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第18 讲 基因工程
目 录
01 考情透视·目标导航
02 知识导图·思维引航
03
核心整合一 基因工程
知识串联1 限制酶的选择技巧
知识串联2 基因工程的操作步骤
知识串联3 DNA 的粗提取与电泳鉴定
核心整合二 PCR 技术和蛋白质工程
知识串联1 PCR 技术
知识串联2 蛋白质工程
04 题型突破·命题预测
真题突破
题型1 基因工程的基本工具
题型2 基因工程的基本操作程序
题型3 蛋白质工程的原理和应用
题型4 PCR 技术及其应用
以热点窥预测
预测1 围绕基因工程的基本工具，考查科学思维
预测2 围绕基因工程的操作步骤，考查科学思维
预测3 围绕DNA 的粗提取与鉴定，考查实验探究能力
05 拓展应用·情境推理
情境1 Cre/LoxP 重组酶系统
情境2 CRISPR/Cas9 基因编辑
情境3 In－Fusion 技术
1
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核心考点
考试频次
考题统计
考情分析
DNA 重组技术的工具
3 年5 次
（2024 贵州卷）DNA 重组技术的工具
（2024 江西卷）基因工程与微生物综合
（2024 湖南卷）DNA 重组技术的工具与
酶
（2023 湖北卷）DNA 重组技术的工具与
单克隆抗体
本部分的命题以非选择
题为主，属于高考必考
内容。题目内容多，难
度往往较大，试题情境
新颖，核心素养侧重对
科学思维和科学探究的
考查。
基因工程预计仍是2025
高考的热点内容，对能
力的要求较高，涉及重
组DNA 技术、基因工程
的基本操作程序等内
容，情境大多来自大学
教材和论文文献。
基因工程的基本操作程序
3 年56
次
（2024 广西卷）基因表达载体的构建
（2024 天津卷）将目的基因导入受体细胞
（2024 福建卷）基因工程的基本操作步骤
（2024 重庆卷）基因表达载体的构建
基因工程及应用
3 年9 次
（2024 江西卷）基因工程应用
（2024 河北卷）基因工程与疫苗
（2024 海南卷）基因工程与制药
情境设计
借助Cre/LoxP 重组酶系统、CRISPR/Cas9 基因编辑、In－Fusion 技术考查了相关技术
的原理和应用，体现了科学思维的核心素养。
备考要点
基因工程的基本工具
基因工程的基本操作程序
蛋白质工程的原理和应用
PCR 技术及其应用
2
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核心整合一 基因工程
知识串联1 限制酶的选择技巧
1.根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限
制酶Sma Ⅰ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可
选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。
2.根据质粒的特点选择限制酶(如图)
3
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3.根据Ti 质粒的T－DNA 片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti 质粒均不宜选取，而丙Ti 质粒宜选取(假设
切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。
【易错提醒】若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接，避免自身环化
和反向连接，提高连接的有效性。
【典例1】下表是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y=C 或T，R=A 或G）。下列相关叙述正确的是（
）
限制酶
Hind Ⅱ
Alu Ⅰ
BamH Ⅰ
Sau3A Ⅰ
识别序
列及切
割位点
↓
5'-GTYRAC-3'
↓5'-
AGCT-3'
↓5'-
GGATCC-3'
↓5'-
GATC-3'
A．限制酶切割一次需切断2 个磷酸二酯键，增加2 个游离的磷酸基团
B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C．Alu Ⅰ切割后的DNA 片段可用E。coliDNA 连接酶连接
D．BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割形成的片段进行重组后，BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ均不能识别并切割
【答案】A
【解析】限制酶切割一次需切断2 个磷酸二酯键，形成2 个新的游离的磷酸基团，A 正确；一种限制酶不
一定只识别一种核苷酸序列，如Hind Ⅱ，B 错误；用Alu Ⅰ切割得到的是平末端，E.coliDNA 连接酶只能
将具有互补黏性末端的DNA 片段连接起来，不能连接平末端的DNA 片段，C 错误；BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割
形成的片段进行重组后，BamH Ⅰ不能识别并切割重组片段，而Sau3A Ⅰ可识别并切割重组片段，D 错误。
4
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知识串联2 基因工程的操作步骤
1. 基因表达载体的构建（核心步骤）
2.将目的基因导入受体细胞
细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、花粉管
通道法
显微注射技术
Ca2＋处理法(感受态细胞法)
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
使用最广泛的是大肠杆菌
3．目的基因的检测与鉴定
【典例2】科研人员利用TALEN 基因编辑技术构建RPE65 基因编辑的家犬，建立RPE65 基因突变动物模型，
TALEN 编辑体系主要由特异性的DNA 识别域和非特异性的FokI 内切核酸酶构成，DNA 识别域由多个TALE 蛋
白连接而成。该系统能对DNA 靶序列进行剪切，造成DNA 双链断裂，诱导DNA 产生修复，从而达到对基因
序列进行改造的目的。下列说法错误的是（ ）
A．TALE 能识别DNA 特异位点，发挥靶向作用
B．FokI 内切核酸酶作用于DNA 的磷酸二酯键
C．可用显微注射的方式将目的基因导入家犬的受精卵
D．受精卵通过有丝分裂形成体积增大的桑葚胚
【答案】D
【解析】“TALEN 编辑体系主要由特异性的DNA 识别域和非特异性的FokI 内切核酸酶构成，DNA 识别域由
多个TALE 蛋白连接而成。该系统能对DNA 靶序列进行剪切”，这说明TALE 确实能识别DNA 的特异位点，
并发挥靶向作用，A 正确；FokI 内切核酸酶的作用是切割DNA，而DNA 的基本结构单元是核苷酸，核苷酸
之间是通过磷酸二酯键连接的。所以，当FokI 内切核酸酶切割DNA 时，它实际上是在切断磷酸二酯键，B
正确；在基因工程中，将目的基因导入动物细胞（如家犬的受精卵）的常用方法是显微注射，C 正确；桑
5
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葚胚体积没有更大，D 错误。
知识串联3 DNA 的粗提取与电泳鉴定
1．DNA 的粗提取与鉴定的注意事项
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA 分子的断裂，导致DNA 分子不能形成丝状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
可选用鸡血细胞作为材料。
(3)鉴定DNA 时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加入物质的量浓度为2 mol/L
的NaCl 溶液；在实验组试管中加入DNA 丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看
到加入DNA 丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA 量太少。
2．DNA 片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压
灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需
试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污
染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5)观察DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
【典例3】 DNA 粗提取与鉴定的实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”，下列说法正确的是
（ ）
A．实验材料可以选择猪的成熟红细胞或洋葱细胞
B．研磨液要放在4℃冰箱中静置是因为低温可以减缓DNA 被酶降解
C．DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，在2mol/L 的NaCl 溶液度最小
D．可以利用DNA 溶于酒精的特性将DNA 提取出来
【答案】B
【解析】猪为哺乳动物，成熟红细胞不含细胞核，不能用于DNA 的粗提取，A 错误；研磨液静置要放在4℃
冰箱中静置的目的是为了防止DNA 被细胞中的DNA 酶降解，B 正确；DNA 在不同浓浓度的NaCl 溶液中溶解
度不同，在2mol/L 的NaCl 溶液度最大，C 错误；利用DNA 不溶于酒精，而蛋白质等溶于酒精，可将DNA 与
蛋白质等分离，D 错误。
核心整合二 PCR 技术和蛋白质工程
知识串联1 PCR 技术
1.原理：DNA 半保留复制。
2.条件：DNA 模板、2 种引物、耐高温的DNA 聚合酶和4 种脱氧核苷酸。
3.扩增过程
过程
说明
图解
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变性
温度超过90 ℃时，双链DNA 解聚为
单链
复性
温度下降到50 ℃左右时，两种引物
通过碱基互补配对与两条单链DNA 结
合
延伸
温度上升到72 ℃左右时，溶液中的
4 种脱氧核苷酸在耐高温的DNA 聚合
酶的作用下，根据碱基互补配对原则
合成新的DNA 链
【易错提醒】
①复性不一定均为引物与DNA 模板结合。复性时，引物与DNA 模板的结合是随机的，也存在DNA 解开的两
条链的结合。
②PCR 反应的结果不都是所需的DNA 片段。因为第一次循环得到的DNA 片段只有一种引物，比所需的DNA
片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA 片段，这样的片段存在两种引物。
【典例1】PCR 技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温
度称为引物的Tm 值。下列叙述正确的是（ ）
A．引物与模板链的结合属于延伸过程
B．变性过程的温度一般要低于复性过程
C．复性过程的温度应设置为略低于Tm 值
D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合
【答案】C
【解析】PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，引物与模板链的结合
属于复性过程，A 错误；变性过程的温度一般要高于复性过程，变性的目的是使DNA 解旋成为单链，B 错误；
题意显示，引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm 值，复性过程的温度应设置为略低于
Tm 值，否则会导致解螺旋发生，C 正确；引物的 Tm 值越接近，引物之间越不容易结合，因为该温度下氢
键不容易形成，D 错误。
知识串联2 蛋白质工程
(1)目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
(2)操作手段：改造或合成基因。
(3)设计流程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变
相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
【典例2】天然β 淀粉酶耐热性差，不利于工业化应用。研究人员将某种天然β 淀粉酶的第476 位天冬氨
酸替换为天冬酰胺后，其耐热性明显提升。下列叙述正确的是（ ）
A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．该改造首先要预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，这是因为结构与功能相适应
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C．该工程根据中心法则推断出的新的天然β 淀粉酶的脱氧核苷酸序列是唯一的
D．该改造过程是在分子层次上进行的，要对天然β 淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造
【答案】B
【解析】蛋白质工程生产的是自然界中不存在的蛋白质，而不是自然界已有的蛋白质，A 错误；蛋白质工
程的基本途径是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，因为蛋白质的结构决定其功能，所以
要先预期功能再设计结构，B 正确；由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能有多种密码子对应，所以
根据中心法则推断出的新的天然β 淀粉酶的脱氧核苷酸序列不是唯一的，C 错误；蛋白质工程是在分子层
次上进行的，但它不是对天然β 淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造，而是通过对基因的改造来实现对蛋白
质的改造，D 错误。
【
题型1 基因工程的基本工具
1．（2024·贵州·高考真题）生物学实验中合理选择材料和研究方法是顺利完成实验的前提条件。下列
叙述错误的是（ ）
A．稀释涂布平板法既可分离菌株又可用于计数
B．进行胚胎分割时通常是在原肠胚期进行分割
C．获取马铃薯脱毒苗常选取茎尖进行组织培养
D．使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端
【答案】B
【解析】稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足
够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就
能推测出样品中大约含有多少活菌，A 正确；在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或
囊胚，B 错误；马铃薯顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒，所以可以选取马铃薯茎尖进
行组织培养获得脱毒苗，C 正确；不同的限制酶识别的DNA 序列不同，但使用不同的限制酶也能产生相同
的黏性末端，D 正确。
【易错提醒】胚胎分割时，应选择桑葚胚或囊胚。
2．（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA 进行限制酶酶切时，发现DNA 完全没有被酶切，分析可能
的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA 突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA 甲基化不敏感的限制酶
8
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【答案】B
【解析】限制酶失活会使DNA 完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A 正确；酶切条件不合适通常会使
切割效果下降，调整反应条件如温度和PH 等，调整酶的用量没有作用，B 错误；质粒DNA 突变会导致限制
酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C 正确；质粒DNA 上酶切位点
被甲基化修饰，会导致对DNA 甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA 甲基化不敏感的限制
酶，D 正确。
3．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶
可催化PET 降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2 种方法。回答下列问题：
(1)方法1 从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源
制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、
等营养物质。
(2)方法2 采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，
该技术还需要 、 、 等“分子工具”。
(3)除了上述2 种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微
生物。
(4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄
磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水
解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。
【答案】(1) 选择 水 无机盐 氮源
(2) 基因工程（或转基因） 限制酶 DNA 连接酶 载体（或质粒）
(3)诱变育种
(4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀
【解析】（1）方法1 从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择
培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛
选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和
氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。
（2）方法2 采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，
即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA 连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的
基因表达载体的构建。
（3）除了上述2 种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶
的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。
（4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵
黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以
水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过
定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以
及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和
菌落直径的比值作为判断依据。
【易错提醒】培养基的基本成分：水、无机盐、碳源和氮源。
4．（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为抗原
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来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原
代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中PEG 对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
【答案】(1)不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2)未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【解析】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物
质PEG 可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融
合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈
阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA 连接酶能连接DNA 片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH 位于3'端，①②③脱氧核苷酸链
的两端基团有误；DNA 连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧
核苷酸链的3'端的-OH 相连，④符合题意。
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题型2 基因工程的基本操作程序
5．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，
应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因
是 。
【答案】(1)两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结合
(2) EcoR Ⅰ和NotI Age Ⅰ和Hind Ⅲ
(3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床
(4)排除PCR 体系中外源DNA 的污染
(5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR 以应对感染
【解析】（1）利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模
板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结合
（2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoR Ⅰ和NotI 的识别序列，且这两个序列位
于启动子和终止子之间，因此，将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是EcoR Ⅰ和NotI。为提高转基因
效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用Age Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因
为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。
（3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将
胚胎移植到小鼠c 的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚
胎的存活率。
（4）利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组作为空白对照，这样可
11
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以排除PCR 体系中外源DNA 的污染，提高实验结果的可信度。
（5）若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而
机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR 无法表达，因而干扰
素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。
【易错提醒】PCR 中复性的目的是让引物与模板链结合。
6．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产
等。研究人员对酿酒酵母菌株A 进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题：
(1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用
于制作果酒等。
(2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。
(3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A 存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有
和 。
(4)菌株A 含有1 个FLO 基因，其表达的FLO 蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO 蛋白量与乙醇产量成正相
关，研究人员基于菌株A 构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B 的目的是 ，预期菌株
A、B、C、D 发酵中乙醇产量的高低为 。
(5)菌株A 中，X 和Y 基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X 和Y 基因融合在一起，构建了
XY 融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E 中无单独的X 和Y 基因，
且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A 到菌株E 的构建思路 。
【答案】(1) 异养兼性厌氧 酒精
(2)新鲜水果表皮附着酵母菌
(3) 平板划线法 稀释涂布平板法
(4) 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D
(5)从菌株A 获得X、Y 基因，使用4 种引物分别扩增X、Y 基因，其中X 基因后端和Y 基因前端的引物末端
部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR 产物，接着利用融合PCR 技术构建融合基因，再将获得的融
合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。
【解析】（1）酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于异养兼性厌氧型微生物，在无氧条件下能
进行酒精发酵，因此常用于制作果酒。
（2）传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，因为新鲜水果表面附着着酵母菌。
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（3）实验室获得该单一菌种的分离方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法中，经过一定
的稀释后将菌液涂布在固体培养基上，可以获得单菌落；平板划线法是在无菌平板表面进行连续划线，微
生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经多次划线培养后，可在平板表面得到单
菌落。
（4）菌株B 导入不含FLO 基因的表达载体作为空白对照组，可以排除表达载体对乙醇产量结果的影响，根
据题干可知，FLO 基因表达的FLO 蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO 蛋白量与乙醇产量成正相关，FLO 基
因数：菌株C＞菌株B＞菌株D，所以乙醇产量：菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D。
（5）菌株E 中无单独的X 和Y 基因，菌株A 含有X 和Y 基因，需要先利用限制酶从菌株A 获得X、Y 基因，
使用4 种引物分别扩增X、Y 基因，其中X 基因后端和Y 基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具
有重叠链的PCR 产物，利用融合PCR 技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因
表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。
7．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国
研究人员发现，基因S 在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基
因（两品种中基因S 序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S 启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN 克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S 的优质大豆品种YZ。根据题19
图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制
酶是 ；此外，不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳
时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农
杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ 所得再生植株YZ-1 的种子变大。同时将从TL 克隆的“启动子T+基因
S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2 的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN 较TL 种子
大的原因是 。
【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）
(2)EcoR Ⅰ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链
接）
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(3)酶切后的空载体片段，启动子D+基因S 片段 PCR
(4)品种DN 的基因S 上游启动子效应比TL 强，使得基因S 表达量更高，种子更大
【解析】（1）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA 的转录，是一段DNA 片段，其基本组
成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
（2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA 序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶
EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；
②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，
形成的DNA 片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向
连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
（3）①DNA 电泳可以分离不同大小的DNA 片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子
D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还
应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；
②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR 等技术检测受体细胞的DNA 上是否插入目的基因或
目的基因是否转录出mRNA。
（4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1 导入的目的基因为取自品种DN 的“启动子D＋基因S”序列，
再生植株YZ-2 导入的目的基因为取自品种TL 的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因
S 序列无差异”可推测：品种DN 的基因S 上游的启动子D 的效应强于品种TL 的启动子T，启动子D 使基因
S 表达量更高，因而种子更大。
【易错提醒】启动子和终止子就是一段特殊的DNA 序列。
8．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组
织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因
上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包
含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表
达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图
B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活
报告基因的表达（图C）。
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获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR
扩增含有捕获载体序列的DNA 片段。对PCR 产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的
插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其
在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是
基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA 片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载
体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G 和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应
检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕
获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B 所示载体进行了改造，期望改造后的
载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因
功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达
(2)C
(3)各组织器官中G 和H 的mRNA
(4)
【解析】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功
能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。
（2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,
增强子是含有特定碱基序列的DNA 片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，
AB 正确；
C、由图C 可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C 错误；
C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D 正确。
故选C。
（3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR 等技术检测其他器官细胞中G 和H 两个
基因是否转录出相应的 mRNA。
（4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体
中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因
突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研
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究某目的基因的功能，可将图B 所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如
下：
。
9．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技
术研究。回答下列问题：
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体
融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完
整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动
子pL 和下游的终止子结构如图a。图b 是一种Ti 质粒的结构示意图，其中基因gus 编码GUS 酶，GUS 酶活
性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L 的启动子pL 活性的影响。从图a 所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其
与相同限制酶酶切的Ti 质粒连接，再导入烟草。随机选取3 组转基因成功的烟草（P1、P2 和P3）进行病
原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL 的活性增强，其中 的诱导作
用最强。
②现发现栽培种百合B 中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L
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的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。
【答案】(1)纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素
(2) 花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目
(3)Hind Ⅲ、BamH Ⅰ 交链格孢 利用转基因技术将百合B 中L 基因的启动子替换为野生百合中L
基因的启动子pL
【解析】（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和
果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素
诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。
（2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观
察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。
（3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，启动子两侧都有两种酶，若要获得pL 并连接到质粒上，
可选用限制酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ进行酶切，以替换Ti 质粒中的启动子，从而达到根据GUS 酶活性反映启动
子活性的目的。根据图c 的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS 酶活性都最高，可确定
其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B 中L 基因的
启动子替换为野生百合中L 基因的启动子pL。
题型3 蛋白质工程的原理和应用
10．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝
酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1
次PCR 扩增出该基因的中间部分，再通过第2 次PCR 分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序
列，如图所示，回答下列问题：
(1)分析不同物种的GPD 蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的
，确定DNA 序列，进而设计1 对引物。以该菌株基因组DNA 为模板进行第1 次PCR，利用 凝胶电泳
分离并纯化DNA 片段，进一步测定PCR 产物的序列。在制备PCR 反应体系时，每次用微量移液器吸取不同
试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。
(2)若在上述PCR 扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是
__________。
A．DNA 模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染
B．每个引物与DNA 模板存在2 个配对结合位点
C．在基因组中Gpd 基因有2 个拷贝
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D．在基因组中存在1 个与Gpd 基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd 基因，分别用限制性核酸内切酶Pst Ⅰ和Sal Ⅰ单酶切基因组DNA 后，各自用DNA 连
接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR
产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA 为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二
次PCR 的一对引物，其序列应是DNA 链上的 （A．P1 和P2 B．P3 和P4 C．P1 和P4 D．P2 和
P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd 基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd 基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd 基
因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用
酿酒酵母高效合成甘油的目的。
【答案】(1)密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头
(2)C
(3) 冷的95%乙醇 D 调控
(4)基因数据库/序列数据库 表达载体
【解析】（1）分析不同物种的GPD 蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的
密码子，根据碱基互补配对，确定DNA 序列，进而设计1 对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标
DNA 片段。在制备PCR 反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以
避免交叉污染。
（2）A、DNA 模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A 错
误；
B、每个引物与DNA 模板存在2 个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA 片段，从而出现另外一条条带，B
错误；
C、在基因组中Gpd 基因有2 个拷贝，扩增出的DNA 是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C 正确；
D、在基因组中存在1 个与Gpd 基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外
一条条带，D 错误。
（3）DNA 在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA 经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的
95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。PCR 过程中，子链的延伸方向为5'→3'，结合图示可知，应选择P2 和P3
引物进行第二次扩增。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。
（4）为确定克隆获得的Gpd 基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者
相同，则说明克隆获得的Gpd 基因准确。将Gpd 基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组
质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
11．（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造
β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答
下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性
明显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
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(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基因
表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
【答案】(1)蛋白质
(2)③
(3)②
(4)标记基因
(5)筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【解析】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段
长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶
切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA
为模板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
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【易错提醒】蛋白质工程是生产自然界不存在的蛋白质，操作对象仍是基因。
12．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之
一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a 是 ，物质b 是 。在生产过程中，物质b 可能不同，合
成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利
用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图
所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导
致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要
写出实验设计思路 。
【答案】(1)氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性
(2)从基因文库中获取目的基因 通过DNA 合成仪用化学方法直接人工合成 DNA 双链复制
(3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破
坏
(4)设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理
过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间
【解析】（1）据分析可知，物质a 是氨基酸序列多肽链，物质b 是mRNA。在生产过程中，物质b 可能不同，
合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。
（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、
通过DNA 合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA 双链复
制。
（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延
长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血
活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后
的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理
后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间
和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
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（4）为比较不同物质的抗凝血活性差异，可以设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲
处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需
要的时间，凝血时间越长，抗凝血 活性越高。
题型4 PCR 技术及其应用
13．（2024·广西·高考真题）M 蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M 基因表达可控的实
验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre 重组酶来敲除两个LoxP 位点间的序
列，同时利用体内表达的蛋白A 激活诱导型T 启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M 基因（M-GFP）的表
达，恢复小鼠自身被敲除的M 基因功能，同时便于示踪。回答下列问题：
注：基因型A/+指的是A 基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP 位点的
M 基因称为floxM。
(1)在PCR 扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于
引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1 时，为了阻断A 基因的表达，从转录水平考虑，
连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2 是否构建成功，
需要限制酶切割载体后，再进行 。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2 方面）。
(3)为了快速高效繁育出含有4 对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/
+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM 小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交
后最终获得基因型为 实验模型小鼠。
(4)为了实现M 基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A 蛋白的四环素，抑制T 启动
子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。
【答案】(1) 5′端 两端包含loxP 序列的终止子 两端包含loxP 序列的可转录出终止密码子
相应的DNA 序列 电泳
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(2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压
(3)cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM
(4)添加四环素会竞争性结合A 蛋白，无法激活T 启动子，导致M-GFP 基因不能表达，从而不能恢复被敲除
的M 基因的功能；不添加四环素，A 蛋白基因表达激活T 启动子，启动M-GFP 基因表达，从而恢复被敲除的
M 基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。
【解析】（1）PCR 扩增DNA 时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。
终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA 片段。转录
是以DNA 为模板合成RNA 的过程。从转录水平考虑为了阻断A 基因的表达，连接的片段可以是两端包含
LoxP 序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA 上的三联体碱基序列。从翻译
水平考虑为了阻断A 基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP 序列的可转录出终止密码子相应的DNA
序列。为鉴定载体2 是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条
带。
（2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定
期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH 和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和
繁殖。
（3）实验的目的是制备M 基因表达可控的实验模型小鼠，对M 基因的控制是通过蛋白A 激活诱导型T 启动
子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M 基因，方便观察 M 基因的表达情况，而自身
所带的M 基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP 位点的M 基因可被Cre 重组酶敲除，所以需要构建两端添
加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre 重组酶来切除自身
的M 基因，同时还要有表达蛋白A 的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M 基因来替换被敲除的M 基因。
综上分析，需进行如下杂交：
最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM 的实验模型小鼠。
（4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A 蛋白，无法激活T 启动子，导致M-GFP 基因不
能表达，从而不能恢复被敲除的M 基因的功能；不添加四环素，A 蛋白基因表达激活T 启动子，启动M-GFP
基因表达，从而恢复被敲除的M 基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。
14．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A 的野生型（含NV 基
因）、突变体（NV 基因突变）和转基因菌株（转入NV 基因），检测三种菌株NV 酶的生成与培养液中的葡
萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。
检测用菌
株
蔗糖
NV 酶
葡萄糖（培养液中）
野生型
+
+
+
野生型
—
—
—
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突变体
+
—
—
转基因菌
株
+
+
+
回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV 基因表达。NV 酶的作用是 。检测NV 酶活性时，需测定
的指标是 （答出1 点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA 随机插入野生型菌株基因组DNA 筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组
DNA 作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV 基因”）配对的引物进行PCR 扩增。若突变体扩
增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基
因序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将NV 基因导入 细胞获得的。在构建NV
基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量
（或蔗糖的减少量等）
(2) NV 基因 > T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列
(3)突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞
【解析】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV 酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基
因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV 酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，
将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。
（2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩
增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA
中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而
突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，
扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则
表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。
（3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由
于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入
突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有
特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因
的细胞。
【易错提醒】标记基因的作用是帅选出成功导入目的基因的受体细胞。
15．（2024·江西·高考真题）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变
体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C
基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回
答下列问题：
(1)在C 基因两侧设计引物，PCR 扩增，电泳检测PCR 产物。如图泳道1 和2 分别是突变体Cer1 与野生型
（WT，纯合体）。据图判断，突变体Cer1 中c 基因的突变类型是 。
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(2)将突变体Cer1 与纯合野生型杂交．F1全为野生型，F1与突变体Cer1 杂交，获得若干个后代，利用上述
引物PCR 扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR 产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道
（从1~5 中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。
(3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D 基因（位于另一条染色体上）也发生了
突变，产生了基因d1，其编码多肽链的DNA 序列中有1 个碱基由G 变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原
因是 。
(4)假设诱变过程中突变体Cer1 中的D 基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因d2。CCDD 与ccd2d2个体
杂交，F1的表型为野生型，F1自交，F2野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格：
F2部分个体
基因型
棕榈酸（填“有”
或“无”）
16-羟基棕榈酸（填
“有”或“无”）
颖壳蜡质（填“有”
或“无”）
Ccd2d2
有
①
无
CCDd2
有
有
②
【答案】(1)碱基对的缺失
(2) 3 1 1：1
(3)密码子具有简并性
(4) 9：7 有 有
【解析】（1）图示为在C 基因两侧设计引物，PCR 扩增，电泳检测PCR 产物，c 基因是C 基因突变而来，c
基因两侧的碱基序列与C 基因相同，PCR 扩增也能扩增c 基因，由图可知，泳道1 是突变体Cer1，则扩增c
基因时两引物间的长度为1100bp，泳道2 是野生型（WT，纯合体），则扩增C 基因时两引物间的长度为
2000bp，说明c 基因比C 基因长度变短，是碱基对的缺失引起的突变。
（2）突变体Cer1 为cc，纯合野生型为CC，则F1为Cc，F1与突变体Cer1 杂交后代中Cc：cc=1：1，电泳
检测PCR 产物，可以分别得到与如图泳道3 和泳道1 中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为1：1；
（3）编码多肽链的DNA 序列中有1 个碱基由G 变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是密码子具有简
并性；
（4）由题意可知，C/c、D/d2基因遵循基因的自由组合定律，因此CCDD 与ccd2d2个体杂交，F1为
（CcDd2），表型为野生型，F1（CcDd2）自交，F2野生型与突变型的比例为C-D-：（ccD-+C-d2d2+ccd2d2）
=9：7；Ccd2d2含有C 基因无D 基因，有16-羟基棕榈酸，由于不含D 基因，因为16-羟基棕榈酸合成蜡质过
程中必需有D 基因，故无颖壳蜡质；CCDd2含有C 基因和D 基因，有16-羟基棕榈酸，也有颖壳蜡质。
16．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉
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神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。
(1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生 ，经嗅觉神经元轴突末端与
下一个神经元形成的 将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。
(2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列
（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键
在于 序列所编码的蛋白区段。
(3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），
利用PCR 技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA 的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶Hinf Ⅰ对扩增产
物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR 产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表
明酶切片段长度之和大于PCR 产物长度，推断PCR 产物由 组成。
(4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过
程（图丙）。
如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分
子即可被动物感知的原因 。
【答案】(1) 兴奋/动作电位/神经冲动 突触
(2)非保守
(3)长度相同但非保守序列不同的DNA 片段
(4)少量的气体分子通过活化的G 蛋白、活化的C 酶，在C 酶的催化下合成大量的cAMP 使Na+通道打开，
Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知
【解析】（1）气味分子刺激感受器产生兴奋。嗅觉神经元轴突末端、神经元间隙与下一个神经元组成突
触，包括突触前膜、突触间隙和突触后膜。
（2）不同气味受体能特异性识别相应气味分子的关键在于蛋白质中结构不同的部分，由非保守序列编码。
（3）由图可知，PCR 产物含保守序列和非保守序列，若非保守序列不同，酶切产物的长度可能不同，导致
酶切片段长度之和大于PCR 产物长度，因此PCR 产物由长度相同但非保守序列不同的DNA 片段组成。
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（4）由图丙可知，少量的气体分子通过活化G 蛋白使得C 酶活化，在C 酶的催化下，由ATP 合成大量的
cAMP ，促使Na+通道打开，Na+内流，导致神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知。
17．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中
引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X 基因时，PCR 反应中需要使用Taq DNA 聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I 和 SalI 限制酶处理质粒和X 基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如
图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源
相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH 值下降。兴趣小组通
过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓
度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮
源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
【答案】(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，
而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基
中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3) 乳酸或有机酸 9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
(5)提取、分离、纯化
【解析】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA
聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X 基
因时，PCR 反应中需要使用Taq DNA 聚合酶。
（2）据图可知，使用BamH I 和 Sal I 限制酶处理质粒和X 基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基
因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因
此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环
素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
（3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分
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子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相
对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发
酵液的pH 值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3 种，酵母粉浓度也有3 种，
因此理论上应设置3×3=9 组实验。
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进
行高密度发酵时，温度会升高。
（5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等
方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
预测1 围绕基因工程的基本工具，考查科学思维
1．某同学对质粒进行限制酶切割时，发现质粒完全没有被切割。分析可能的原因并提出解决方法，下列
相关叙述错误的是（ ）
A．限制酶已失活，换成新限制酶
B．酶切温度过高，适当降低温度
C．限制酶用量少，适当增加酶量
D．质粒发生突变，换成正常质粒
【答案】C
【解析】限制酶失活会使DNA 完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A 正确；酶切温度过高使酶变性失
活，无法使DNA 切割，因此应该降低温度，B 正确；限制酶用量过少，仍有部分DNA 被切割，而不是完全
没有被切割，C 错误；质粒DNA 突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应
更换为正常质粒，D 正确。
2．如图所示三个DNA 片段依次表示EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列
有关叙述错误的是（ ）
A．三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同
B．这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端
C．BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割DNA 片段形成的末端不能彼此连接
D．图中的DNA 片段被EcoR Ⅰ切割后，会增加两个游离的磷酸基团
【答案】C
【解析】根据题图并结合三种限制酶的切割位点可知，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，且长度
大小相同，A、B 正确；用BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割DNA 片段会形成相同的黏性末端，故BamH Ⅰ和Sau3A
Ⅰ切割DNA 片段形成的末端能按照碱基互补配对彼此连接，C 错误；图中的DNA 片段被EcoR Ⅰ切割后，会
断裂两个磷酸二酯键，从而增加两个游离的磷酸基团，D 正确。
3．一种双链DNA 分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA 片段的电泳结
果作为分子量标记（下图左边一列）。关于该双链DNA，下列说法错误的是（ ）
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A．该DNA 分子呈环状结构，质量大小为10kb
B．该DNA 分子可能含有多个RNA 聚合酶识别位点
C．该DNA 分子中有一个NotI 识别位点和两个EcoRI 切点
D．该双链DNA 分子其NotI 识别位点与EcoRI 识别位点的最短距离为2kb
【答案】D
【解析】单用EcoRI 处理和利用EcoRI 和NotI 双酶切时产生的结果不同，说明DNA 含有NotI 酶切位点，
因为用NotI 处理只产生了一个10kb 的条带，所以该分子必须是环状的，且长度一定是10kb，A 正确；该
DNA 分子是环状的，有多个基因，可能含有多个RNA 聚合酶识别位点，B 正确；因为用NotI 处理只产生了
一个10kb 的条带，说明该环状DNA 上含有一个NotI 切割位点，单用EcoRI 处理后产生了4kb 和6kb 两条带，
说明该环状DNA 上含有2 个EcoRI 切割位点，C 正确：用EcoRI 处理后产生的4kb 的片段，进一步被NotI
酶切为3kb 和1kb 的片段，可以得知NotI 切点与EcoRI 切点的最短距离为1kb，最大距离为3kb，D 错误。
4．DNA 连接酶是基因工程的必需工具，下列有关DNA 连接酶的叙述，正确的是（ ）
A．DNA 连接酶可以将任意的两个DNA 片段连接成一个重组DNA 分子
B．DNA 连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA 连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．E.coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶都能连接黏性末端和平末端
【答案】C
【解析】DNA 连接酶可以连接互补配对的黏性末端或平末端，而非任意的两个DNA 片段，A 错误；DNA 连接
酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列，B 错误；DNA 连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二
酯键的形成，C 正确；E.coli DNA 连接酶仅能连接黏性末端，T4 DNA 连接酶能连接黏性末端和平末端，D
错误。
5．下表为4 种限制酶的识别序列和切割位点(↓表示切割位点),下列叙述正确的是（ ）
限制酶1
—↓GATC—
限制酶2
—CATG↓—
限制酶3
—G↓GATCC—
限制酶4
—GG↓CGCC—
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A．在使用限制酶的同时还需要解旋酶
B．限制酶1 和3 切割DNA 分子产生的黏性末端相同
C．图中限制酶的识别序列都由4 个核苷酸组成
D．限制酶4 作用后产生的是平末端
【答案】B
【解析】限制酶能识别双链DNA 的特定核苷酸序列并在特定位点进行切割，在使用限制酶时，不需要解旋
酶，A 错误；限制酶1 和3 切割DNA 分子，产生的黏性末端相同，均为GATC，B 正确；限制酶3 和4 识别的
序列分别是-GGATCC-和-GGCGCC-，均由6 个核苷酸组成，C 错误；限制酶4 切割后产生的是黏性末端，D 错
误。
预测2 围绕基因工程的操作步骤，考查科学思维
6．研究发现，大豆GmNF-YA19 基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR 扩增GmNF-YA19 基因，构建
GmNF-YA19 基因表达载体并转化烟草，实验过程如图1、2 所示。下列说法正确的是（ ）
A．PCR 扩增GmNF-YA19 基因的前提是根据已知核苷酸序列合成一种引物
B．为获得能正确表达目的基因的重组质粒，应选用限制酶Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ进行切割
C．终止子为一段DNA 序列，其作用是使翻译在所需要的地方停下来
D．重组质粒转化烟草后，可使用含氨苄青霉素的培养基来筛选目的细胞
【答案】D
【解析】PCR 扩增GmNF-YA19 基因的前提是根据已知核苷酸序列合成两种引物，A 错误；根据图中信息，在
质粒的启动子和终止子中间含有的限制酶为Pvu Ⅱ、Kpn I 和EcoR I 三种限制酶切割位点，由于Kpn I 在
质粒中不止一个识别位点，因此最好选用Pvu Ⅱ和EcoR I 进行切割，且在目的基因的两端也存在着两种酶
的识别位点，即选用Pvu Ⅱ和EcoR I 两种限制酶切割含目的基因的DNA 片段和载体，这样可以保证目的基
因和质粒正向连接、避免发生自身环，B 错误；终止子为一段DNA 序列，其作用是使转录在所需要的地方
停下来，C 错误；重组质粒转化烟草后，重组质粒中含有抗氨苄青霉素的基因，该基因可作为标记基因，
因而使用含氨苄青霉素的培养基来筛选成功导入重组质粒的目的细胞，D 正确。
7．RT-PCR 是将RNA 逆转录（RT）成cDNA（与mRNA 互补的DNA 单链）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的
技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
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A．过程Ⅰ获得cDNA 的过程与DNA 复制过程中碱基配对方式相同
B．图中A、B 两种引物在72°C 时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，则共需要加入引物的数量为63 个
【答案】D
【解析】过程I 是逆转录过程，是以mRNA 为模板合成cDNA，该过程的碱基配对方式为A-T、U-A、G-C、C-
G，而DNA 复制过程的碱基配对方式为A-T、T-A、G-C、C-G，二者碱基配对方式不完全相同，A 错误；引物
是通过碱基互补配对结合到模板链上的，该过程是在复性阶段完成的，复性的温度一般为55-60°C，而不
是72°C，72°C 是延伸阶段的温度，B 错误；图中子链的合成是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，从引物的
一端开始进行合成，C 错误；过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，最终产生的DNA 单链数为26=64（条），新合成
的子链数为63 条，则进行6 轮循环，共需要加入引物的数量为63 个，D 正确。
8．尿道下裂是男性特有的单基因遗传性生殖器官畸形疾病，严重影响患者的生长发育和生活质量。某医
学研究团队对一例患者的家系调查后作出如下的家系图，并对家系中的部分成员采取血样进行基因分析，
标记特定基因后进行PCR，向PCR 产物中加入特定的限制酶处理，之后进行凝胶电泳，电泳结果如图所示。
不考虑性染色体同源区段遗传，下列分析不合理的是（ ）
A．该病致病基因不可能是常染色体上的显性或隐性基因
B．该限制酶处理会将致病基因切割成大小两个DNA 片段
C．该家系的尿道下裂致病基因是由Ⅰ-2 引入到该家系的
D．Ⅲ-2 和正常男性婚配所生子女患尿道下裂的概率是1/2
【答案】D
【解析】由遗传家系图看出，Ⅱ-5 和Ⅱ-6 不患病，但是Ⅲ-3 患病可以推出为隐性遗传病，再结合电泳图，
可以看出，Ⅲ-3 只含有隐性遗传因子，但是他被切割成了两个片段，所以说在致病基因上有限制酶的酶切
位点 ，被切成两个片段，若为常染色体隐性遗传病，则Ⅱ-5 和Ⅱ-6 都应该有隐性的致病基因，但是由电
泳图可以看出，Ⅱ-6 无致变基因，所以该遗传病为伴X 染色体隐性遗传病，AB 不符合题意；由上面的AB
选项分析可知，该致病基因为伴X 染色体隐性遗传病由Y 一代的2 引入该家系，C 不符合题意；由电泳图可
以看出，Ⅲ-2 为杂合子（XAXa）正常男性XAY，进行婚配，所生子女患尿道下裂的概率1/4，D 符合题意。
9．苏云金芽孢杆菌产生的Bt 毒蛋白，被棉铃虫吞食后活化，再与肠道细胞表面受体结合，形成复合体插
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入细胞膜中，直接导致细胞膜穿孔，细胞内含物流出直至细胞死亡。科学家将编码Bt 毒蛋白的基因转入棉
花植株，获得的转基因棉花能有效防控棉铃虫的危害。研究发现，若转基因棉花中Bt 含量偏低，取食后的
棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和分化产生新的肠道细胞，修复损伤肠道，由此导致杀虫效果下降。下列
叙述正确的是（ ）
A．由上述信息可知，Bt 毒蛋白引起棉铃虫肠道细胞的死亡属于细胞凋亡
B．具有抗性的棉铃虫存活的原因可能是其肠道细胞表面受体蛋白的结构发生改变
C．将抑制昆虫细胞分裂和分化的基因同时导入棉花中不利于提高转基因棉花杀虫效果
D．转基因棉花具有抗虫性，会诱导棉铃虫发生抗虫性变异
【答案】B
【解析】据题干信息分析可知，苏云金芽孢杆菌产生的Bt 毒蛋白，被棉铃虫吞食后活化，再与肠道细胞表
面受体结合，形成复合体插入细胞膜中直接导致细胞膜穿孔，细胞内含物流出，直至细胞死亡，因此Bt 毒
蛋白引起棉铃虫肠道细胞的死亡属于细胞坏死，A 错误；据题干信息“Bt 毒蛋白需要与肠道细胞表面受体
结合才能发挥作用”分析可知，如果棉铃虫肠道细胞表面受体蛋白的结构发生改变，可能会影响Bt 毒蛋白
与受体的结合，从而降低或消除Bt 毒蛋白的杀虫效果。因此，具有抗性的棉铃虫存活的原因可能是其肠道
细胞表面受体蛋白的结构发生了改变，B 正确；将抑制细胞分裂和分化的基因同时导入棉花细胞中，抑制
棉铃虫肠干细胞分裂和分化产生新的肠道细胞，可提高转基因棉花的杀虫效果，C 错误；棉铃虫抗虫性变
异在环境选择之前就已存在，转基因棉花的抗虫性只是对棉铃虫的抗虫性变异进行了选择，而不是诱导其
发生抗虫性变异，D 错误。
10．研究表明，组蛋白H3 赖氨酸4 甲基转移酶（SMYD3）能通过使染色体组蛋白H3K4 发生甲基化来促进细
胞增殖，具有促进牛体细胞重编程的作用，shRNA 能下调其作用。为探讨其在猪体细胞核移植过程中的重
编程作用，研究者进行有关实验（见图，Fbs 是成纤维细胞；GFP 表达的绿色荧光蛋白可发出绿色荧光）。
下列叙述正确的是（ ）
A．利用Ca2+处理Fbs，可增大其吸收质粒的效率
B．在传代培养猪卵母细胞时，要定期更换培养液
C．SMYD3 使囊胚染色体组蛋白甲基化来影响转录
D．只能用shRNA 基因替换SMYD3 基因作为实验对照
【答案】C
【解析】Fbs 是动物细胞，使用显微注射法可促进质粒进入细胞，A 错误；传代培养可以增加细胞的数量，
但卵母细胞已经在进行减数分裂无法进行传代，只能在培养基中促进其分裂至减数分裂Ⅱ中期，B 错误；
由题意可知SMYD3 能通过使染色体组蛋白H3K4 发生甲基化，来促进细胞增殖，这表明SMYD3 使囊胚染色体
组蛋白甲基化来影响转录，C 正确；图示为实验组的过程，其对照组为向猪Fbs 注入空白质粒或者含shRNA
基因-GFP 基因的质粒，D 错误。
预测3 围绕DNA 的粗提取与鉴定，考查实验探究能力
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11．科研人员选取粳稻品种水稻叶片组织进行DNA 的粗提取与鉴定，下列叙述错误的是（ ）
A．水稻叶片组织的DNA 不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
B．将水稻叶片研磨液进行离心取上清液置于烧杯中
C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌卷起丝状物，提高DNA 的粗提取量
D．电泳鉴定时，通过观察DNA 片段在凝胶中的迁移距离判断其大小
【答案】C
【解析】水稻叶片组织的DNA 不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，A 正确；将水稻叶片研磨液进行离心取
上清液置于烧杯中，B 正确；用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌卷起丝状物，让DNA 充分溶解在NaCl 溶液中，
可提高DNA 的粗提取量，C 错误；电泳鉴定时，通过观察DNA 片段在凝胶中的迁移距离判断其大小，D 正确。
12．将新鲜猪肝剪碎后加入食盐研磨成匀浆，加入蒸馏水搅拌后再加入SDS（SDS 能破坏膜结构，使蛋白质
变性，形成SDS-蛋白复合物）。65℃水浴10min，经搅拌、过滤获取滤液。向滤液中加入氯化钾溶液，搅
拌混匀后离心，得到DNA 滤液。取2 倍滤液体积的95%乙醇沿着烧杯壁缓慢加入滤液中，静置后得到白色
絮状物。取一部分白色絮状物与双缩脲试剂反应，颜色变化不明显。若上述过程未经氯化钾溶液处理，得
到的白色絮状物用双缩脲试剂鉴定，出现紫色络合物。下列说法错误的是（ ）
A．加入食盐的目的是溶解DNA 和过滤去除不溶的杂质
B．65℃水浴处理可使蛋白质变性，而DNA 不降解
C．获取白色絮状物后加入二苯胺试剂，沸水浴加热时即可观察到鉴定结果
D．氯化钾溶液处理可更好地去除SDS-蛋白复合物
【答案】C
【解析】DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同，加入食盐的目的是溶解DNA 和过滤
去除不溶的杂质，A 正确；65℃水浴处理可使蛋白质变性，而DNA 不降解，DNA 热稳定性比蛋白质高一些，
B 正确；获取白色絮状物后，需要加入氯化钾溶液处理，加入二苯胺试剂，沸水浴加热时需等待相应时间
可观察到鉴定结果，C 错误；若上述过程未经氯化钾溶液处理，得到的白色絮状物用双缩脲试剂鉴定，出
现紫色络合物，则说明存在蛋白质成分，推测氯化钾溶液处理可更好地去除SDS-蛋白复合物，D 正确。
13．关于DNA 粗提取与鉴定的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．可选择哺乳动物的成熟红细胞和肝细胞作为实验材料
B．实验中将研磨液更换为蒸馏水，DNA 提取的效率基本不变
C．DNA 鉴定时，沸水浴加热会使DNA 双螺旋结构发生改变
D．DNA 析出时，用玻璃棒快速搅拌以提高DNA 提取量
【答案】C
【解析】哺乳动物的成熟红细胞无细胞核和细胞器，不能作为DNA 粗提取与鉴定的实验材料，A 错误；研
磨液能够溶解细胞膜，促使细胞破裂，从而释放出细胞内的DNA，同时能够稳定溶液的pH 值，防止DNA 在
pH 变化时降解或变性，实验中将研磨液更换为蒸馏水，DNA 提取的效率将降低，B 错误；鉴定过程中沸水
浴加热可能使DNA 双螺旋结构发生改变，C 正确；DNA 析出过程中，用玻璃棒搅拌时动作要轻柔，以防止
DNA 断裂，从而获得较完整的DNA 分子，D 错误。
14．DNA 粗提取与鉴定的实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”，下列说法正确的是（
）
A．实验材料可以选择猪的成熟红细胞或洋葱细胞
B．研磨液要放在4℃冰箱中静置是因为低温可以减缓DNA 被酶降解
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C．DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，在2mol/L 的NaCl 溶液度最小
D．可以利用DNA 溶于酒精的特性将DNA 提取出来
【答案】B
【解析】猪为哺乳动物，成熟红细胞不含细胞核，不能用于DNA 的粗提取，A 错误；研磨液静置要放在4℃
冰箱中静置的目的是为了防止DNA 被细胞中的DNA 酶降解，B 正确；DNA 在不同浓浓度的NaCl 溶液中溶解
度不同，在2mol/L 的NaCl 溶液度最大，C 错误；利用DNA 不溶于酒精，而蛋白质等溶于酒精，可将DNA 与
蛋白质等分离，D 错误。
15．关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．提取DNA 的过程一定要用离心机
B．该实验设置对照的目的是排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
C．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟的目的是使DNA 沉淀
D．鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
【答案】B
【解析】在DNA 的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，
再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A 错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理
的时间要在5 分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，设置对照
组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，B 正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA 位于上清液中，
C 错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA 双螺旋结构会发生改变，D 错误。
情境1：Cre/LoxP 重组酶系统
(1)Cre 重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1 的Cre 基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP 位点。能
介导两个LoxP 位点之间的特异性重组，使LoxP 位点间的基因序列被删除或重组。
(2)LoxP 序列：来源于P1 噬菌体，包括两个13 bp 的反向重复序列和一个8 bp 的间隔区域，反向重复序列
是Cre 重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP 位点的方向。
(3)①同向LoxP：如果两个LoxP 位点位于一条DNA 链上，且方向相同，Cre 重组酶能有效切除两个LoxP 位
点间的序列，仅保留一个LoxP。
②反向LoxP：如果两个LoxP 位点位于一条DNA 链上，但方向相反，Cre 重组酶能导致两个LoxP 位点间的
序列倒位。
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典例赏析：Cre-Loxp 系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre 酶能根据两个Loxp 的
方向删除或倒置位于两个Loxp 序列间的基因，如图1 所示。现使用Cre-Loxp 系统构建TK 基因缺失的病毒
毒株，为研发该病毒的疫苗提供候选毒株，构建过程如图2 所示，下列分析错误的是（ ）
A．图1 中Gene 两端需含有两个相同的碱基序列
B．位于RFP 基因两端的Loxp 序列方向相反
C．Cre 酶处理之前，应初步筛选出有红色荧光基因的病毒
D．Cre 酶在图2 过程中的具有限制酶和DNA 连接酶的功能
【答案】B
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【解析】由图1 判断Cre 酶删除或倒置位于两个Loxp 序列间的基因时，需识别相应的序列，所以GENE 两
端需含有两个相同的碱基序列，A 正确；要通过Cre 酶删除RFP 基因，根据图1 可知，RFP 基因两端的Loxp
序列方向应该相同，B 错误；RFP 基因可表达出红色荧光蛋白，根据红色荧光蛋白表达情况可筛选出TK 基
因被替换为红色荧光基因的病毒，C 正确；限制酶能对DNA 特定位点进行切割，DNA 连接酶能连接黏性末端
和平末端，Cre 酶在处理重组基因片段时具有限制酶和DNA 连接酶的功能，D 正确。
情境2：CRISPR/Cas9 基因编辑
CRISPR/Cas9 系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA 或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR 是成
簇的、规律间隔的、短回文重复DNA 序列。Cas9 蛋白是一种RNA 引导的DNA 内切核酸酶，当细菌受到噬菌
体的侵染时，噬菌体的某段DNA 序列被Cas9 内切酶剪切后整合到CRISPR 的间隔序列区域，当相同种类的
噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA 可以引导Cas9 蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内
的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。
其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9 酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入
原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA 和Cas9 蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过
程如图所示。
典例赏析：我国科研人员利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除了水稻香味抑制基因Badh2，获得了有香味
的水稻，机理如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．sgRNA 的识别序列过短可能会导致编辑对象出错
B．Cas9 蛋白功能类似于限制酶，可以识别并剪切特定DNA 片段
C．在培养基中加入潮霉素，可用于筛选导入基因敲除载体的植物细胞
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D．构建好的基因敲除载体可用农杆菌转化法导入水稻细胞
【答案】B
【解析】由图可知，sgRNA 能识别靶基因的特定序列，引导Cas9 蛋白去切割特定序列，sgRNA 的识别序列
过短可能会导致编辑对象出错，A 正确；由图可知，Cas9 蛋白在功能上属于限制（性内切核酸）酶，可以
剪切特定DNA 片段，sgRNA 能识别靶基因的特定序列，B 错误；由图可知，基因敲除载体中有sgRNA 基因、
Cas9 基因和潮霉素抗性基因，使转基因水稻也带有潮霉素抗性基因，所以在培养基中加入潮霉素进行选择，
C 正确；农杆菌转化法一般适用于双子叶植物，单子叶植物经处理后也可用农杆菌转化，D 正确。
情境3：In－Fusion 技术
In－Fusion 技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何
位点进行一个或多个目标DNA 片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25 个同源碱
基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion 酶能够识别具有相同末端序列的
线性DNA 分子并使其形成黏性末端，DNA 连接酶再将两条DNA 单链黏合起来。
(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR 扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA 片段的
PCR 扩增；③反应体系内形成重组质粒。
(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克
隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA 片段。
典例赏析：在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA 重组方
法：In-Fusion 技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA 序列（即同源序
列），然后用In-Fusion 酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完
整的重组序列。主要操作过程如图示。下列叙述错误的是（ ）
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A．推测In-Fusion 酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键
B．载体A 端和B 端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C．形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基更容易互补配对
D．该技术对目的基因进行PCR，需要经历3 次循环才能得到两端含引物1 和引物2 的目的基因
【答案】C
【解析】分析题意可知，本技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA 序列（即同源
序列），然后用In-Fusion 酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成
完整的重组序列，推测In-Fusion 酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，并且使目的基因与线性化质
粒通过磷酸二酯键连接形成重组质粒的作用，A 正确；若用限制酶切割后黏性末端相同，会导致自身环化
和反向连接等，载体A 端和B 端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B 正确；重组
质粒形成时如果温度远高于50℃，氢键不容易形成，黏性末端的碱基不容易互补配对，C 错误；根据DNA
的半保留复制的特点，可知PCR 第3 轮循环产生的DNA 分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的
序列，因此，需要经过3 轮循环才能得到两端含引物1 和引物2 的目的基因，D 正确。
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