建构超量表达载体时所用质粒的结构如图所示。获得的cDNA 两端没有限制酶的切割位点，则在进行
PCR 扩增时，应该在上游和下游引物的______端分别添加______（填限制酶的名称）的识别序列；转化成
功后欲用Bar（抗除草剂基因）筛选出可超量表达MdEXPA8 蛋白的苹果植株，则应该将Bar 基因插入图中
载体的位点______（填“1 处”或“2 处”）。
(3)获得转化成功的苹果体细胞后，利用植物组织培养技术获得转基因植株，此过程中需要调整培养基中
_______（填植物激素的名称）的浓度配比，以有效调控愈伤组织的形成及生芽或生根。
(4)研究结果表明MdEXPA8 基因超表达的植株对轮纹病菌更敏感，结合MdEXPA8 蛋白的作用，形成该结
果的原因可能是__________。
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2．（2026·辽宁·模拟预测）研究人员利用农杆菌转化法将大豆耐盐碱基因GsERF6 导入水稻，构建重组表
达载体（图甲），并对转化后的细胞进行目的基因检测（图乙）。回答下列问题：
(1)利用农杆菌转化法时，将目的基因插入Ti 质粒的_____上；需将含GsERF6 基因的重组Ti 质粒导入农杆
菌，再让农杆菌侵染水稻细胞，最终使GsERF6 基因进入水稻细胞并整合到水稻细胞的_____上。
(2)构建图甲所示的重组表达载体需要的酶是______，该表达载体中的强启动子的作用是________。新霉素
抗性基因属于_____，其作用是________。
(3)对转化细菌进行目的基因检测时，常采用PCR 技术，该技术需要_______（填一种酶）。结合图乙结果
分析，转基因水稻DNA（泳道1）中_____（填“含有”或“不含有”）GsERF6 基因，判断的依据是
_______。
3．（2026·辽宁·三模）pdx1 蛋白是决定胰岛形成的最为关键的蛋白质。为验证其作用，科研人员以斑马鱼
为模式生物，先获得在胰岛细胞中特异性表达GFP（绿色荧光蛋白）的转基因斑马鱼（G 品系），特异性
敲除G 品系的pdx1 基因，获得N 品系斑马鱼。研究过程如下：
(1)利用PCR 扩增GFP 基因时，引物的作用是________，通过______方法检测扩增产物。
(2)构建基因表达载体时，需先将______的启动子与GFP 基因相连，再与质粒相连，该步骤的目的是使GFP
基因能够在斑马鱼的细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，且在______细胞中特异性表达。
(3)将构建好的重组质粒通过______法导入斑马鱼的______中，然后再通过早期胚胎培养等技术获得转基因
斑马鱼G 品系。
(4)为鉴定GFP 基因插入的位置，针对插入位点的上下游设计了引物1、2，针对GFP 基因自身序列设计了
引物3、4，各引物的位置如图1 所示。将G 品系斑马鱼相互交配，提取不同子代个体的DNA 用引物1、2
进行PCR 并电泳，结果如图2 所示，加样孔______（填编号）对应的个体是纯合G 品系斑马鱼。若改用引
物3、4 进行PCR 并电泳，结果如图3 所示，加样孔______（填编号）对应的个体是纯合野生型斑马鱼。
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(5)CRISPR-Cas9 技术能特异性敲除基因。先制备针对pdx1 基因的CRISPR-Cas9 体系，然后导入G 品系斑
马鱼。若筛选获得了1 个pdx1 突变品系（N），经测序得到了如图4 所示的序列（图中“—”表示缺失1
个碱基）。请预计突变品系N 的pdx1 蛋白含______个氨基酸（已知密码子：CCU—脯氨酸；UAA、UGA
和UAG 为终止密码子）。
(6)目前科学家们通过蛋白质工程还制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出
蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是______（选填序号）。
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列
③表达出蓝色荧光蛋白
④蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）
4．（2026·甘肃天水·二模）在培育转基因抗虫作物过程中,单一抗虫基因会引起害虫抗药性问题。为提高作
物的抗虫性,研究人员提取苏云金芽孢杆菌的抗虫蛋白基因Cry1A．301 和Vip3A 进行融合,培育抗虫作物,其
具体过程如图。回答下列问题:
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(1)①过程需要使用___________酶。引物P2 和引物P3 之间碱基序列的特点是必须有_________（填“相
同”或“互补”）片段。经图中PCR1 过程获得产物1 至少需要经过__________次扩增循环。
(2)重组质粒中启动子是_________,可驱动目的基因的转录。除图示信息外,重组质粒中还应该有
___________。为使②过程中融合基因能按正确方向插入质粒,需在引物P1 的__________端加上限制酶
________的识别序列。②过程需用到的工具酶,除限制酶外,还有_____________。
(3)通过酶切法和电泳对重组质粒进行鉴定,结果如图所示。泳道1、2 分别是用NcoⅠ切割质粒和重组质粒的
结果。若已知融合基因已整合到质粒上,请在图中泳道3 绘制出用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒所得的电泳
结果_______。（质粒上NcoⅠ和XhoⅠ识别位点间隔较近,长度可忽略不计）
(4)将重组质粒转入农杆菌后,应将该农杆菌置于含_______的培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。
为检测Cry1A．301-Vip3A 融合蛋白抗虫的效果,还需进行个体水平检测,请简述实验思路:__________。
5．（2026·辽宁·模拟预测）N 蛋白是牛冠状病毒（BCoV）蛋白中表达量最高的蛋白，它可以诱导机体产
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生抗病毒免疫应答，因此是早期快速诊断、疫苗研发的关键候选蛋白。为制备抗N 蛋白的单克隆抗体，科
研人员完成了以下过程。回答下列问题：
注：图中限制酶的识别序列和切割位点为：BamHⅠ：
，EcoRⅠ：
，SalⅠ：
。
(1)根据BCoV 扩增的全基因组毒株提取的RNA________出的DNA 为模板，以该DNA 为模板通过PCR 扩
增合成目的片段，PCR 中添加引物的作用是________。
(2)制备引物时需在引物A 和B 的________端分别添加________（填限制酶）的识别序列，该片段扩增4 次
循环，需要消耗引物________个。已知N 蛋白基因非模板链的碱基序列为
，写出N
蛋白基因上游引物的12 个碱基序列：
________
。
(3)琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR 产物的常用方法。下列说法正确的有________。
A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA 片段不易分离
B．若电泳出现多种条带，可能是因为引物过短
C．凝胶中加入核酸染料便于观察PCR 产物的电泳结果，电泳缓冲液应没过凝胶
D．两条泳道中电泳条带的位置相同，则两个加样孔内加入的样品相同
(4)过程②将目的基因导入骨髓瘤细胞的方法是________，过程③中利用选择培养基筛选时，________细胞
都会死亡。
(5)图中过程④可通过体内（或体外）培养获得大量抗N 蛋白单克隆抗体。与传统的从血浆中提取的抗体相
比，抗N 蛋白单克隆抗体的优点是________。
6．（2026·黑龙江吉林·二模）抗体是由两条完全相同的重链（H 链）和两条完全相同的轻链（L 链）连接
而成的，两种链近N 端可变区（V 区），识别结合抗原，近C 端是恒定区（C 区），结构如图1 所示。人
表皮生长因子受体-2（HER2）基因和表皮生长因子受体（EGFR）基因是重要的癌基因，在多种肿瘤中共
表达，且互相作为旁路耐药通路，大大影响了传统抗体-药物偶联物（ADC）疗法的治疗效果。为了解决这
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一问题，科研人员构建了双特异性抗体偶联药物（BsADC），同时靶向肿瘤细胞表面HER2 和EGFR，实
现了对传统ADC 疗法的升级。
(1)利用双杂交瘤融合法制备双特异性抗体（如图2）。以传统的单克隆抗体技术制备分别能产生HER2 抗
体和EGFR 抗体的杂交瘤细胞，再将两种杂交瘤细胞融合，需对融合细胞进行_______和抗体检测，与抗
原_______出现阳性反应的即为目标细胞。但是此技术制备出的双特异性抗体仍具有较大的随机性，原因
是_______。
(2)利用蛋白质工程技术制备双特异性抗体：将HER2 抗体和EGFR 抗体的轻链与重链可变区DNA 序列，
通过重叠延伸PCR 技术连接在一起，如图3。
根据图4 所示的重叠延伸PCR 技术原理，为实现DNA 片段的精准融合，引物P2 的5＇端需要与引物P3 的
_______端（填“5＇”或“3＇”）序列_______（填“相同”或“互补”）。按照上述原理合成图3 所示
重组DNA 需要设计_______种引物。将融合序列与质粒连接，导入酵母菌获得纯度较高、装配正确的双特
异性单链抗体。与大肠杆菌相比，酵母菌作为受体细胞的优势是_______。还需要根据酵母菌偏好的密码
子对融合序列进行优化，目的是_______。
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(3)HER2 与EGFR 在多种肿瘤组织中分布不均匀，单靶点治疗可能因无法有效清除低表达靶点的肿瘤细胞，
从而诱导适应性耐药及疾病复发。ADC 由抗体、接头、药物所组成，其中的“药物”可以是_______、化
学药物或放射性物质。与只使用一种单克隆抗体构建的ADC 相比，利用HER2-EGFR 双抗构建的BsADC
的优势在于_______（答出一点即可）。
7．（2026·吉林·模拟预测）吉林省是东北亚重要的陆路口岸，近几年出现了输入性疟疾病例。疟原虫感染
人体后，疟原虫的pfcrt 基因编码的蛋白第76 位氨基酸（赖氨酸→苏氨酸）的突变会使疟原虫获得对氯喹
的抗药性。为快速筛查氯喹抗性疟原虫，研究人员根据pfcrt 基因的序列，设计了F1、F2、R1、R2 四种备
选引物（见图甲），用于扩增目的片段。以疟原虫基因组DNA 为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙
所示，再将获得的产物用限制酶Dra Ⅰ（识别序列为5＇-AAATTT-3＇）处理。回答下列问题：
(1)PCR 扩增pfcrt 基因时，因参与合成反应，不断消耗而浓度下降的组分有_________。
(2)根据图甲和图乙信息，若要特异性扩增出包含完整Dra Ⅰ酶切位点区域的目的片段，应选择的引物组合
是________。据图可以判断泳道2（F1-R2 组合）的条带长度________（填“长于”或“短于”）泳道1
（F1-R1 组合）。导致两条带在电泳中迁移速率不同的直接原因是_______。
(3)已知敏感型pfcrt 基因序列中Dra Ⅰ酶识别位点处编码赖氨酸的密码子为AAA，而抗性型突变后此处变为
ACA（编码苏氨酸）。据此判断，Dra Ⅰ酶能切割________（填“敏感型”或“抗性型”）基因的PCR 产
物，原因是__________。
(4)在进行电泳鉴定实验时，将配制的琼脂糖溶液在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后加入适
量的________混匀。
8．（25-26 高三下·吉林长春·期末）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构
建质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
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(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有_____。
(2)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_____。
(3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_____（多选题）。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(4)质粒含有2 个EcoR Ⅰ、1 个Sac Ⅰ和1 个BamH Ⅰ的限制酶切割位点。已知BamH Ⅰ位点位于2 个EcoR Ⅰ位
点的正中间，用上述3 种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒，
泳道②③④条带为3 种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。泳道③可能是_____的单酶切产物（单
酶切产生2 个片段大小相同）。
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(5)对于电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____。
9．（2026·吉林延边·一模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高
温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了耐热性强的淀粉
酶AmyS2 基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1 所示。回答下列问题。
(1)科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27 位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶
（AmyS2），其研究基本思路如下：预期AmyS2 功能→设计目标蛋白的结构→________→找到并改变相
对应的脱氧核苷酸序列（基因）→将获得的基因导入芽孢杆菌生产AmyS2，要替换蛋白质基因中相对应的
碱基可以采用________法。
(2)根据图2 分析，利用PCR 技术扩增AmyS2 基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的________。若
将1 个基因扩增4 次，共需要引物________个。
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(3)将AmyS2 基因与原始质粒A 构建成质粒B，应选择的限制酶是________；将质粒B 与信号肽基因构建
成质粒C，应选择的限制酶是________。
(4)信号肽是一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链。据此推测，与质粒B 相比，在工业生产中使用
导入质粒C 的工程菌生产α-淀粉酶的优势是________，从发酵液中可采取适当的________措施来获得产品。
10．（25-26 高三上·吉林长春·期末）为利用拟南芥合成原人参二醇，需将原人参二醇合成途径中三个关键
酶的基因DS、PPDS、CYP450 作为目的基因导入拟南芥，所用Ti 质粒如图1 所示，图中每段阴影为一个
功能序列，其中bar 为抗草甘膦（一种除草剂）基因，TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基
因。BamHI、SmaI、BclI 为限制酶切割位点。
(1)传统构建基因表达载体的方法为先用限制酶切割质粒和含目的基因的DNA 片段，再用DNA 连接酶进行
连接。利用图1Ti 质粒构建重组质粒时，目的基因上游和下游应分别具有限制酶______的切割序列。进行
转化操作后的农杆菌中存在转入重组Ti 质粒的农杆菌、转入空Ti 质粒的农杆菌和未转入任何质粒的农杆
菌，需利用标记基因______筛选出转化成功的农杆菌。在对转基因拟南芥进行个体生物学水平鉴定时，需
利用的标记基因是______。
(2)为更好的构建含DS、PPDS、CYP450 基因的重组Ti 质粒，科研人员采用了In-Fusion 技术，如图2 所示。
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In-Fusion 技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA 序列（即同源序列，通常为
15-20bp），然后用In-Fusion 酶处理即可实现无缝连接。In-Fusion 酶是一种混合酶制剂，既能从任何线性
DNA 链的5’末端逐个切割下16 个脱氧核苷酸，形成黏性末端，也能将具有互补黏性末端的DNA 片段进行
连接。
①在对目的基因进行PCR 扩增时，除图示物质外，反应体系中还需要添加4 种脱氧核苷酸、______和
_______，扩增第______个循环开始出现目标产物。
②设计引物1、引物2 需要依据_______的碱基序列，设计引物A、引物B 需要依据_______的碱基序列。
③同源序列1 和同源序列2 通常采用不同的核苷酸序列，这样设计的优点是_______。
(3)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion 多片段重组技术的优势有_______（至少答出1 点）。
11．（25-26 高三上·内蒙古呼和浩特·期末）大豆Y 基因表达的蛋白可通过结合S 基因的启动子调控其表达，
进而影响大豆对干旱和盐胁迫的抗性。科研人员利用PCR 技术扩增Y 基因，并构建Y-GFP 融合基因表达
载体，用其转化大豆细胞研究Y 基因的功能。请回答下列问题：
(1)利用PCR 技术扩增Y 基因时，反应体系中需加入______，还需添加耐高温的DNA 聚合酶（Taq 酶）和
引物；PCR 的______阶段，引物会与Y 基因的模板链互补结合，该阶段的温度一般为50℃左右。
(2)下图所示Y 基因单链（部分）为转录的______（填“模板链”或“非模板链”）。为构建Y-GFP 融合
基因，需先通过PCR 技术剔除Y 基因终止密码子对应的碱基序列，再与绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼
接。已知EcoRI 识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI 识别序列为5'-GGATCC-3'，为使Y 基因正确接入载体
并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y 基因下游扩增引物应为5'-______……-3'（包括添加的限制酶识别序列，
共写12 个碱基）。
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(3)将构建的融合基因表达载体导入大豆愈伤组织细胞后，需在含______的培养基上筛选出成功转化的细胞，
并进行______信号检测。此外还需从目标细胞中提取蛋白质进行______，检测目的基因是否成功表达。
(4)研究发现过表达Y 基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性，S 基因
是大豆类固醇化合物合成的关键基因，结合题干信息分析，Y 蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是
______。
12．（2026·吉林长春·一模）斜纹夜蛾是危害大豆的主要害虫，该害虫体内的几丁质酶基因（Cht）表达产
物能帮助其降解植物细胞壁，从而利于幼虫取食。某科研团队计划通过基因工程结合基因编辑技术，培育
一种具有特定抗虫能力的大豆新品种，设计思路如下：
①将Cht 基因的启动子（负责响应害虫取食信号）与一种毒蛋白基因（Tox）连接，构建重组载体，并导入
大豆细胞。当斜纹夜蛾取食造成植物损伤时，伤口部位分泌的茉莉酸（一种植物信号分子）能诱导该启动
子驱动Tox 基因表达，产生毒蛋白杀死害虫。
②利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，敲除或修饰大豆自身的JAZ 基因（该基因能抑制茉莉酸信号通路），
以增强植株对茉莉酸信号的感知和响应效率，从而提升抗虫效果。
回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是_____。该步骤中，需用_______酶识别并分别切割Cht 基因的启动子和Tox 基因，
使二者产生相同的黏性末端，再用_______酶连接形成融合基因。
(2)茉莉酸诱导Tox 基因表达的机制是：茉莉酸与大豆细胞内的受体蛋白结合形成复合物，该复合物与
________基因启动子上游的特定响应元件结合，进而启动Tox 基因的转录。该设计的优点是____，从而减
少对大豆自身代谢的消耗，并降低对非靶标生物的影响。
(3)若要检测Tox 基因是否能在茉莉酸诱导下成功表达，可采用________技术检测大豆细胞中是否存在Tox
毒蛋白。
(4)利用CRISPR/Cas9 编辑JAZ 基因后，大豆的抗虫效果显著提升，原因是_______。
(5)与直接喷洒化学杀虫剂相比，该基因工程结合基因编辑的抗虫技术的优势是_______。
13．（25-26 高三上·吉林·阶段练习）动物器官移植到人体内（异种移植）或是解决全球器官紧缺的办法之
一。研究团队对猪肾内皮细胞进行基因编辑、改造后，得到了3 种工程细胞和可提供异种移植肾源的供体
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猪。具体流程及部分测量数据如图示。
(1)研究证实供体猪的3 个聚糖抗原基因（3KO）会引致人类、猴等受体的组织不相容。若以未经改造的猪
肾作为异体肾源进行器官移植，受体动物的______________细胞和抗体都有可能对供体器官产生特异性攻
击效应，导致出现______________现象。利用CRISPR-Cas9 编辑技术敲除肾内皮细胞的3KO，该技术需人
工设计一种“向导”RNA，其部分序列与3KO 的结合遵循________原则，并引导Cas9 蛋白断裂DNA 双链，
从而敲除3KO。
(2)研究表明7 个人类基因（7TG）可增加不同物种之间的兼容性。获取7TG 的方法有______（答出一种即
可）。
(3)为验证敲除3KO、插入7TG 对异体细胞的保护作用，研究者将三组细胞与受体猴血清共孵育，置于CO2
培养箱中培养，测量裂解细胞数如图b 所示。据此得出结论_______。
(4)供体猪器官常携带多种病毒，其中部分病毒潜在人畜传播风险。例如，已有实验证明PERV（猪内源性
逆转录病毒）可以整合到体外培养的人类细胞基因组中。试分析若给人进行异种移植，PERV 的基因可能
通过供体猪器官整合到人类基因组的途径是_________。因此，为确保安全，对已构建好的3KO。7TG。
细胞需要进行灭活PERV 处理，且在临床试行前须在动物模型中测试。
(5)利用3KO、7TG、RI 细胞通过过程④构建供体猪所利用的现代生物学技术有________（答出两种）。
14．（25-26 高三上·吉林松原·开学考试）为保护濒危植物普陀鹅耳枥（2n=16）并改良其生长特性，科研
人员尝试将其与同属近缘物种天台鹅耳枥（4n=32）进行体细胞杂交。已知普陀鹅耳枥具有抗虫基因A，
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但生长缓慢；天台鹅耳枥生长迅速且耐寒，但不抗虫。如图表示体细胞杂交过程，回答下列问题:
(1)a 过程获得原生质体所用的酶是________，该过程中发现普陀鹅耳枥的原生质体大量破裂，推测原生质
体破裂的可能原因有________。
(2)过程b 中可采用化学试剂________促使原生质体相互融合，成功融合的杂种细胞含________个染色体组。
杂种细胞形成的标志是________。
(3)成功培育的杂种植株（不考虑同种融合的植株）出现三种表型：①抗虫但生长缓慢 ②不抗虫但生长迅
速 ③抗虫且生长迅速但不耐寒。从细胞分裂角度分析，表型①和②的出现可能与______过程异常有关，
从基因表达调控的角度分析，表型③中耐寒性状缺失的原因可能是______。
15．（2026·黑龙江哈尔滨·一模）单个B 细胞抗体制备技术是近年来发展的快速制备单克隆抗体的新技术。
该技术利用“一个B 细胞只含有一个功能性重链可变区DNA 序列和一个轻链可变区DNA 序列，且只产生
一种特异性抗体”的特点，从免疫动物脾组织或外周血中分离出抗原特异性B 细胞，可通过单细胞PCR 技
术从单个B 细胞中扩增IgG 重链和轻链可变区基因，再将其导入哺乳动物细胞中表达，最终获得具有生物
活性的单克隆抗体。兔单抗以其高亲和力和多样性在基础研究和药物研发中颇受青睐。请结合下图回答问
题：
(1)对兔多次使用同种抗原进行刺激的目的是_______。
(2)抗原特异性B 细胞磁场分离技术核心步骤是：制备混合细胞悬液，目标抗原直接偶联磁珠，再放入磁场，
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利用抗原与B 细胞表面_________特异性结合的原理分离目标细胞，实现目标细胞富集。然后利用动物细
胞培养技术对单B 细胞进行_________，通过_______进行筛选。
(3)借助融合PCR 技术整合抗体轻链和重链基因，图2 过程设计的P2 和P3 引物的添加序列必须能够发生
_______。融合PCR 步骤1 中，至少进行_________次循环才能获得基因重链基因的PCR 产物。若要对重
链、轻链融合基因继续进行PCR 扩增，则图2 中的M、N 处位置所需要的引物分别是_________。
(4)图3 中电泳图中_________号条带最可能表示融合后片段，若PCR 没有扩增出任何产物，则可能的原因
是________（至少两点）。
(5)由图1 和图4 判断，构建重组基因表达载体，为保证目的基因的插入部位位于EF1A 启动子与SV40 late
pA 之间的表达框内（在Kozak 序列之后），切割质粒时不宜使用的限制酶是________。此外，不宜同时选
用酶SpeI 和XbaI，原因是__________。
16．（2026·黑龙江哈尔滨·一模）CRISPR/Cas 系统是目前最高效的基因组编辑工具之一。CRISPR-Cas9 包
含两种核心组分：一是行使DNA 双链切割功能的Cas9 蛋白，二是具有导向功能的sgRNA。sgRNA 上的支
架序列可结合Cas9 蛋白，sgRNA5'端的20 个碱基可与目标DNA 碱基配对，引导Cas9 靶向切割DNA（图
1）。
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利用该技术敲除小鼠胚胎干细胞的目标DNA 序列，操作步骤如下。请回答下列问题：
第一步：设计sgRNA5'端序列
5'-GUCACUCUCAUAUAGAGAUC-3'（20 个碱基）
(1)第二步：构建重组DNA
载体LentiCRISPRv2（图2）上含有限制酶BsmBI 的识别序列（N 代表任意一种碱基）：
5'-CGTCTCN↓-3'
3'-GCAGAGNNNNN↑-5'
①载体LentiCRISPRv2 上的一段序列（包含两个BsmBI 的识别序列）为：
5'-ACACCG GAGACG GTTGTA……TTTGTA CGTCTC TGTTTT-3'
3'-TGTGGC CTCTGC CAACAT……AAACAT GCAGAG ACAAAA-5'
请在上述序列中用“↓”“↑”标出BsmBI 的酶切位点_____。
②根据sgRNA5'端序列，设计两端带有黏性末端的双链sgDNA，以便直接连接到限制酶BsmBI 酶切后的载
体上。若其中一条链为5'-CACCGTCACTCTCATATAGAGATC-3'，则另外一条链的序列为_____。
A．5'-AAACGATCTCTATATGAGAGTGAC-3'
B．5'-CAGTGAGAGTATATCTCTAGCAAA-3'
C．5'-CACCGATCTCTATATGAGAGTGAC-3'
(2)第三步：转化与筛选
重组DNA 导入小鼠胚胎干细胞前，需先在大肠杆菌中进行扩增。将构建好的重组DNA 转入处于_______
的生理状态的大肠杆菌，用含________的培养基筛选含重组DNA 的大肠杆菌，再通过测序确定sgDNA 是
否正确连接到载体上。
(3)第四步：导入与编辑
将扩增后的重组DNA 通过一定的技术导入小鼠胚胎干细胞。sgRNA5'端的20 个碱基序列用来识别结合
______，载体LentiCRISPRv2 上还含有_______序列，该序列的转录产物可以与载体相应序列表达的Cas9
蛋白组装成CRISPR/Cas 系统，定点切割DNA 双链。在功能上，Cas9 蛋白属于_________酶。
(4)Cas9 切割DNA 后，基因编辑的完成依赖于细胞自身的修复机制，可不依赖任何模板，直接将断裂的
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DNA 末端连接起来。这一过程常会导致多个碱基的插入或缺失，造成目标DNA 序列发生_______，从而实
现目标DNA 序列敲除的效果。
17．（25-26 高三上·黑龙江哈尔滨·期末）甜米酒是我国的传统酒种，某酿酒厂以无核黄皮果（富含维生素、
有机酸及特殊的香味）为辅料研制出黄皮甜米酒，该酒具有消食、润肺和清热解毒等功效。制作黄皮甜米
酒的工艺流程如下图所示。回答下列问题：
(1)图中甜酒曲的主要作用是_______________。
(2)与传统发酵相比，现代发酵工程具有很多的优势，其基本环节一般包括菌种选育，扩大培养，培养基配
制，灭菌，__________，发酵，产品的____________________等。
(3)我国的酿酒技术历史悠久，古人在实际生产中积累了很多经验。《齐民要术》记载：“世人云：米过酒
甜，此乃不解法候。酒冷沸止，米有不消者，便是曲势尽。”下列有关叙述错误的是____。（单选）
A．“米过酒甜”是因为米中糖类物质过量，发酵停止时仍未被完全消耗
B．“酒冷沸止”说明微生物的代谢产热和释放CO2逐渐停止
C．“曲势尽”的原因可能是米酒中pH 或酒精含量升高
D．酿制米酒所用的主要微生物，其代谢类型为异养兼性厌氧
(4)对酒曲微生物进行分离纯化时，配制培养基的成分为蛋白胨、酵母提取物、NaCl、水，其中蛋白胨能为
细菌提供的主要营养是碳源、_________________。
(5)在制作黄皮甜米酒的过程中，为确定黄酒高活性干酵母（YWBY）的添加量及发酵时间，研究人员进行
了相关实验，实验结果如下图所示。根据实验结果制作黄皮甜米酒时，YWBY 的最佳接种量及主发酵时间
分别是_________________。YWBY 接种量为0.12%时，酒精含量最低的原因可能是________________。
18．（2026·内蒙古乌海·模拟预测）香菇是具有丰富营养价值和药用价值的食用真菌，被称作“山珍之
王”。研究人员发现香菇体内的Lp-11 蛋白具有抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡的作用。为了获得大量
纯净的Lp-11 蛋白，研究人员操作流程如图1，序号①-④表示各个环节。回答下列问题：
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注：pET32a 质粒上的KanR中沿转录方向标注的5 个限制酶的酶切位点之间的距离依次为40bp、30bp、
90bp、50bp，bp 表示碱基对。
(1)图1 过程①需要在______酶的作用下进行。①②过程获取的目的基因不含______（答出2 点）。
(2)为使目的基因与pET32a 质粒（长度为5900bp）正确连接，在设计PCR 引物时可将引物的______（3'或
5'）端添加限制酶的识别序列，与a 链和b 链相结合的引物上添加的分别是限制酶______、______的识别序
列。若计划用1 个Lp-11 基因为模板获得n 个Lp-11 基因，则PCR 过程中消耗的引物总量是______个。
(3)图1 的④过程，通常先用______将受体细胞处理成感受态，此时细胞的特点是______。受体菌应筛选出
______（填“具有”或“不具有”）氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。
(4)为了检测目的基因是否插入到pET32a 质粒中，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物
进行电泳，结果如图2。样品______最可能是插入了目的基因的重组质粒。
19．（2026·内蒙古呼和浩特·一模）腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA 缺陷型非包膜病毒，是临床基因
治疗广泛使用的载体。Otof 基因（6kb）编码R 蛋白，突变可导致常见先天性耳聋。中外科研人员利用
AAV 双载体系统递送人源正常Otof 基因，通过基因工程技术治疗先天性耳聋取得显著疗效。请分析回答：
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(1)体外可利用________技术扩增Otof 基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺点是感染率和
成活率低。
(2)Otof 基因和AAV 基因组如图1、图2 所示，单个AAV 能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为可
选择的酶切位点，则图1 需要将Otof 基因拆分为大小分别为________的5′-Otof 和Otof-3′片段，分别装入
AAV 载体形成AAV 重组载体1 和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载体中需包括启
动子和________等序列。
(3)重组载体1 和2 共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2 表达Cre 酶切割重组载体1 和2
中的lox 位点，产生黏性末端，实现两段DNA 精准对接。若重组载体1 中lox 序列如图4，则重组载体2 的
lox 序列可否为图5 所示序列，请说明理由________。
(4)为了使R 蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1 应选择________（填器官名称）部细胞中特异性表
达基因的启动子。为减少Cre 酶对受体细胞的其他影响，重组载体2 的启动子应选择________（填“强”
或者“弱）启动子。
(5)若要从个体水平检测Otof 基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof 基
因敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV 双载体，对________（答出一种即可）进行检测，以确定Otof 基
因在受体细胞中重组并表达。
20．（2026·内蒙古鄂尔多斯·一模）细菌治疗肿瘤是将特定细菌注入机体后，细菌趋向并聚集于肿瘤组织，
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通过刺激机体产生特异性免疫反应，进而实现清除肿瘤组织的治疗方法。科研人员欲构建一种在激光照射
下，可将光能高效转化为热能，诱导Noxa 基因表达的工程菌。其中Noxa 是一种具有强烈诱导细胞凋亡能
力的蛋白质，ClyA 是可以展示在细胞膜表面的蛋白质，图为相关基因表达载体的构建过程。回答下列问题。
注：Tcl 为温控基因，其控制合成的蛋白质在37℃时能抑制温度诱导型启动子的活性，在42℃时该蛋白质
失活。
(1)PCR 扩增目的基因：PCR 技术中，引物的作用是使DNA 聚合酶能从引物的________端开始连接脱氧核
苷酸。若2 链和4 链为基因转录的模板链，则引物________有互补区段，重叠产物1 中的两条链是
________（从“1 链”“2 链”“3 链”“4 链”中选填），其延伸过程不需要引物的原因是
____________________________。
(2)制备温度响应型细菌：用EcoRⅠ和SalⅠ对pBV220 载体和ClyA-Noxa 融合基因片段分别进行双酶切，用
________将酶切后的载体和融合基因片段连接，将基因表达载体导入大肠杆菌，并涂布于含________的全
营养LB 固体培养基中筛选。
(3)目的基因的检测与鉴定：挑取上述培养基中的单菌落，接种后分别置于温度为________的培养箱中培养，
一段时间后检测，若________，且表达产物既能展示在细胞表面且具有强促凋亡活性，则温度响应型细菌
构建成功。
(4)温度诱导型启动子是该工程菌的重要元件，若其持续活跃，可能带来的风险是__________________。
21．（25-26 高三上·内蒙古锡林郭勒·期末）水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。为
培育在胚乳中不含外源基因的安全转基因水稻，某研究团队设计了一种新策略，思路如下：导入：通过农
杆菌转化法将含双T-DNA 单质粒导入水稻细胞，并整合至染色体中。单质粒部分结构示意图如下，其中
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T-DNA1 与T-DNA2 是两个相对独立的区域。
注：①位于同一质粒且物理距离极短的T-DNA1 和T-DNA2，常以大片段形式一同插入染色体DNA 某一位
点；
LB
②
和RB 分别为T-DNA 的左右边界序列；
③“→”和“←”代表相关序列PCR 扩增时所需引物，其中“→a”和“b←”为边界序列引物；
P1~P4
④
为启动子。潮霉素抗性基因（hpt）为标记基因；报告基因gus 的染色检测（催化无色底物X-Gluc
产生蓝色沉淀）会杀死细胞，无法用于初筛。
初筛：利用T-DNA2 中标记基因hpt 高效筛选成功吸收外源DNA 的活细胞。
复筛：利用gus 作为抗虫基因的“替身”，能直观、准确反映抗虫基因在胚乳中的特异性删除情况，其效
果远优于抗虫基因繁琐的生物测定。
删除：Cre 基因编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 中两个loxP 位点并删除两位点之间的序列。
回答以下问题：
(1)初筛时，需向培养液中加入______，从而筛选出成功吸收外源DNA 的活细胞；删除时用到的Cre 酶与
基因工程中的______（工具酶）作用类似。
(2)为初步分析双T-DNA 在水稻染色体上的整合情况，研究者进行了两类PCR 检测：
①提取______，并以此作为模板，利用引物hpt1/hpt2 和gusA/gusB 分别进行PCR，目的是检测______。
②使用边界序列引物“→a”和“b←”进行PCR，若结果为阴性（不能扩增出相关序列条带），则T-DNA1
和T-DNA2 极有可能整合到_______（填“同一条”或“不同”）染色体上（不考虑两者相互破坏的情况）。
(3)研究人员种植了共转化成功的T0代株系，并对其自交后代T1植株进行表型分析，相关统计结果如下表
所示（不考虑减数分裂时染色体互换、突变）。
T0代株系编号
T1代总株树
T1代表型
gus+/hpt+
gus+/hpt-
gus-/hpt+
gus-/hpt-
GH1-1
30
16
6
6
2
GH1-45
42
30
0
0
12
（gus+和gus-分别表示有、无gus 蓝色反应，hpt+和hpt-分别表示有、无潮霉素抗性）
表中T0代编号为_______的株系中的双T-DNA 整合到非同源染色体上，且每种T-DNA 最有可能是_______
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（填“单”或“多”）次整合；表中T1代植株表型为_______的即为目标植株，其种子的胚乳进行gus 染
色检测未出现蓝色反应，这依赖于组织特异性启动子______。（填“P1”“P2”“P3”或“P4”）
22．（25-26 高三上·内蒙古乌兰察布·月考）图2 表示苹果醋的简易制作装置和制作流程。发酵工程在医药
上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。产
黄青霉菌是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是生产青霉素的重要工业菌种。工业上生产青霉素的发酵工
程流程如图1 所示，据图回答下列问题：
(1)用图2 装置酿酒结束后，若要直接转入果醋发酵，改变的环境条件是___________。
(2)图1 整个发酵过程的中心环节是___________。在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需
要将pH 在灭菌___________(填“前”或“后”)调至酸性。在青霉素生产过程中___________都必须经过严
格的灭菌。
(3)欲从土壤中分离出能产生纤维素酶的纤维素分解菌，若将样品接种到分离纤维素分解菌的培养基上，在
该培养基中需要加入的特殊染料是___________，通过观察是否产生___________来筛选纤维素分解菌。
(4)对产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了___________法，其可以用来计数的原理为___________。为了
避免混淆，本实验纯化菌种时使用的平板需要在培养皿的___________(“皿盖”或“皿底”)做好标记。然
后在恒温培养箱中需培养1-2d，每隔24h 统计一次菌落数目，选择菌落数目稳定时的记录作为结果，其目
的是___________。
刷真题
1.（2024·黑吉辽）将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒（辅助T-DNA 转移）和不含有Vir 基因、
含有T-DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译
效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
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注：F1-F3，R1-R3 表示引物；T-DNA-LB 表示左边界；T-DNA-RB 表示右边界；Ori 表示复制原点；KanR表示
卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷
酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其目的可
能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化
的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B. 将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
2.（2023·辽宁）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀粉酶
基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
（1）上述过程属于_____工程。
（2）PCR 中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
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③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
（3）某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热
性明显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。
（4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。
（5）目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同
大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。
（6）采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR 的模
板。
3．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者
开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的
警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可
以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成
关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA 提取、扩增，部分实验过程如下。
请完成下表：
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实验目的
简要操作步骤
释放DNA
在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA
离心后取① ，加入乙醇
②
在沉淀物中加入纯水
扩增DNA
将③ 、引物、样本DNA、含有Mg ² 缓冲
⁺
液、超纯水等加入PCR 管中，进行PCR
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F 和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的
rbeL 基因片段，是因为引物F 和R 的碱基能与rbcL 基因的保守序列的碱基 。用引物F 和R 对4 种植
物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA 进行扩增测序，结果如图所示。若对4 个样本的扩增产物进行DNA 电泳条
带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F 和R 对川金丝猴粪便DNA 进行扩增并测序，得到的序列
有图中的3 种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，
参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA 进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200 个碱基
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
4．（2025·湖南·高考真题）未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性
状的部分遗传机制。回答下列问题：
(1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，
只有一种表型。
自交得到的
中，绿色和黄色豆荚植
株数量分别为297 株和105 株，则显性性状为 。
(2)进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编
码序列G。为探究G 和下游H 的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H 突变为h（突变位点如图a 所
示，h 编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh 植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a：
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①为筛选Hh 植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA 进行PCR。若扩增产物电泳结
果全为预测的1125bp，则基因H 可能未发生突变，或发生了碱基对的 ；若H 的扩增产物能被酶切为
699bp 和426bp 的片段，而h 的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的 （填“Ⅰ”
“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh 植株。
②若图a 的
中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则
中黄色豆荚植株的基因型为 [书写以图a 中亲本黄
色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测
中黄色豆荚植株产
生的遗传分子机制是 。
③若图a 的
中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明 。
5．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离
子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1 和黄色荧光蛋白YFP 编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣
藻，实现CADR 大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：
(1)在DNA 聚合酶、引物、模板DNA 和脱氧核苷酸中，随着PCR 反应进行，分子数量逐渐减少的是 和
。模板与引物在PCR 反应的 阶段开始结合。PCR 中使用的DNA 聚合酶需耐高温，其原因为 。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1 所示。在将CADR、GP1 和YFP 基因逐个构建
到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl 两端应添加
（填两种限制酶）的识别序列。用DNA 连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。
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(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生
型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量
，则表明融合蛋白能结合镉离子。
(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6 天后，检测细胞密度，结果见图2。转
基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉
离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。
(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是
和 。（填标号）
①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富
营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递
6．（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA．该病毒具有包膜结构，包膜上的
蛋白A 与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA 进入细胞内进行自我复制。回
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答下列问题：
(1)要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是 。
(2)体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内
（填细胞结构名称）的改变。
(3)这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： 。
(4)该病毒DNA 能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA
中插入 序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA 的目的。
(5)用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推
测其无法转录的原因是： 。
(6)采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是： 。
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