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第43 讲 基因工程
1．（2023 春·广西·高二校联考阶段练习）生物技术的安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述正确
的是（ ）
A．某些转基因食品会引起过敏反应，要禁止转基因技术的应用
B．克隆技术与社会伦理有冲突，要禁止治疗性克隆技术的应用
C．严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质
D．人们不会对利用基因编辑技术制造的新型致病菌产生免疫
【答案】C
【分析】生物技术安全性问题包括食物安全、生物安全、环境安全三个方面。伦理问题主要在克隆人的问
题上出现争议。
【详解】A、严格选择转基因植物的目的基因，可避免产生对人类有害的物质，减少人们对转基因食物安
全的担忧，同时严格把关转基因食品上市的每一道程序，适量上市，A 错误；
B、克隆技术还不成熟，与社会伦理有严重冲突，应禁止生殖性克隆人，但不反对治疗性克隆，B 错误；
C、严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质，这样可在一定程度上保证转基因产品
安全性，C 正确；
D、人们对利用基因编辑技术制造的新型致病菌也会产生免疫，D 错误。
故选C。
2．（2023 春·新疆乌鲁木齐·高二校考期中）蛋白质工程是基因工程的延伸。下列有关蛋白质工程的叙述，
正确的是（ ）
A．蛋白质工程是基因工程的延伸，所以不需要遵循中心法则
B．蛋白质工程中可以不用构建基因表达载体
C．生产的蛋白质能在自然界中找到
D．需要限制性内切核酸酶和DNA 连接酶
【答案】D
【分析】蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化
特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获
得可以表达蛋白质的转基因生物系统，这个生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，甚
至可以是细胞系统。
【详解】A、蛋白质工程最终也是基因控制蛋白质的合成，遵循中心法则，A 错误；
B、蛋白质工程是基因工程的延伸，需要构建表达载体，B 错误；
C、生产的蛋白质在自然界中找不到，因此才采用蛋白质工程进行合成，C 错误；
D、蛋白质工程是基因工程的延伸，需要构建表达载体，需要限制性内切核酸酶和DNA 连接酶，D 正确。
故选D。
3．（2023 春·新疆乌鲁木齐·高二校考期中）受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下
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列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是（ ）
A．大肠杆菌—Ca2+
B．棉花细胞—花粉管通道法
C．羊高度分化的体细胞—显微注射法
D．番茄细胞—农杆菌转化法
【答案】C
【分析】培养转基因植物时，导入目的基因有多种方法：以受精卵为受体时，可以用花粉管通道法；双子
叶植物常用农杆菌转化法；单子叶植物常用基因枪法。
【详解】A、用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，容易吸收外来DNA 分子，A 正确；
B、当以棉花受精卵为受体细胞时，常用花粉管通道法，B 正确；
C、将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，常用动物受精卵为受体细胞，C 错误；
D、番茄为双子叶植物植物细胞，可以用农杆菌转化法，D 正确。
故选C。
4．（2024·全国·高二课堂例题）限制酶和DNA 连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A．限制酶只能切割双链DNA 片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
B．DNA 连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
C．E.coli DNA 连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而米，所以也能剪切自身的DNA
【答案】A
【分析】基因工程最基本的工具：①基因的“剪刀”——限制酶；②基因的 “针线”——DNA 连接酶；
③基因的运载体——质粒、噬菌体、动植物病毒等。
【详解】A、限制酶只能切割DNA 分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，A 正确；
B、DNA 连接酶连接的是两个DNA 片段，B 错误；
C、E•coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C 错误；
D、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA 分子中不存在该酶的识别序列或识别
序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D 错误。
故选A。
5．（2024·新疆·校联考模拟预测）下图表示“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本流程，下列叙述错误的是
（ ）
①取材→②破碎细胞→③获得滤液→④去除杂质→⑤进一步提纯→⑥DNA 鉴定
A．本实验使用的酒精的浓度与“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中的相同
B．步骤①中可以使用猪的肝细胞作为实验材料
C．步骤①中可以使用纱布对研磨液进行过滤，并获取上清液
D．步骤⑥向试管中加入二苯胺试剂后静置5min 后即可呈现蓝色
【答案】D
【分析】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的
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物理或化学方法对它们进行提取。DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA 在不同浓度的NaCl 溶
液中溶解度不同，它能溶于2mol/L 的NaCl 溶液；在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈蓝色，因此二苯
胺可以作为鉴定DNA 的试剂。
【详解】A、本实验和“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验所用的酒精浓度相同，都是体积分数
为95%的酒精，A 正确；
B、猪的肝细胞中含有DNA，所以，步骤①中可以使用猪的肝细胞作为实验材料，B 正确；
C、步骤①中可以使用纱布对研磨液进行过滤，并获取上清液，C 正确；
D、步骤⑥中 DNA 鉴定时向试管中加入二苯胺试剂后，应将试管置于沸水中加热 5min，待试管冷却后可
观察到蓝色，D 错误。
故选D。
6．（2023 秋·江西宜春·高二江西省宜丰中学校考阶段练习）同尾酶是指切割不同的DNA 片段后能产生相
同黏性末端的一类限制酶，下列四种限制酶中属于同尾酶的是（ ）
A．①③
B．②④
C．①③和②④
D．①④
【答案】A
【分析】限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一
条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。经限制切割产生的DNA 片段末
端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
【详解】同尾酶是指切割不同的DNA 片段后能产生相同黏性末端的一类限制酶，平末端不属于黏性末端，
故②④不属于同尾酶。限制酶切割后，①产生的黏性末端为CATG，③产生的黏性末端为CATG，因此
①③产生的黏性末端都为CATG 的相同黏性末端，符合同尾酶的定义，A 正确,BCD 错误。
故选A。
7．（2023 春·全国·高二随堂练习）我国的科研团队首次发现了高粱细胞中AT1 基因编码的AT1 蛋白可以
调节作物的耐碱性表型，对于提高作物在盐碱地的存活率具有重要意义。在盐碱地种植的作物会受胁迫产
生过量的有害物质H2O2．图中的PIP2s 为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输，其机理如
图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．盐碱环境可引起大多数作物胞内液渗透压上升，吸水能力增强
B．PIP2s 失活的植物细胞在高渗溶液中仍可以发生质壁分离
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C．敲除AT1 基因将导致PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排
D．可以将耐碱基因的成果应用到大豆、油菜等更多的作物提高其抗逆性
【答案】C
【分析】当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞液中的水就透过原生质层进入外界溶液中，使细胞
壁和原生质层都出现一定程度的收缩，由于原生质层比细胞壁伸缩性大，表现出质壁分离；当细胞液的浓
度大于外界溶液的浓度时，外界溶液中水就透过原生质层进入细胞液中，整个原生质层就会慢慢恢复原来
的状态，表现出质壁分离的复原。
【详解】A、盐碱环境可引起大多数作物细胞失水，细胞内渗透压上升，吸水能力增强，A 正确；
B、PIP2s 是水通道蛋白一种，PIP2s 失活水分子依然可以通过其他水通道蛋白或者自由扩散进出细胞，因
此在高渗溶液仍可以发生质壁分离，B 正确；
C、AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的磷酸化，敲除AT1 基因将解除其对PIP2s 蛋白磷酸化的抑制，促进H2O2
外排，C 错误；
D、可以通过基因工程将耐碱基因的成果应用到大豆、油菜等更多的作物提高其抗逆性，D 正确。
故选C。
8．（2023 秋·广东·高三广州大学附属中学校联考阶段练习）下列关于发酵工程的应用，叙述不正确的是（
）
A．在弱碱性条件下会积累谷氨酸
B．在青贮饲料中添加乳酸菌，可提高饲料的品质，动物食用后还能提高免疫力
C．可以将乙型肝炎病毒的抗体基因转入酵母菌，通过发酵工程制备乙型肝炎疫苗
D．苏云金杆菌不仅能防治棉铃虫，还能防治多种农林害虫
【答案】C
【分析】利用青贮原料上存在的乳酸菌等微生物，通过厌氧呼吸将青贮原料中的碳水化合物转化成有机酸，
抑制有害菌的生长，从而实现长期保存饲料及其营养物质的目的。同时，微生物的活动使青贮饲料带有芳
香酸甜的味道，提高了家畜的适口性。
【详解】A、谷氨酸的发酵生产在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺
和N-乙酰谷胺酰胺，A 正确；
B、在青贮饲料中添加乳酸菌，通过乳酸菌的发酵，可以提高饲料品质，使饲料保鲜，同时提高动物免疫
力，B 正确；
C、可以将乙型肝炎病毒的抗原基因转入酵母菌，通过发酵工程制备乙型肝炎疫苗，C 错误；
D、通过发酵工程生产的苏云金杆菌可制成微生物农药，用来防治多种农林虫害，这属于生物防治的实例，
D 正确。
故选C。
9．（2023 秋·浙江金华·高三校联考阶段练习）随着生物技术的进步，相关成果不断涌现，人们对它的安全
性、与伦理道德碰撞而带来的困惑和挑战也与日俱增，下列叙述错误的是（ ）
A．通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
B．试管婴儿技术和“设计试管婴儿”都需要对胚胎进行遗传学诊断
C．我国禁止生殖性克隆，不允许进行任何生殖性克隆人实验
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D．生物武器致病能力强，我国反对生物武器及其技术和设备扩散
【答案】B
【分析】目前关于转基因技术安全性的争论主要集中在食物安全、生物安全和环境安全三个方面。中国政
府对克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，坚持四不原则(不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克
隆人实验)，但不反对治疗性克隆。生物武器的种类包括病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌
等，具有传染性强污染面广的特点。
【详解】A、转基因技术已被用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期，属于转基因技术在
微生物领域的应用，A 正确；
B、“设计试管婴儿”需要对胚胎进行遗传学诊断，试管婴儿技术不需要，B 错误；
C、我国禁止生殖性克隆，不允许进行任何生殖性克隆人实验，C 正确；
D、生物武器致病能力强，我国反对生物武器及其技术和设备扩散，D 正确。
故选B。
10．（2023 秋·浙江·高三校联考阶段练习）下列有关生物技术安全性等问题的观点正确的是（ ）
A．生殖性克隆人理论上增加了人类基因的多样性
B．生殖性克隆需要核移植技术，而治疗性克隆不需要
C．生物武器的特点有具有传染性、携带和投放相对简单、研发门槛较高等
D．“设计试管婴儿”可以有目的地改造特定基因，特定情况下可用于疾病治疗
【答案】D
【分析】中国政府的态度是不反对治疗性克隆，禁止生殖性克隆人，中国政府坚持四不原则：不赞成、不
允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。转基因技术本身是中性的，理性看待转基因技术需要以
完备的相关科学知识为基础，还应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响，最
重要的是我们要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
【详解】A、“生殖性克隆”是用生殖技术制造完整的克隆人，不能丰富人类基因的多样性，A 错误；
B、生殖性克隆和治疗性克隆都需要核移植技术，B 错误；
C、生物武器造价低，技术难度不大，隐秘性强，可以在任何地方研制和生产，具有传染性、危害持久，
容易携带的特点，C 错误；
D、“设计试管婴儿”可以有目的地改造特定基因，特定情况下可用于疾病治疗，因此我国政府的态度是
不反对治疗性克隆，D 正确。
故选D。
11．（2023 秋·江苏南通·高三统考阶段练习）“筛选”是生物技术与工程中常用的技术手段。下列相关叙
述正确的是（ ）
A．诱导植物原生质体融合时，通过染色体数目即可筛选异种融合细胞
B．制备单克隆抗体时，可利用选择培养基筛选出能产所需抗体的杂交瘤细胞
C．培育耐盐植株时，必须在获得试管苗后才可用盐水浇灌进行筛选
D．制备工程菌时，可通过标记基因对成功转化的受体细胞进行筛选
【答案】D
【分析】单克隆抗体的制备过程：（1）制备产生抗体的B 淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，
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然后从小鼠脾内获得相应的B 淋巴细胞。（2）获得杂交瘤细胞：①将鼠的骨髓瘤细胞与B 淋巴细胞融合；
②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。（3）克隆化培养和抗
体检测。（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液
或小鼠的腹水中提取。
【详解】A、诱导植物原生质体融合时，通过染色体数目不能筛选异种融合细胞，因为融合的异种融合细
胞和融合的同种融合细胞染色体数目可能相同，A 错误；
B、制备单克隆抗体时，可利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，用抗原筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞，
B 错误；
C、培育耐盐植株时，可以用含一定浓度钠盐的培养基培养愈伤组织，C 错误；
D、标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，制备工程菌时，可通过标记基因对成功转化的受体细胞进行
筛选，D 正确。
故选D。
12．（2023 秋·浙江·高三校联考期中）新冠病毒是一种RNA 病毒，疫苗是控制其肆虐的最有效手段。我国
科学家研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将
新冠病毒刺突蛋白（S）对应的相关序列连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA 中，重组载体经扩增后转
入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。关于该基因工程疫苗，下列叙述正确的是（ ）
A．为构建重组载体，可获取病毒遗传物质，再用限制酶将目的基因切下后进行连接
B．为提供针对新冠病毒的长期保护，需两次或更多次数地接种该重组疫苗
C．重组疫苗可指导合成新冠病毒增殖所需的多种蛋白质，以发挥更好的免疫效果
D．为保证安全性，制备重组疫苗时需删除腺病毒的某些增殖相关的基因
【答案】D
【分析】重组腺病毒疫苗必须具备的条件：能够将新冠病毒抗原基因（目的基因）带入到受体细胞；在受
体细胞中表达出抗原蛋白；不会导致疾病发生。
【详解】A、新冠病毒是一种RNA 病毒，构建重组载体时，需要将新冠病毒刺突蛋白（S）对应的相关序
列逆转录形成DNA，再与载体进行拼接，A 错误；
B、该重组疫苗进入细胞后，可通过转录翻译形成数量较多的新冠病毒刺突蛋白（S），且该重组疫苗会整
合到宿主细胞的基因组中，随着宿主细胞的增殖而复制，因此不需要两次或更多次数地接种该重组疫苗，
B 错误；
C、根据题意可知，重组疫苗可指导合成新冠病毒刺突蛋白（S），即只能合成一种蛋白，C 错误；
D、为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然
可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答，D 正确。
故选D。
13．（2023 秋·重庆·高三校联考开学考试）如图为鸡血细胞中DNA 的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作
示意图，请据图分析，下列相关叙述中，正确的是（ ）
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A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤
B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA 量相近
C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴
冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组
D．步骤①的目的是初步分离DNA 与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2mol/L 的NaCl 溶液中，
DNA 的溶解度较大
【答案】D
【分析】DNA 的粗提取和鉴定的原理是：
(1)DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl 溶液中的溶解度不同。
(2)DNA 不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶液酒精。
(3)DNA 和蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
(4)DNA 的鉴定：在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、DNA 的粗提取和鉴定步骤是：加入蒸馏水，破碎细胞→过滤，获取含DNA 的滤液→去除滤
液中杂质→DNA 的析出→鉴定，因此图中表示正确的实验操作顺序是③→②→①→④→⑤，A 错误；
B、猪血红细胞中没有细胞核，提取不到DNA，用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA 量不相同，
B 错误；
C、⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却
后，出现蓝色的试管组别是实验组，C 错误；
D、步骤①的目的是析出并获得DNA，步骤④中在2mol/L 的NaCl 溶液中，DNA 的溶解度较大，D 正确。
故选D。
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14．（2023 秋·广西玉林·高三博白县中学校考开学考试）研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添
加于饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W 基因编码。
为在乳酸杆菌中表达W 基因，需使用图1 中质粒为载体，图2 为含W 基因的DNA 片段。
(1)采用 技术可以快速、大量获得W 基因。利用该技术扩增目的基因时，需要
等作为原料和直接能源物质。
(2)启动子是 识别和结合的部位。很多启动子具有物种特异性，在图1 质粒中插入W 基因，其
上游启动子应选择 （填写字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子 B．乳酸杆菌启动子 C．农杆菌启动子
(3)根据图1 和图2，应使用限制酶 切割图2 中含W 基因的DNA 片段，导入质粒以获得能正
确表达W 基因的重组质粒。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含 的培养基筛选，以得到
转入W 基因的乳酸杆菌。
(4)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示
菌种。取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如下表所示。表中的X 应为 。
菌种
酶活性相对值
乳酸杆菌
未检出
X
未检出
导入了重组质粒的乳酸杆菌
0.96
【答案】(1) PCR 四种脱氧核苷酸、ATP
(2) RNA 聚合酶 B
(3) EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ 氨苄青霉素
(4)导入空质粒（或“空载体”）的乳酸菌
【分析】（1）基因工程的基本操作步骤为:获取目的基因、形成重组DNA 分子、将重组DNA 分子导入受
体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达。
（2）选择限制酶时应当注意：①不能破坏目的基因；②目的基因首尾都要有切点；③质粒要确保至少含
有一个完整的标记基因；④质粒上的切点要位于启动子之后、终止子之前；⑤目的基因和质粒切割后形成
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的粘性末端还要能互补配对。
【详解】（1）PCR 技术可以使得目的基因在体外大量复制，故采用PCR 技术可以快速、大量获得W 基因。
利用该技术扩增目的基因时，需要四种脱氧核苷酸、ATP 等作为原料和直接能源物质。
（2）启动子是一段特殊的DNA 序列，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动目的基因的转录。该基因
工程是将枯草芽孢杆菌的W 基因导入乳酸杆菌，想让W 基因在乳酸杆菌中成功表达，所以应当选择乳酸
杆菌启动子，故选B
（3）选择限制酶时应当注意：a.不能破坏目的基因；b.目的基因首尾都要有切点；c.质粒要确保至少含有
一个完整的标记基因；d.质粒上的切点要位于启动子之后、终止子之前；e.目的基因和质粒切割后形成的黏
性末端还要能互补配对；经综合分析，MfeⅠ与EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端相同，但MfeⅠ会破坏目的基
因，所以质粒使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割，含W 基因的DNA 片段使用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ切割（能
切下目的基因）。因为构建的基因表达载体只含有标记基因氨苄青霉素抗性基因，所以应使用含氨苄青霉
素的培养基进行筛选。
（4）本实验的目的是为了确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，所以不光有空白对
照，还要排除质粒自身的影响，所以X 应为入空质粒(或“空载体”)的乳酸菌。
15．（2023 秋·广西桂林·高三统考阶段练习）重组PCR 技术是一项新的PCR 技术，可将原来两个不相关的
DNA 连接起来，组成一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB 基因和ST1 基因片段，用
重组PCR 技术构建了LTB-STl 融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题：
(1)PCR 实验中，为防止外源DNA 等因素的污染，使用的微量离心管、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进
行 。PCR 过程中，子链延伸需要在 进行，在 的催化作用下，该酶需要被
（填离子）激活后才能发挥作用。
(2)设计引物时，引物P1 与引物P2 的碱基序列 （填“能”或“不能”）互补；引物P2 与引物P3
的碱基序列 （填“能”或“不能”）部分互补，原因是 。
(3)DNA 子链是从5′端向3′端延伸。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2 次循环才能得到用于杂交
的目的链L、S，则第2 次循环的目的是 。
(4)杂交链延伸生成LTB-ST1 融合基因的过程中， （填“需要”或“不需要”）加入引物。在图中
标出杂交链两条母链的3′端和5′端，
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【答案】(1) 高压灭菌 耐高温 DNA 聚合酶 Mg2+
(2) 不能 能 使LTB 基因与ST1 基因的单链融合在一起
(3)为杂交链延伸子链起始部位提供3＇端
(4) 不需要
【分析】PCR 技术：
（1）定义：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术；
（2）原理：DNA 复制；
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物；
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA 聚合酶、能量；
（5）过程：高温变性，DNA 双链解旋；低温复性，引物与互补链DNA 结合；中温延伸，在耐高温的
DNA 聚合酶作用下合成子链。
【详解】（1）PCR 实验中，使用的微量离心管、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，以
防外源DNA 等的污染；在PCR 过程中，子链延伸时温度需上升到72℃在高温条件下在DNA 聚合酶的催
化下进行，且该耐高温的DNA 聚合酶需要被Mg2+激活后发挥作用。
（2）为防止引物的碱基配对影响扩增结果，引物P1 与引物P2 的碱基序列不能互补。LTB 基因和ST1 基因
能融合的关键是引物P2 和引物P3 部分碱基能互补配对，从而将两个基因融合在一起。
（3）扩增LTB 基因时，第一次循环使用引物P2，得到的子链是
。DNA 子
链是从5＇端向3＇端延伸的，为了使杂交链引物P2 的碱基末端提供3＇端，需要第二次循环，该次循环
使用引物P1，得到的子链为
，ST1 基因的扩增过程类似。
（4）杂交链延伸生成LTB-ST1 融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即
为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA 聚合酶提供3′端，杂交链两条母链的3′端和5′端标注如图
。
1．（2023·辽宁·统考高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表
达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。
该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
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A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记
基因等。
【详解】为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基
因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163 基因转录形成的mRNA 中不能出现
终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP 基因转录形成的mRNA 不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因
此该拼接过程的关键步骤是除去CD163 基因中编码终止密码子的序列，B 符合题意，ACD 不符合题意。
故选B。
2．（2023·江苏·统考高考真题）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（ ）
A．洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D．粗提取的DNA 溶于2mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
【答案】A
【分析】观察细胞有丝分裂实验的步骤：解离（解离液由盐酸和酒精组成，目的是使细胞分散开来）、漂
洗（洗去解离液，便于染色）、染色（用龙胆紫、醋酸洋红等碱性染料）、制片（该过程中压片是为了将
根尖细胞压成薄层，使之不相互重叠影响观察）和观察（先低倍镜观察，后高倍镜观察）。
【详解】A、洋葱鳞片叶内表皮的原生质层具有选择透过性，可代替半透膜探究质膜的透性，A 正确；
B、洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，需要水浴加热才可能出现砖红色沉淀，若出现砖红色，则可说明
洋葱匀浆中含有还原糖，B 错误；
C、制作根尖有丝分裂装片时，解离、按压盖玻片得目的都是为了获得单层细胞，即这些操作均能更好地
将细胞分散开，C 错误；
D、粗提取的DNA 溶于2mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后经过水浴加热可显蓝色，D 错误。
故选A。
3．（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA 损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，
机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER 酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。
患者幼年发病，20 岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（ ）
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A．修复过程需要限制酶和DNA 聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行
C．DNA 有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP 患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
【答案】C
【分析】1、DNA 分子复制的过程：
①解旋：在解旋酶的作用下，把两条螺旋的双链解开。
②合成子链：以解开的每一条母链为模板，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，在
有关酶的作用下，各自合成与母链互补的子链。
③形成子代DNA：每条子链与其对应的母链盘旋成双螺旋结构。从而形成2 个与亲代DNA 完全相同的子
代DNA 分子。
2、限制酶和DNA 聚合酶作用的对象都是磷酸二酯键。
【详解】A、由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程
中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA 聚合酶，A 正确；
B、填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5’到3’的方向进行，B 正确；
C、DNA 有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA 复制的正确进行，对细胞最有利，C 错误；
D、癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP 患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变
累积解释，D 正确。
故选C。
4．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物
AT1 蛋白通过调节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
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A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【分析】分析题图：AT1 蛋白通过抑制PIP2s 蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2排到细胞外，从而导致植
物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1 蛋白缺陷，可以提高PIP2s 蛋白的磷酸化水平，促进细
胞内的H2O2排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1 蛋白缺陷，可以促进PIP2s 蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出
膜外，A 正确；
B、据题图左侧的信息可知，AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外
的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B 错误；
C、结合对A 选项的分析可推测，敲除AT1 基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，
进而提高其成活率，C 正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D 正确。
故选B。
5．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因
构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体
（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
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D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
【答案】D
【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI 和PvuI 的酶切位点，四环素抗性基因
（TetR）内含有HindIII、SphI 和SalI 的酶切位点。
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A 正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的
菌落，不一定含有目的基因，B 正确；
C、DNA 凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA 片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒
构建成功与否，C 正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因
（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet 的培养
基中不能形成菌落，D 错误。
故选D。
6．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型
小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期
获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用
于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【分析】PCR 技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA
复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转录后，可以
使GEP 基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA 从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译
时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
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C、整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只
有小片段，是野生型，C 错误；
D、用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D 错误。
故选B。
7．（2023·广东·统考高考真题）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。
下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在0.14mol/L 的
氯化钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA 等物质，A 正确；
B、DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L 的NaCl 溶液， 将溶液过滤，即可将混合
物中的多糖、蛋白质等与DNA 分离，B 正确；
C、DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA 纯度，C 正
确；
D、将DNA 溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D 错误。
故选D。
8．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将
目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限
制酶的切割位点如图所示。
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下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
【答案】C
【分析】DNA 连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA 连接酶、T4DNA 连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外
T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3 切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA 连接酶连接，A 错误；
B、质粒用酶3 切割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B 错误；
C、质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目的基因在
质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C 正确；
D、若用酶2 和酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺
少标记基因，无法进行后续的筛选，D 错误。
故选C。
9．（2023·辽宁·统考高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造
β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下
列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
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(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
【答案】(1)蛋白质
(2)③
(3)②③
(4)标记基因
(5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检
测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片
段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶
切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA 为模板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
10．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建
质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的
不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
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(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 引物
(2)CD
(3)限制性核酸内切酶（限制酶）
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR
扩增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR 过程
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需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR 反应成败的
最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-GACGAG-3'能
与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中
的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，
在DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于
30，A 错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，
故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落
无需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列，
因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
11．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源于自身分裂（途
径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研
究了L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA 的EdU 和
BrdU 均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一
组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU 标记细胞的百分
比（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从 点到 点。
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(3)为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，
即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基因：源自噬菌
体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；③Er 基因：编码的Er 蛋白位于
细胞质，与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细
胞核。请完善制备小鼠IK 的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选
目标小鼠→ →获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的
三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，再过t2时间后检测B 细胞被标
记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
【答案】(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3) 将Ce 酶基因和Er 基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B 细胞没有被BrdU 标记
【分析】DNA 分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA 的双链）、能量（ATP 水
解提供）、酶（解旋酶和DNA 聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：
一条DNA 复制出两条DNA；特点：半保留复制。
【详解】（1）分析题意可知，EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，
掺入DNA 的EdU 和BrdU 均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA 分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞
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混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU 会与A 结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定
时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU 也会与A 结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到
峰值，故结合题图可知，图中反映DNA 复制所需时长的是从Q 点到R 点。
（3）分析题意，要制备IK 小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，
结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK 的技术路线为：将Ce 酶基因和Er 基因连接（Ce 酶可作用于
x，导致两个x 间的DNA 片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱
导Er 蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、
分化（途径Ⅱ），由于但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用
EdU 饲喂小鼠IK，各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应
都含有EdU 标记，实验假设是变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程
已经复制的B 细胞直接分裂，不会再有DNA 复制过程，故t2时间后用BrdU 饲喂则不起作用，即大多数B
细胞没有被BrdU 标记。
12．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种
新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1 与图2 分别是利用常规转化法
和CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
(1)图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长
素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的 。图1 中，
含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
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(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体
（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得
转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编
辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
(5)与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是 （答出2 点即可）。
【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需
要
(2) 遗传特性 转基因标识
(3)Ti 质粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到一起
(4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS 缺失会导
致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除
(5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【分析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、
芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。
【详解】（1）图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来
特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值
能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机
物，供试管苗生长发育。
（2）图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的遗传特性。
图1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。
（3）图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti 质粒的作用，Ti 质粒中的T-DNA 能
将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑
载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功
获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2 中，鉴
定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS 缺失会
导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除。
（5）与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组
织培养技术进行操作，且培养周期较短。
13．（2023·浙江·统考高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量
很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在
一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工
诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011 年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育
了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
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①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过
检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相
应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF 膜发生
，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。
将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA 水平检测：利用PCR 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，
检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA 水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛
乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA 进行 处理，以去除DNA 污染，
再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因
牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
【答案】(1) 负反馈调节 过量赖氨酸类似物
(2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF
DNA 酶
PCR 的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳
细胞中不能表达。
【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使
系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：
方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心
步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受
体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通
道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态
细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的
基因-DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译
成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，
并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，
能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调
节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
（2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF 膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能
性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，
直至小牛出生。
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⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影
响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面
预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对
照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。
为了除去DNA 污染，可以使用DNA 酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR 的模板进行扩增。
目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含
有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
14．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多
种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA 连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小
段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同
源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA 有许多A-B 序列位点可以
同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳
清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，
因此在导入一种目的基因后，要切除UGA 基因，再重新导入。研究人员在UGA 基因序列两端加上酵母菌
DNA 中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA 基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列
的配对方式，进而决定DNA 片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
（ii）切去UGA 基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
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(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。
【答案】(1)细胞外
(2)P1和P6
(3) 缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸
(4)图3
【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA 分子水平上进
行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
【详解】（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，
将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6
这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上
培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式一，C 和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，
切割后形成末端，便于连接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，
如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）根据前面分析，C 和C'的中间插入UGA，A 和B 之间插入的目的基因，所以图3 正确。
15．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
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(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因的
（填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
【答案】(1) RNA 聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2
a 链
(3) J-V5 融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此
RNA 聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；
②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是
安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具
备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连接
到质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。
b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是
3’-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯
定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b
链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是J-V5 融合蛋白。
抗J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的蛋白不是由重组质粒上
的J 基因表达的。
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16．（2023·湖南·统考高考真题）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家
系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，
编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源
染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1 和1-2 生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率
是 。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR 扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为
）酶切检测甲
基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6 个碱基即可）。用上
述引物扩增出家系成员Ⅱ-1 的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的
基因片段中唯一）。
(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs 风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低
NTDs 的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1 个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为
0.4~1.0mg.d-1，NTDs 生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇
（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
【答案】(1) 常染色体隐性遗传病 1/32
(2) 5'-ATTCCA-3' 8、302 和310
(3)0.4~1.0
【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，
位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中。随配子独立遗传给后代，
同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合
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【详解】（1）由遗传系谱图可知，由于I-1 与I-2 均表现正常，他们关于甲病的基因型均为+/-，而他们的
女儿Ⅱ-4 患病，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传病，由I-1、I-2 和Ⅱ-3 关于
乙病的基因可以推出乙基因突变导致的遗传病也是常染色体隐性遗传病，所以I-1 和I-2 生出一个甲和乙突
变基因双纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2=1/32 。
（2）本题研究甲基因突变情况，二代1 为杂合子，兼有正常甲基因和突变甲基因。目的基因为甲基因，扩
增引物应与两基因共有的TAAGGT 片段结合，应为ATTCCA。可扩增出大量正常甲基因和突变甲基因供
后续鉴定。此时酶切，正常甲基因酶切后片段为8 和2+293+7=302bp，突变甲基因无法被酶切，大小为
310bp。后续可通过电泳等手段区分开，达到检测甲基因突变情况的目的。
（3）女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs 风险，Ⅲ-1 和Ⅲ-2 关于乙的基因型为-/-，但不表现NTDs，
即该孕妇（Ⅱ-1）无NTDs 生育史，推荐叶酸补充剂量为0.4~1.0mg·d-1。
17．（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为
抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原
代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中PEG 对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
【答案】(1) 不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
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(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免
疫的B 淋巴细胞；诱导B 细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛
选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培
养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物
质PEG 可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融
合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈
阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA 连接酶能连接DNA 片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH 位于3'端，①②③脱氧核苷酸
链的两端基团有误；DNA 连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱
氧核苷酸链的3'端的-OH 相连，④符合题意。
故选④。
18．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行
诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替
换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株
的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用DNA 连接酶将
两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个
位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目
的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
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因组中插入了 。
T
②
1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基
中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的
T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切
酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带
涂黑 。
【答案】(1)野生型
(2) 载体（基因表达载体） 启动子和终止子
(3) DAI 基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是
细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI 基因为显性基因，因此采用
农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大
小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR 技术扩增DAI 基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI 基因和运载体进行切割，再用
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DNA 连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾
端，因此为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA 上含有DAI 基因和卡那霉素
抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有
能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI 基因和卡那霉素
抗性基因。
T
②
1代阳性植株都含有DAI 基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位
点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当
于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3 1∶的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，
因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基
上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标
转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X 的
切割位点，而突变型的基因有限制酶X 的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有
150bp，突变型有50bp 和100bp，如图：
。
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