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知识清单 37 基因工程和蛋白质工程考点1 重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予
生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术
操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫
作重组DNA技术。对基因工程概念的理解：
基因工程的别名 基因剪切拼接技术、重组DNA技术、转基因技术
操作环境 主要在生物体外
操作对象 基因(DNA)
操作水平 DNA分子水平
基本程序 剪切→拼接→导入→表达
结果 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
原理 基因重组
补充说明：
特点 定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限
质粒作为载体的原因，
2．基因工程的基本工具
质粒DNA分子有一个
(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”：切割 DNA分子的工具是限制性 至多个限制酶切割位
点，供外源DNA片段
内切核酸酶，又称限制酶。
插入其中；携带外源
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 DNA片段的质粒进入
受体细胞后，能在细胞
②作用特点：切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，从而达到保护自身
中进行自我复制，或整
的目的；专一性，能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链 合到受体DNA上，随
受体DNA同步复制；
中特定部位的磷酸二酯键断开。
质粒上常有特殊的标记
③作用结果：经限制酶切割产生的 DNA片段末端通常有两种形式—黏性末 基因，便于重组DNA
分子的筛选；质粒不影
端和平末端。
响受体细胞正常的生命
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”：将切下来的 DNA片段拼接成新的 活动。
DNA分子，依靠的是DNA连接酶。
①DNA连接酶的作用：连接两个 DNA片段的末端，拼接成新的 DNA分
子。
②DNA连接酶的种类和特点
种类 E.coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只能将双链 DNA片段 既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，也能
互补的黏性末端连接起 连接双链DNA片段的平末端，但连接平末端的
来 效率相对较低
③作用实质：DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”：要将外源基因送入受体细
胞，还需要有运输工具，这就是“分子运输车”，又叫载体(或运载体)。
①载体的作用：一是作为运载工具，与外源基因(即目的基因)的DNA片段结
合，将目的基因转移到受体细胞中；二是在受体细胞内对目的基因进行大量的复
制。
②常用的载体： 最常用的载体是质粒。其他载体：噬菌体、动植物病毒
等。
③需具备的条件
能在受体细胞中稳定保存并复制。
具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。
具有标记基因，便于筛选含重组DNA分子的细胞。
对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。
3．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的
差异，提取DNA，去除其他成分。
①DNA的溶解性：DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精(利
用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质)。DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度
的NaCl溶液中溶解度不同(利用这一特点，选择适当浓度的NaCl溶液就能使
DNA充分溶解，从而使杂质沉淀：或者让其他成分溶解而使DNA析出，以达到
分离的目的)。
②DNA的鉴定原理：在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝
色。
(2)实验步骤考点2 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产
药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
(2)获取目的基因的方法：从基因文库中获取目的基因；利用 PCR获得和扩
增目的基因
(3)利用PCR获得和扩增目的基因
①含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的
原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸
序列进行大量复制的技术。需要具备的条件有模板、原料、引物、酶、控制温度
等。
②原理：利用DNA半保留复制原理，在体外将目的基因的核苷酸序列不断
地加以复制，使其数量成指数形式扩增(约为2n，其中为扩增循环的次数)。
③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
④PCR的反应及其作用
条件 作用
在一定的缓冲液 提供相对稳定的pH环境；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都
(含Mg2+)中进行 需要Mg2+激活
4种脱氧核苷酸 作为合成DNA子链的原料
DNA母链 作为DNA复制的模板
Taq酶(耐高温) 催化合成DNA子链
引物 使Taq酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
温 度 90℃以上 变性：使DNA片段双链解开
控制 50℃左右 复性：使解开的两条DNA单链分别与相应的引物结合(退火)
72℃左右 延伸：Taq酶催化子链合成
⑤扩增的过程：
第一步：将反应体系(包括双链模板、引物、Taq酶、4种脱氧核苷酸以及酶
促反应所需的离子等)加热至90℃以上，使双链DNA两条链之间的氢键打开，变
成单链，分别作为聚合反应的模板。
第二步：将反应体系降温至50℃左右，使引物分别与模板DNA链3'端的相 注意说明：
应序列互补配对，这个过程称为复性。 为了防止载体或目的基
因的黏性末端自己连接
第三步：将反应体系升温至72℃左右，在Taq酶的催化作用下，将与模板
即所谓“环化”，可用
DNA互补的单个核苷酸加到引物所提供的3'—OH上，使DNA链延伸，产生一 不同的限制酶分别处理
含目的基因的 DNA和
条与模板链互补的单链DNA。
载体，使目的基因两侧
2．基因表达载体的构建 及载体上各自具有两个
不同的黏性末端。体结合，形成重组运载体，最后通过重组运载体将目的基因导入受体细胞。
(2)构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以
遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(3)基因表达载体的组成及其作用
①目的基因：外源DNA分子中有遗传效应的片段。
②启动子：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是一段有特殊序列结构
的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最
终表达出人类需要的蛋白质。
③终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的 DNA片段，是转
录结束点。
④标记基因的作用：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目
的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
(4)基因表达载体的构建过程
(1)用一定的限制酶切割载体，使其出现一个黏性末端(或平末端)的切口。
(2)用限制酶切割目的基因，产生与载体一样的黏性末端(或平末端)。
(3)将切下的目的基因片段与载体混合，再加入适量DNA连接酶，使载体与
目的基因结合成重组DNA分子(如图)。
3．将目的基因导入受体细胞
(1)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称
为转化。转化的实质是将目的基因整合到受体细胞的基因组中，可能存在于细胞
质中，也可能整合到染色体DNA上。
(2)将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和载体的类型不同，所采用的
导入方法也不同，见下表。
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞常用方法 农杆菌转 基因枪法 花粉管通道 显微注射 Ca2+ 处 理 法
化法 法 技术 (CaCl)
2
受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 常用原核细
胞
转化过程 农杆菌能 单子叶植 在植物受粉 将含有目 Ca2+处理细胞
在自然条 物中常用 后，花粉形 的基因的 感受态细胞
件下侵染 的一种基 成的花粉管 表达载体 →将重组表
双子叶植 因转化方 还 未 愈 合 提纯→取 达载体与感
物和裸子 法，但是 前，剪去柱 卵 ( 受 精 受态细胞混
植物，对 成 本 较 头；然后滴 卵)→显微 合→感受态
大多数单 高。操作 加DNA(含目 注射→将 细胞吸收外
子叶植物 过程：将 的基因)至花 注射了目 源DNA分子
没有侵染 包裹在金 柱切面上， 的基因的
能力。将 属颗粒表 使目的基因 受精卵经
目的基因 面的表达 借助花粉管 早期胚胎
插入到 Ti 载体DNA 通道进入胚 培养后移
质粒的 T- 打入受体 囊 入母体子
DNA 上转 细胞中， 宫或输卵
入农杆菌 使目的基 管→获得
导入植物 因与其整 具有新性
细胞→整 合并表达 状的动物
合到受体
细胞的染
色体 DNA
上→表达
4．目的基因的检测与鉴定
(1)检测目的：目的基因导入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，
只有通过检测与鉴定才能知道。
(2)检测对象：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因；检测
目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质。
(3)检测方法
类型 检测内容 方法 结果显示
分 子 目的基因是否插到 从转基因生物中提取 DNA， 如果显示出杂交
水 平 受体细胞的DNA上 用标记的目的基因作探针，进 带，表明日的基
检测 行DNA分子杂交 因已插入染色体
DNA上
目的基因是否转录 从转基因生物中提取mRNA， 如果显示出杂交
出mRNA 进行分子杂交(DNA和mRNA 带，表明转录成
之间杂交) 功目的基因是否翻译 从转基因生物中提取蛋白质， 如 有 杂 交 带 出
成蛋白质 用相应的抗体进行抗原——抗 现，表明目的基
体杂交 因已形成蛋白质
产品
个 体 是否有抗性以及抗 转基因生物的抗性接种实验： 是否赋予了预期
水 平 性的程度；基因工 比较基因工程产品与天然产品 抗性或蛋白质活
鉴定 程产品与天然产品 的功能活性 性
的功能活性是否相
同
考点3 基因工程的应用
1．基因工程在农牧业方面的应用
(1)植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、
抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方
面。
(2)转基因动物成果：动物转基因工程主要用于动物品种改良、建立生物反
应器、器官移植等。
2．基因工程在医药卫生领域的应用
(1)生产药物：利用微生物或动植物的细胞生产药物，对微生物或动植物的
细胞进行基因改造使它们能够生产药物；转基因哺乳动物批量生产药物，科学
家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，
通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，制成乳腺生物反应器或乳房生
物反应器。
(2)用转基因动物做器官移植的供体
3．基因工程在食品工业方面的应用
(1)用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类一般称为基因工
程菌。
(2)利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等
考点4 蛋白质工程的原理和应用
1．蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，
通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人
类生产和生活的需求。可以说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来
的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程。
(1)蛋白质工程的目标：:根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的分
子结构进行设计改造，生产符合人们需求的、自然界中不存在的蛋白质。
(2)蛋白质工程的实质：:由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行
设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
(3)蛋白质工程的的流程(下图)：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基
因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
2．蛋白质工程的应用
(1)医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆
抗体诱发免疫反应的强度。
(2)其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
(3)农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造
微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。
易错点1 明辨限制酶的特点与使用特点
(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制
酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限
制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
易错点2 DNA连接酶和DNA聚合酶的区别
(1)DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片
段上。
(2)DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
易错点3 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的
限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的
基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和
EcoRⅠ两种限制酶。
易错点4 与DNA相关的五种酶的总结比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA (水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
易错点5 基因工程中的载体与膜载体的区别
基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因
进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
易错点6 DNA的粗提取与鉴定的注意事项
(1)如果以菜花为实验材料，由于它的硬度较高，容易出现研磨不充分的情况，需要延长研磨的时间。
如果以洋葱为实验材料，它的气味相对刺激，可以为学生准备护目镜，并注意通风。不同的实验材料，其
DNA的含量有所差别，香蕉、草莓、鱼白等材料中的DNA含量较高。
(2)DNA与二苯胺试剂作用呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。
易错点7 基因表达载体的构建总结
(1)需要用到的工具：限制酶、DNA连接酶、载体。
(2)基因表达载体组成包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
(3)基因表达载体要能在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，还要能表达和发挥作用。
(4)启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。
(5)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子和终止子的调控，所以目的基因应插入启动
子和终止子之间的部位。
(6)构建基因表达载体一般用同种限制酶切割载体和目的基因。也可用两种限制酶切割，以避免质粒或
目的基因自身连接。(7)限制酶切割载体时不能破坏标记基因，以避免标记基因不能表达，不能筛选出含有目的基因的受体
细胞。
易错点8 农杆菌转化法易错总结
(1)农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
(2)原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
(3)农杆菌的作用是感染植物细胞，把目的基因插入到植物细胞的染色体的DNA上 。
(4)用农杆菌感染时，优先选择受伤的(受伤的/完好的)叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理
由是叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌。
(5)若要利用农杆菌转化法转化单子叶植物细胞，可采取添加酚类物质，其目的是吸引农杆菌移向受体
细胞，有利于目的基因成功转化 。
(6)利用Ti质粒构建重组质粒的目的是：将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用其将目的基因
导入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性稳定维持和表达 。
易错点9 基因导入动物细胞受体细胞选受精卵而不是正常体细胞的原因
(1)受精卵具有全能性且体积大，易操作；而动物体细胞的全能性受限。
(2)过程：
易错点10 Ca2+处理法(感受态细胞法)
(1)受体细胞用Ca2+处理的目的是使其变为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子。
(2)用Ca2+处理受体细胞是通过改变细胞壁的通透性来完成
1．(2024·江西·高考真题)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-
谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧
酶基因(gadB)导入生产菌株E．coliA．构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是( )
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
[答案]D．[解析] A、不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因
gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误。B、题意显示，用
L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-
谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B
错误；C、E．coliA中没有L-谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB中含有该酶的
基因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生产γ-氨基丁酸，C错误；D、图中质粒下方括号内备注含多克隆
位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了NcoⅠ和KpnⅠ外还有其他的限制酶可选，此外，PCR
产物也未必非要用这两种酶，而是可以用同尾酶替代，D正确。故选D。
知识链接：基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子
和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
2．(2024·湖南·高考真题)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的
原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
[答案]B．[解析]A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；B、酶切
条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误；C、
质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时
应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。故选B。
知识链接：限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。
3．(2024·安徽·高考真题)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
[答案]D．[解析]A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；B、
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；C、DNA在NaCl溶液中
的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；D、
在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。故选D。
知识链接：DNA粗提取和鉴定的原理：
(1)DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精
溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
(2)DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
4．(2024·福建·高考真题)病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是
由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46(hCD46)是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，
小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。回答下列问题：
(1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚
胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应
选用桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，
原因是 。
[答案](1)两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合
(2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ
(3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床
(4)排除PCR体系中外源DNA的污染
(5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染
[解析](1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条
模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结
合
(2)结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列
位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基
因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性
DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。
将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高
胚胎的存活率。
(4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，
这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。
(5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，
进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因
而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。
知识链接：PCR是聚合酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料(4种脱氧核苷
酸)、酶(耐高温的DNA聚合酶)。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
5．(2024·重庆·高考真题)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人
员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题
19图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制
酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。
电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转
入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子
T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN
较TL种子大的原因是 。
[答案](1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
(2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链
接(反向链接)
(3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段 PCR
(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
[解析](1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基
本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
(2)①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶
EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；
②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切
割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片
段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动
子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，
还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；
②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的
基因或目的基因是否转录出mRNA。
(4)根据(4)题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，
再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基
因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D
使基因S表达量更高，因而种子更大。
知识链接：基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增
和人工合成。(2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止
子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导
入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是
显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上
的检测有DNA分子杂交、RNA分子杂交、抗原-抗体杂交；个体水平上的鉴定有抗虫鉴定、抗病鉴定、活
性鉴定等。
6．(2024·全国·高考真题)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B )的基因组中，构建高效降解纤维
1
素的菌株(B )。该小组在含有N基因的质粒中插入B 基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N
2 1
基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B 的基因
1
组，得到菌株B 。酶切位点(I～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物
2
5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B 基因组
1
DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B 基因组，所用的模板是 ；若用该模
1
板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 (答出2点即可)。
[答案](1) 磷酸二酯键 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达
(2)C-G、A-T、U-A
(3) N基因的两条链 不能扩增出目的基因
(4)不污染环境、增加土壤养分
[解析](1)限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的
Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因，且能保证N基因正常发表达。
(2)RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组
DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。
(3)用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是N基因
的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增
出DNA片段。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
知识链接：PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷
酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从
子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主
要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
7．(2024·山东·高考真题)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技
术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，
将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、
目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 (填
“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因
组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留
的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为
了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及
可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是
，其中纯合的突变植株是 (填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1
条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所
占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
[答案](1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3'
(2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④
(3)1/4
[解析](1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度
通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物
越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根
据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为
256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-ATTG3'和5'-
AAAC-3'。
(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此
可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序
列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙
及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并
对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac
Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带
会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，
经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片
段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含
T-DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为
1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用
于后续的品种选育。
知识链接：基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入
受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
8．(2024·安徽·高考真题)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合
成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上
(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳
源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小
组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同
浓度的木薯淀粉(90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1)和酵母粉(12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1)筛选碳源和氮源浓度的最
佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 (填数字)组实验(重复组不计算在内)。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
[答案](1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失
活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养
基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3) 乳酸或有机酸 9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
(5)提取、分离、纯化
[解析](1)在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的
DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩
增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。
(2)据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性
基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，
因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四
环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
(3)碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相
对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发
酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，
因此理论上应设置3×3=9组实验。
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进
行高密度发酵时，温度会升高。
(5)发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等
方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
知识链接：PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复
性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有
最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
