文档内容
第 18 讲 基因工程
目 录
01 考情透视·目标导航
02 知识导图·思维引航
03 核心整合·能力提升
核心整合一 基因工程
知识串联1 限制酶的选择技巧
知识串联2 基因工程的操作步骤
知识串联3 DNA的粗提取与电泳鉴定
核心整合二 PCR技术和蛋白质工程
知识串联1 PCR技术
知识串联2 蛋白质工程
04 题型突破·命题预测
题型1 基因工程的基本工具
题型2 基因工程的基本操作程序
真题突破
题型3 蛋白质工程的原理和应用
题型4 PCR技术及其应用
预测1 围绕基因工程的基本工具，考查科学思维
以热点窥预测 预测2 围绕基因工程的操作步骤，考查科学思维
预测3 围绕DNA的粗提取与鉴定，考查实验探究能力
05 拓展应用·情境推理
情境1 Cre/LoxP重组酶系统
情境2 CRISPR/Cas9基因编辑
情境3 In－Fusion技术考试频
核心考点 考题统计 考情分析
次
（2024 贵州卷）DNA重组技术的工具
（2024 江西卷）基因工程与微生物综
本部分的命题以非选
合
择题为主，属于高考
DNA重组技术的工具 3年5次 （2024 湖南卷）DNA重组技术的工具
必考内容。题目内容
与酶 多，难度往往较大，
（2023 湖北卷）DNA重组技术的工具 试题情境新颖，核心
与单克隆抗体 素养侧重对科学思维
（2024 广西卷）基因表达载体的构建 和科学探究的考查。
（2024 天津卷）将目的基因导入受体 基因工程预计仍是
基因工程的基本操作程 3 年 56 细胞 2025 高考的热点内
序 次 （2024 福建卷）基因工程的基本操作 容，对能力的要求较
步骤 高，涉及重组DNA技
（2024 重庆卷）基因表达载体的构建 术、基因工程的基本
（2024 江西卷）基因工程应用 操作程序等内容，情
（2024 河北卷）基因工程与疫苗 境大多来自大学教材
基因工程及应用 3年9次
和论文文献。
（2024 海南卷）基因工程与制药
借助Cre/LoxP重组酶系统、CRISPR/Cas9基因编辑、In－Fusion技术考查了
情境设计
相关技术的原理和应用，体现了科学思维的核心素养。
基因工程的基本工具
基因工程的基本操作程序
备考要点
蛋白质工程的原理和应用
PCR技术及其应用核心整合一 基因工程
知识串联1 限制酶的选择技巧
1.根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限
制酶SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可
选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。2.根据质粒的特点选择限制酶(如图)
3.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设
切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
【易错提醒】若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接，避免自身环化
和反向连接，提高连接的有效性。
【典例1】下表是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y=C或T，R=A或G）。下列相关叙述正确的是（
）
限制酶 HindⅡ AluⅠ BamHⅠ Sau3AⅠ
识别序
↓ ↓5'- ↓5'- ↓5'-
列及切
5'-GTYRAC-3' AGCT-3' GGATCC-3' GATC-3'
割位点
A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团
B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C．AluⅠ切割后的DNA片段可用E。coliDNA连接酶连接
D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割知识串联2 基因工程的操作步骤
1. 基因表达载体的构建（核心步骤）
2.将目的基因导入受体细胞
细胞类型 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
农杆菌转化法、花粉管
常用方法 显微注射技术 Ca2＋处理法(感受态细胞法)
通道法
原核细胞
受体细胞 受精卵、体细胞 受精卵
使用最广泛的是大肠杆菌
3．目的基因的检测与鉴定
【典例2】科研人员利用TALEN基因编辑技术构建RPE65基因编辑的家犬，建立RPE65基因突变动物模型，
TALEN编辑体系主要由特异性的DNA识别域和非特异性的FokI内切核酸酶构成，DNA识别域由多个TALE蛋
白连接而成。该系统能对DNA靶序列进行剪切，造成DNA双链断裂，诱导DNA产生修复，从而达到对基因
序列进行改造的目的。下列说法错误的是（ ）
A．TALE能识别DNA特异位点，发挥靶向作用
B．FokI内切核酸酶作用于DNA的磷酸二酯键
C．可用显微注射的方式将目的基因导入家犬的受精卵
D．受精卵通过有丝分裂形成体积增大的桑葚胚
知识串联3 DNA的粗提取与电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定的注意事项
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
可选用鸡血细胞作为材料。(3)鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加入物质的量浓度为 2 mol/L
的NaCl溶液；在实验组试管中加入DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看
到加入DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压
灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需
试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污
染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
【典例3】 DNA粗提取与鉴定的实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”，下列说法正确的是
（ ）
A．实验材料可以选择猪的成熟红细胞或洋葱细胞
B．研磨液要放在4℃冰箱中静置是因为低温可以减缓DNA被酶降解
C．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2mol/L的NaCl溶液度最小
D．可以利用DNA溶于酒精的特性将DNA提取出来
核心整合二 PCR技术和蛋白质工程
知识串联1 PCR技术
1.原理：DNA半保留复制。
2.条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
3.扩增过程
过程 说明 图解
温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为
变性
单链
温度下降到50 ℃左右时，两种引物
复性 通过碱基互补配对与两条单链DNA结
合
温度上升到72 ℃左右时，溶液中的
4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合
延伸
酶的作用下，根据碱基互补配对原则
合成新的DNA链
【易错提醒】
①复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。
②PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA
片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
【典例1】PCR技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温
度称为引物的Tm值。下列叙述正确的是（ ）
A．引物与模板链的结合属于延伸过程
B．变性过程的温度一般要低于复性过程
C．复性过程的温度应设置为略低于Tm值
D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合
知识串联2 蛋白质工程
(1)目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
(2)操作手段：改造或合成基因。
(3)设计流程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变
相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
【典例2】天然β淀粉酶耐热性差，不利于工业化应用。研究人员将某种天然β淀粉酶的第476位天冬氨
酸替换为天冬酰胺后，其耐热性明显提升。下列叙述正确的是（ ）
A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．该改造首先要预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，这是因为结构与功能相适应
C．该工程根据中心法则推断出的新的天然β淀粉酶的脱氧核苷酸序列是唯一的
D．该改造过程是在分子层次上进行的，要对天然β淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造
题型1 基因工程的基本工具
1．（2024·贵州·高考真题）生物学实验中合理选择材料和研究方法是顺利完成实验的前提条件。下列
叙述错误的是（ ）
A．稀释涂布平板法既可分离菌株又可用于计数
B．进行胚胎分割时通常是在原肠胚期进行分割
C．获取马铃薯脱毒苗常选取茎尖进行组织培养
D．使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端
【易错提醒】胚胎分割时，应选择桑葚胚或囊胚。
2．（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
3．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶
可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题：
(1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源
制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、
等营养物质。
(2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，
该技术还需要 、 、 等“分子工具”。
(3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微
生物。
(4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄
磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水
解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。
【易错提醒】培养基的基本成分：水、无机盐、碳源和氮源。
4．（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原
来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原
代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。题型2 基因工程的基本操作程序
5．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
回答下列问题：
(1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，
应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因
是 。
【易错提醒】PCR中复性的目的是让引物与模板链结合。
6．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产
等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题：(1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用
于制作果酒等。
(2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。
(3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有
和 。
(4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相
关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是 ，预期菌株
A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为 。
(5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了
XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，
且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路 。
7．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国
研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基
因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制
酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳
时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农
杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因
S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子
大的原因是 。
【易错提醒】启动子和终止子就是一段特殊的DNA序列。
8．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组
织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因
上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包
含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表
达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图
B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活
报告基因的表达（图C）。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR
扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的
插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其
在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是
基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载
体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应
检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕
获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的
载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因
功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
9．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技
术研究。回答下列问题：
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体
融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完
整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动
子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活
性可反映启动子活性。①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其
与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病
原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作
用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L
的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。
题型3 蛋白质工程的原理和应用
10．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝
酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1
次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序
列，如图所示，回答下列问题：
(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的
，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳
分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同
试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。
(2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是
__________。
A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染
B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点
C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝
D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连
接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR
产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二
次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2 B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和
P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基
因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用
酿酒酵母高效合成甘油的目的。11．（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造
β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答
下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性
明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基因
表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR的模板。
【易错提醒】蛋白质工程是生产自然界不存在的蛋白质，操作对象仍是基因。
12．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之
一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合
成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图
所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导
致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要
写出实验设计思路 。
题型4 PCR技术及其应用
13．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实
验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序
列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表
达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题：
注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的
M基因称为floxM。
(1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于
引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，
需要限制酶切割载体后，再进行 。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。
(3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/
+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交
后最终获得基因型为 实验模型小鼠。
(4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动
子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。
14．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基
因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡
萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。
检测用菌
蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中）
株
野生型 + + +
野生型 — — —
突变体 + — —
转基因菌
+ + +
株
回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定
的指标是 （答出1点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组
DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩
增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基
因序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV
基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
【易错提醒】标记基因的作用是帅选出成功导入目的基因的受体细胞。
15．（2024·江西·高考真题）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变
体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C
基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回
答下列问题：
(1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型
（WT，纯合体）。据图判断，突变体Cer1中c基因的突变类型是 。(2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交．F 全为野生型，F 与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述
1 1
引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道
（从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。
(3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因（位于另一条染色体上）也发生了
突变，产生了基因d，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原
1
因是 。
(4)假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因d。CCDD与ccdd 个体
2 2 2
杂交，F 的表型为野生型，F 自交，F 野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格：
1 1 2
F 部分个体 棕榈酸（填“有” 16-羟基棕榈酸（填 颖壳蜡质（填“有”
2
基因型 或“无”） “有”或“无”） 或“无”）
Ccdd 有 ① 无
2 2
CCDd 有 有 ②
2
16．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉
神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。
(1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生 ，经嗅觉神经元轴突末端与
下一个神经元形成的 将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。
(2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列
（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键
在于 序列所编码的蛋白区段。
(3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），
利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产
物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表
明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由 组成。(4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过
程（图丙）。
如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分
子即可被动物感知的原因 。
17．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中
引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如
图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源
相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通
过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓
度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮
源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
预测1 围绕基因工程的基本工具，考查科学思维
1．某同学对质粒进行限制酶切割时，发现质粒完全没有被切割。分析可能的原因并提出解决方法，下列
相关叙述错误的是（ ）
A．限制酶已失活，换成新限制酶 B．酶切温度过高，适当降低温度
C．限制酶用量少，适当增加酶量 D．质粒发生突变，换成正常质粒
2．如图所示三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列
有关叙述错误的是（ ）
A．三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同
B．这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接
D．图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会增加两个游离的磷酸基团
3．一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结
果作为分子量标记（下图左边一列）。关于该双链DNA，下列说法错误的是（ ）
A．该DNA分子呈环状结构，质量大小为10kb
B．该DNA分子可能含有多个RNA聚合酶识别位点
C．该DNA分子中有一个NotI识别位点和两个EcoRI切点
D．该双链DNA分子其NotI识别位点与EcoRI识别位点的最短距离为2kb
4．DNA连接酶是基因工程的必需工具，下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是（ ）
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．E.coli DNA连接酶和T DNA连接酶都能连接黏性末端和平末端
4
5．下表为4种限制酶的识别序列和切割位点(↓表示切割位点),下列叙述正确的是（ ）
限制酶1 —↓GATC—
限制酶2 —CATG↓—
限制酶3 —G↓GATCC—
限制酶4 —GG↓CGCC—
A．在使用限制酶的同时还需要解旋酶
B．限制酶1和3切割DNA分子产生的黏性末端相同
C．图中限制酶的识别序列都由4个核苷酸组成
D．限制酶4作用后产生的是平末端
预测2 围绕基因工程的操作步骤，考查科学思维
6．研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因，构建
GmNF-YA19基因表达载体并转化烟草，实验过程如图1、2所示。下列说法正确的是（ ）
A．PCR扩增GmNF-YA19基因的前提是根据已知核苷酸序列合成一种引物
B．为获得能正确表达目的基因的重组质粒，应选用限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ进行切割
C．终止子为一段DNA序列，其作用是使翻译在所需要的地方停下来
D．重组质粒转化烟草后，可使用含氨苄青霉素的培养基来筛选目的细胞
7．RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的
技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）A．过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中碱基配对方式相同
B．图中A、B两种引物在72°C时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个
8．尿道下裂是男性特有的单基因遗传性生殖器官畸形疾病，严重影响患者的生长发育和生活质量。某医
学研究团队对一例患者的家系调查后作出如下的家系图，并对家系中的部分成员采取血样进行基因分析，
标记特定基因后进行PCR，向PCR产物中加入特定的限制酶处理，之后进行凝胶电泳，电泳结果如图所示。
不考虑性染色体同源区段遗传，下列分析不合理的是（ ）
A．该病致病基因不可能是常染色体上的显性或隐性基因
B．该限制酶处理会将致病基因切割成大小两个DNA片段
C．该家系的尿道下裂致病基因是由Ⅰ-2引入到该家系的
D．Ⅲ-2和正常男性婚配所生子女患尿道下裂的概率是1/2
9．苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白，被棉铃虫吞食后活化，再与肠道细胞表面受体结合，形成复合体插
入细胞膜中，直接导致细胞膜穿孔，细胞内含物流出直至细胞死亡。科学家将编码Bt毒蛋白的基因转入棉
花植株，获得的转基因棉花能有效防控棉铃虫的危害。研究发现，若转基因棉花中Bt含量偏低，取食后的
棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和分化产生新的肠道细胞，修复损伤肠道，由此导致杀虫效果下降。下列
叙述正确的是（ ）
A．由上述信息可知，Bt毒蛋白引起棉铃虫肠道细胞的死亡属于细胞凋亡
B．具有抗性的棉铃虫存活的原因可能是其肠道细胞表面受体蛋白的结构发生改变
C．将抑制昆虫细胞分裂和分化的基因同时导入棉花中不利于提高转基因棉花杀虫效果
D．转基因棉花具有抗虫性，会诱导棉铃虫发生抗虫性变异
10．研究表明，组蛋白H3赖氨酸4甲基转移酶（SMYD3）能通过使染色体组蛋白H3K4发生甲基化来促进细
胞增殖，具有促进牛体细胞重编程的作用，shRNA能下调其作用。为探讨其在猪体细胞核移植过程中的重
编程作用，研究者进行有关实验（见图，Fbs是成纤维细胞；GFP表达的绿色荧光蛋白可发出绿色荧光）。
下列叙述正确的是（ ）
A．利用Ca2+处理Fbs，可增大其吸收质粒的效率
B．在传代培养猪卵母细胞时，要定期更换培养液
C．SMYD3使囊胚染色体组蛋白甲基化来影响转录
D．只能用shRNA基因替换SMYD3基因作为实验对照预测3 围绕DNA的粗提取与鉴定，考查实验探究能力
11．科研人员选取粳稻品种水稻叶片组织进行DNA的粗提取与鉴定，下列叙述错误的是（ ）
A．水稻叶片组织的DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
B．将水稻叶片研磨液进行离心取上清液置于烧杯中
C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌卷起丝状物，提高DNA的粗提取量
D．电泳鉴定时，通过观察DNA片段在凝胶中的迁移距离判断其大小
12．将新鲜猪肝剪碎后加入食盐研磨成匀浆，加入蒸馏水搅拌后再加入SDS（SDS能破坏膜结构，使蛋白质
变性，形成SDS-蛋白复合物）。65℃水浴10min，经搅拌、过滤获取滤液。向滤液中加入氯化钾溶液，搅
拌混匀后离心，得到DNA滤液。取2倍滤液体积的95%乙醇沿着烧杯壁缓慢加入滤液中，静置后得到白色
絮状物。取一部分白色絮状物与双缩脲试剂反应，颜色变化不明显。若上述过程未经氯化钾溶液处理，得
到的白色絮状物用双缩脲试剂鉴定，出现紫色络合物。下列说法错误的是（ ）
A．加入食盐的目的是溶解DNA和过滤去除不溶的杂质
B．65℃水浴处理可使蛋白质变性，而DNA不降解
C．获取白色絮状物后加入二苯胺试剂，沸水浴加热时即可观察到鉴定结果
D．氯化钾溶液处理可更好地去除SDS-蛋白复合物
13．关于DNA粗提取与鉴定的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．可选择哺乳动物的成熟红细胞和肝细胞作为实验材料
B．实验中将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率基本不变
C．DNA鉴定时，沸水浴加热会使DNA双螺旋结构发生改变
D．DNA析出时，用玻璃棒快速搅拌以提高DNA提取量
14．DNA粗提取与鉴定的实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”，下列说法正确的是（
）
A．实验材料可以选择猪的成熟红细胞或洋葱细胞
B．研磨液要放在4℃冰箱中静置是因为低温可以减缓DNA被酶降解
C．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2mol/L的NaCl溶液度最小
D．可以利用DNA溶于酒精的特性将DNA提取出来
15．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．提取DNA的过程一定要用离心机
B．该实验设置对照的目的是排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
C．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟的目的是使DNA沉淀
D．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
情境1：Cre/LoxP重组酶系统
(1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
(2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列
是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。
(3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位
点间的序列，仅保留一个LoxP。
②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的
序列倒位。
典例赏析：Cre-Loxp系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre酶能根据两个Loxp的
方向删除或倒置位于两个Loxp序列间的基因，如图1所示。现使用Cre-Loxp系统构建TK基因缺失的病毒
毒株，为研发该病毒的疫苗提供候选毒株，构建过程如图2所示，下列分析错误的是（ ）A．图1中Gene两端需含有两个相同的碱基序列
B．位于RFP基因两端的Loxp序列方向相反
C．Cre酶处理之前，应初步筛选出有红色荧光基因的病毒
D．Cre酶在图2过程中的具有限制酶和DNA连接酶的功能
情境2：CRISPR/Cas9基因编辑
CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成
簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌
体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的
噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内
的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。
其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入
原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过
程如图所示。
典例赏析：我国科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了水稻香味抑制基因Badh2，获得了有香味
的水稻，机理如图所示。下列叙述错误的是（ ）A．sgRNA的识别序列过短可能会导致编辑对象出错
B．Cas9蛋白功能类似于限制酶，可以识别并剪切特定DNA片段
C．在培养基中加入潮霉素，可用于筛选导入基因敲除载体的植物细胞
D．构建好的基因敲除载体可用农杆菌转化法导入水稻细胞
情境3：In－Fusion技术
In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何
位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱
基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的
线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。
(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的
PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。
(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克
隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。
典例赏析：在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方
法：In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序
列），然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图示。下列叙述错误的是（ ）
A．推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键
B．载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C．形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基更容易互补配对
D．该技术对目的基因进行PCR，需要经历3次循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因
