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基因工程的基本工具
考点1
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专题13 基因工程
3 大考点概览
考点1 基因工程的基本工具
考点2 基因工程的操作步骤
考点3 基因工程的应用和蛋白质工程
1．（2026·湖南长沙·一模）下列关于中学生物学实验的叙述，错误的是（ ）
A．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用实验中，检测试剂可选用斐林试剂
B．尝试利用乙烯利催熟水果实验中，当溶液pH<3.5 时，它会分解释放出乙烯
C．DNA 的粗提取与鉴定实验中的提取过程可以不使用离心机
D．观察叶绿体和细胞质的流动实验过程均需保持细胞活性
【答案】B
【解析】A、淀粉酶可水解淀粉产生还原糖（麦芽糖），但不能水解蔗糖，斐林试剂可与还原糖在水浴加
热条件下产生砖红色沉淀，能检测两种底物的水解情况，A 正确；
B、乙烯利在pH<3.5 的水溶液中性质稳定，当pH 升高时才会分解释放乙烯，选项表述错误，B 错误；
C、DNA 粗提取与鉴定实验中，若无离心机，可将细胞破碎后的混合液静置，取上层清液即可开展后续提
取步骤，因此提取过程可以不使用离心机，C 正确；
D、只有活细胞的细胞质才具有流动性，且叶绿体结构保持完整，因此两个实验均需保持细胞活性，D 正
确。
2．（2026·山东青岛·一模）下列关于现代生物技术及生物学实验的叙述，正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶电泳实验中，琼脂糖融化后应立即加入核酸染料，以免凝胶凝固导致染料分布不均
B．DNA 粗提取实验中，常利用DNA 在酒精中溶解度较大的特性来提取DNA
C．DNA 粗提取实验中，EDTA（蛋白质变性剂）可抑制DNA 酶的活性，防止研磨过程中DNA 被水解
D．通过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白
【答案】C
【解析】A、琼脂糖凝胶电泳实验中，琼脂糖融化后需冷却至50~60℃再加入核酸染料，避免温度过高导
致染料降解、有毒染料挥发，并非立即加入，A 错误；
B、DNA 粗提取实验中，DNA 不溶于酒精，而蛋白质等杂质易溶于酒精，利用该特性可让DNA 析出以分离杂
质，B 错误；
C、DNA 酶的活性依赖镁离子等金属辅因子，EDTA 可螯合这类金属离子，从而抑制DNA 酶活性，防止研磨
过程中DNA 被水解，C 正确；
D、单细胞蛋白是发酵获得的微生物菌体本身，直接收集菌体即可得到，无需从微生物细胞中提取，D 错
1
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误。
故选C。
3．（2026·内蒙古呼和浩特·一模）T4 噬菌体基因编码的T4DNA 连接酶，可连接具有黏性末端和平末端
的DNA 分子，下列有关T4DNA 连接酶的叙述正确的是（ ）
A．组成元素为C、H、O、N、P
B．在T4 噬菌体的核糖体上合成
C．能连接黏性末端和平末端，不具有专一性
D．可降低DNA 分子间形成磷酸二酯键所需的活化能
【答案】D
【解析】A、T4DNA 连接酶的本质为蛋白质，蛋白质的基本组成元素是C、H、O、N，多数不含P 元素，A
错误；
B、T4 噬菌体属于病毒，无细胞结构，不含有核糖体，B 错误；
C、酶的专一性指一种酶可催化一种或一类化学反应，T4DNA 连接酶只能催化DNA 片段间磷酸二酯键的形
成，虽然可连接两类末端，仍具有专一性，C 错误；
D、酶的作用机理是降低化学反应所需的活化能，DNA 连接酶的功能是催化DNA 片段间形成磷酸二酯键，
因此可降低该反应的活化能，D 正确。
4．（2026·辽宁辽阳·一模）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．利用酒精初步分离DNA 与蛋白质的原理是DNA 溶于酒精
B．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA 水解
C．DNA 粗提取时，通过离心研磨液可以加速DNA 的沉淀
D．将DNA 丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴加热出现蓝色
【答案】B
【解析】A、DNA 不溶于酒精，蛋白质等杂质可溶于酒精，该原理可用于初步分离DNA 与蛋白质，A 错误；
B、预冷的酒精溶液具有两个功能：第一，能抑制核酸水解酶活性，防止 DNA 水解；第二， DNA 不溶于
酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，因此利用酒精溶液可以将 DNA 析出，B 正确；
C、粗提取DNA 时，离心研磨液的作用是去除细胞碎片等不溶性杂质，DNA 溶解于上清液中，并非加速DNA
沉淀，C 错误；
D、DNA 与二苯胺试剂反应需要DNA 处于溶解状态，应先将DNA 丝状物溶解在2mol/L 的NaCl 溶液中，再加
入二苯胺试剂沸水浴，直接加入DNA 丝状物无法充分反应，不会出现蓝色，D 错误。
5．（2026·贵州贵阳·一模）科研人员从胰腺病患者身上提取诱导性多能干细胞（iPSC），然后将iPSC
注入经过基因改造（敲除胰腺形成的关键基因）的猪胚胎中，形成嵌合型囊胚，通过胚胎移植至代孕母
猪子宫内，进而获得符合要求的新个体，其器官可用于人体胰腺器官移植。下列叙述错误的是（ ）
A．诱导性多能干细胞不具备发育成人体的各种组织和器官的能力
2
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B．该方法获得的胰腺用于人体器官移植时几乎不发生免疫排斥
C．通过基因改造的猪胚胎为用于移植的胰腺的形成腾出了空间
D．敲除胰腺形成的关键基因时需要用到限制性内切核酸酶
【答案】A
【解析】A、诱导性多能干细胞（iPSC）是通过体细胞重编程获得的多能干细胞，具有类似胚胎干细胞的
分化潜能，能发育成人体各种组织和器官，A 错误；
B、该方法利用患者自身细胞来源的iPSC 分化形成胰腺，移植时属于自体移植，几乎不发生免疫排斥反
应，B 正确；
C、敲除猪胚胎中胰腺形成的关键基因，使猪胚胎无法发育自身胰腺，从而为人类iPSC 分化形成胰腺提
供发育空间，C 正确；
D、基因敲除、基因编辑，都需要切割DNA。限制性内切核酸酶（限制酶）是切割DNA 的工具酶， 所以敲
除基因时需要用到限制酶，D 正确。
6．（2026·四川巴中·一模）微生物DNA 分子中腺嘌呤会被甲基化酶修饰，腺嘌呤的甲基化会影响不同
限制酶的切割情况，下表是腺嘌呤甲基化前后某些限制酶切割的情况。下列叙述错误的是（ ）
限制
酶
识别序列
甲基化前
甲基化后
TaqI
5'-T↓CGA-3'
切割
不切割
DpnI
5'-GA↓TC-3'
不切割
切割
ClaI
5'-AT↓CGAT-3'
切割
不切割
BamHI
5'-G↓GATCC-3'
切割
切割
A．DNA 腺嘌呤的甲基化并不会改变生物基因的碱基序列
B．DNA 腺嘌呤甲基化可能导致限制酶切割的特异性降低
C．通过甲基化关闭某些酶切位点时可能打开新的酶切位点
D．基因工程操作过程中最好选用对甲基化不敏感的限制酶
【答案】B
【解析】A、DNA 腺嘌呤甲基化属于表观遗传修饰，不改变基因的碱基序列，A 正确；
B、限制酶的特异性由其识别序列决定，甲基化可能阻止或允许切割（如TaqI 甲基化后不切割、DpnI 甲
基化后切割），但未改变识别序列本身，故不会降低特异性，B 错误；
C、如DpnI 在甲基化后从不切割变为切割，相当于“打开”新酶切位点；而TaqI 甲基化后“关闭”酶切
位点，C 正确；
D、基因工程中若使用对甲基化敏感的限制酶（如TaqI），其切割结果受宿主甲基化状态影响，可能导致
操作失败，故应优先选用对甲基化不敏感的限制酶（如BamHI），D 正确。
3
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7．（2026·湖南怀化·一模）Léri-Weill 软骨骨生成障碍综合征（LWD）可影响身高。某女性LWD 患者
经基因检测，其一条X 染色体上SHOX 基因发生碱基替换突变，使相关蛋白表达量不足，导致软骨生成障
碍，身材矮小。通过对其家系成员进行基因检测，该女性Ⅲ-5（如图1）致病基因源自其外祖父Ⅰ-1，外
祖母Ⅰ-2 不携带致病基因。图中各家系成员染色体数目正常，且患病成员的致病基因均有同一位点的碱
基替换突变。
回答下列问题。
(1)LWD 的致病基因为____性基因，理由是____。
(2)选用某种限制酶对Ⅲ-5 四位亲属的SHOX 基因中某区域进行酶切，图2 甲为经酶切后的电泳结果，图2
乙为该段中含突变（或未突变）位点的部分序列，图2 丙为选用的限制酶。据图分析，未突变的正常序
列是____（填“a”或“b”），使用的限制酶是____。
(3)根据基因突变的特点分析，可排除Ⅱ-3 患病原因是自身基因突变，理由是____。
(4)Ⅰ-1 的基因型最可能为____，Ⅱ-3 的基因型最可能为____。（致病基因用A 或a 表示）
【答案】(1) 显 女性Ⅲ-5（或Ⅱ-5）（为杂合子，）一条X 染色体上携带致病基因即患病（或
答：如致病基因为隐性基因，则女性Ⅲ-5 的父亲Ⅱ-6 也是患者）
(2) a Rsa Ⅰ
(3)基因突变具有不定向性、随机性，且突变频率低，Ⅱ-3 与Ⅰ-1 致病基因均在同一位点出现相同碱基
4
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替换的概率小
(4)
【解析】（1）LWD 的致病基因为显性，理由是女性Ⅲ-5（或Ⅱ-5）（为杂合子，）一条X 染色体上携带
致病基因即患病（或答：如致病基因为隐性基因，则女性Ⅲ-5 的父亲Ⅱ-6 也是患者）。
（2）据图2，正常个体的序列（a）均能被酶切，而患者的序列只有部分能被酶切，说明突变（C→A）导
致限制酶Rsa Ⅰ能识别的序列GTAC 变为不能识别的序列GTAA。
（3）排除Ⅱ-3 患病原因是自身基因突变，理由是基因突变具有不定向性、随机性，且突变频率低，Ⅱ-3
与Ⅰ-1 致病基因均在同一位点出现相同碱基替换的概率小。
（4）根据Ⅱ-1、Ⅱ-2 表型正常，而Ⅱ-5 患病，推测Ⅰ-1 的基因型最可能为
，Ⅰ-1 的致病基因传
递给Ⅱ-3 的原因是：Ⅰ-1 减数分裂产生配子时，X 和Y 染色体发生片段交换（互换）而导致Y 染色体上
出现致病基因，故Ⅱ-3 的基因型为
。
8．（2026·江苏南通·一模）限制性核酸内切酶BsmB Ⅰ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点
（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmB Ⅰ实现多DNA 片段无缝连接的技术称为Golden Gate 克隆，其过
程如图2.请回答下列问题。
(1)由图1 可知，BsmB Ⅰ酶切DNA 中的________键，产生________（类型）末端。BsmB Ⅰ一次酶切产生的
两个末端________（填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。
(2)PCR1~n 不宜在同一反应体系中进行，其原因有________、________。过程②需要的酶有________。
(3)片段1 和片段2 的部分序列如图3 所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为
________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列
________（接头序列用小写字母表示）。
5
基因工程的操作步骤
考点2
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(4)据图1、2 分析，GoldenGate 克隆技术的优点有________。
a.不受天然酶切位点的限制
b.实现多片段一次性有序连接
c.有利于大片段DNA 的高效连接
d.片段1~n 之间不会引入外源序列实现无缝连接
【答案】(1) 磷酸二酯 黏性 可能相同
(2) 不同PCR 反应的退火温度有差异 不同引物间会互补配对 BsmB Ⅰ酶、DNA 连接酶
(3) 5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3'
(4)abd
【解析】（1）限制性核酸内切酶切割的是DNA 中的磷酸二酯键。由图1 可知，BsmB Ⅰ切割后产生的是黏
性末端。因为其识别序列及切割位点位于接头序列两侧，如果接头序列相同切割后产生的两个末端是相
同的，如果接头序列不相同切割后产生的两个末端是不相同的，所以BsmB Ⅰ一次酶切产生的两个末端可
能相同。
（2）PCR1~n 不宜在同一反应体系中进行，一方面是因为不同片段长度不同，PCR 反应条件（如退火温度
等）可能不同，在同一体系中难以同时满足；另一方面，不同片段的引物都含有BsmB Ⅰ识别序列，不同
引物之间可能会互补配对，影响PCR 的进行。过程②是将片段与质粒连接形成重组质粒，需要的酶是限
制酶（BsmB Ⅰ酶）和DNA 连接酶。
（3）据图可知片段1 和片段2 经PCR 后需要连接在一起，即R1被切割后形成的黏性末端需和F2被切割后
形成的黏性末端互补，据图1 可知，限制性核酸内切酶BsmB Ⅰ切割后的黏性末端为接头序列，由于R1序
列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列由识别序列和接头序列以及片段2 部分序列组成，即
5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3'。由R1序列可知本方案接头序列属于片段1 的一部分，所以另一套方案中
F2中的接头序列可以用片段二的一部分（前4 个碱基）即5'CGTCTCNgtgcTGTA……3'，而R1则为
5’CGTCTCNgcacCGACCAAAT…3’
（4）a、通过设计接头序列，可以在任意位置引入酶切位点，所以不受天然酶切位点的限制，a 符合题意；
b、从图2 可以看出，多个片段可以一次性有序连接，b 符合题意；
c、该技术可以实现多片段的连接，有利于小片段DNA 的高效连接，c 不符合题意；
d、片段1~n 之间通过接头序列碱基互补原则连接，不会引入外源序列实现无缝连接，d 符合题意。
故选abd。
6
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1．（2026·内蒙古呼和浩特·一模）叶绿体发育与BG 基因、GK 基因的表达有关、GK 功能缺失突变体的
叶绿素含量会显著降低。研究者将一定浓度的GK 蛋白与系列浓度BG 蛋白混合后，再加入GK 蛋白靶基因
CAO 的启动子DNA 片段，反应一段时间后，经琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图。以下分析正确的是
（ ）
A．BG 蛋白通过抑制GK 蛋白的功能影响叶绿体发育
B．GK 蛋白结合靶基因CAO 导致叶绿素的含量下降
C．条带中的“游离DNA 片段”来自BG 基因
D．随BG 蛋白浓度增加CAO 的启动子功能增强
【答案】A
【解析】A、结合题意及题图可知，BG 蛋白浓度越高，GK 结合靶启动子的能力越弱，说明BG 通过抑制GK
的功能，影响叶绿体发育，A 正确；
B、分析题意可知，GK 可结合其靶基因CAO 的启动子DNA，GK 功能缺失会导致叶绿素含量显著降低，说明
正常功能的GK 可维持叶绿素正常合成，与叶绿体发育相关GK 功能缺失才会导致叶绿素含量下降，说明
GK 结合靶基因CAO 会促进叶绿素合成，而非导致含量下降，B 错误；
C、本实验中加入的DNA 是CAO 的启动子片段，游离DNA 是未结合GK 的CAO 启动子片段，不是BG 基因，C
错误；
D、电泳结果显示：随着BG 蛋白浓度升高，与GK 结合的CAO 启动子DNA 逐渐减少，游离的CAO 启动子DNA
逐渐增多，说明BG 会抑制GK 与CAO 启动子的结合，CAO 启动子无法正常发挥启动转录的功能，功能逐渐
减弱，D 错误。
2．（2026·云南·一模）科研人员为研究M 蛋白，构建了编码M 蛋白的M 基因与编码荧光蛋白的G 基因
融合表达的重组质粒，该质粒的部分结构如图1。为确定融合基因是否正确表达，科研人员提取了发荧光
的受体细胞中的总蛋白，分成两组进行相关实验，并分别用抗M 蛋白抗体和抗荧光蛋白抗体检测相应蛋
白的表达情况，结果如图2 和图3（抗体与相应蛋白结合后会显示出条带，条带位置与蛋白质大小有关）。
下列叙述错误的是（ ）
7
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A．用PCR 检测重组质粒中是否插入完整的G-M 融合基因时，应选择引物2 和引物3
B．G-M 融合基因在受体细胞内转录时，以a 链作为模板
C．条带1 检出的蛋白为受体细胞表达的G-M 融合蛋白
D．条带2 检出的蛋白可能是受体细胞自身的M 基因控制合成的M 蛋白
【答案】B
【解析】A、重组质粒的模板链为3'→5'方向，PCR 扩增需要引物与模板链的3'端结合。引物1 结合在a
链5'端，方向与扩增方向不符；引物4 结合在b 链5'端，方向也不符；正确引物应为引物2 和引物3，A
正确；
B、启动子位于G 基因上游（a 链的5'端），转录时RNA 聚合酶结合启动子，沿5'→3'方向合成RNA，因
此模板链是b 链（3'→5'），B 错误；
C、据图2 可知，用抗M 蛋白抗体和抗荧光蛋白抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是G-M 融合蛋白，
C 正确；
D、据图2 可知，抗M 蛋白抗体检测出现条带2，抗荧光蛋白抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的
蛋白不是由重组质粒上的融合的M 基因表达的，可能是受体细胞自身的M 基因控制合成的M 蛋白，D 正确。
3．（2026·广东广州·一模）基因工程中，使用单个限制酶酶切构建的表达载体易出现连接方向错误和
重复插入目的基因片段等现象，可通过酶切及筛选标记鉴定出符合预期的重组载体。研究小组选用的载
体P 和目的基因CDS 片段特征如图，将CDS 片段插入载体P 的Sac Ⅱ位点后对重组载体进行扩增、筛选和
检测。下列叙述错误的是（ ）
注：LacZ 基因表达产物为β-半乳糖苷酶，X-gal 会被β-半乳糖苷酶分解，产生蓝色产物。
A．含重组载体的宿主细胞在含X-gal 的培养基上，菌落颜色为白色
B．重组载体被Pst Ⅰ充分酶切后电泳可能会获得长度为9.4kbDNA 片段
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C．用EcoR Ⅰ与Pst Ⅰ充分酶切重组载体，可判断CDS 片段的连接方向
D．用EcoR Ⅰ与Sac Ⅱ充分酶切重组载体，可得到2 个长度的DNA 片段
【答案】D
【解析】A、目的基因插入LacZ 基因的Sac Ⅱ位点后，LacZ 被插入而导致LacZ 失活，进而无法表达出有
活性的β 半乳糖苷酶，不能分解
−
X−gal 产生蓝色物质，因此含重组载体的菌落为白色，A 正确；
B、单个限制酶酶切可能出现重复插入目的基因的情况，若插入2 个CDS，重组载体总长度为
4.2+2.6×2=9.4kb；载体仅含1 个Pst Ⅰ位点，CDS 无
Ⅰ位点，因此酶切后得到
1 条长度为
9.4kb 的线性片段，存在这种可能性，B 正确；
C、Pst Ⅰ位于载体上紧邻 Sac Ⅱ，若CDS 插入方向不同，EcoR Ⅰ距离Pst Ⅰ的长度分别为 0.5 kb 和
2.1 kb，双酶切后得到的片段长度不同，因此可以判断连接方向，C 正确；
D、插入1 个CDS 的重组载体，共含有2 个Sac Ⅱ位点（CDS 两端）和1 个EcoR Ⅰ位点（CDS 内部），共3
个酶切位点，环状DNA 经3 个切点酶切后，会得到3 个不同长度的DNA 片段（0.5 kb、2.1 kb、4.2
kb），插入多个CDS 会得到更多长度的片段，不可能只得到2 个长度的片段，D 错误。
4．（2026·北京昌平·一模）NDRG2 基因表达量在阿尔茨海默病（AD）患者脑内异常升高，研究人员构
建能表达NDRG2 反义RNA（与NDRG2 mRNA 互补的RNA 分子）的基因表达载体，导入AD 模型小鼠海马神经
元以抑制该基因表达。相关叙述正确的是（ ）
A．需用同种限制性内切核酸酶获取目的基因、切割表达载体
B．NDRG2 反义RNA 通过与NDRG2 的mRNA 结合抑制其转录
C．用DNA 聚合酶将相关片段与载体连接形成重组DNA 分子
D．将重组质粒导入农杆菌，再利用农杆菌感染小鼠海马神经元
【答案】A
【解析】A、构建基因表达载体时，用同种限制性内切核酸酶获取目的基因、切割表达载体，可使二者产
生相同的末端，便于后续连接形成重组DNA 分子，A 正确；
B、NDRG2 反义RNA 与NDRG2 的mRNA 结合后，会阻止核糖体与mRNA 结合，抑制其翻译，B 错误；
C、将目的基因片段与载体连接形成重组DNA 分子需要使用DNA 连接酶，C 错误；
D、农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法，将重组质粒导入动物细胞常用显微注射法，农
杆菌无法感染动物细胞，D 错误。
5．（2026·宁夏·一模）荧光定量PCR 技术可定量检测样本中某种DNA 含量。其原理是在PCR 体系中每
加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq 酶催化子链延伸至探针处，会水解
探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列有关叙述错误的
是（ ）
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A．引物是单链DNA 或单链RNA，引物1、2 的碱基序列不相同
B．Taq 酶催化DNA 的合成方向总是从母链的3'端向5'端延伸
C．达到设定荧光强度所经过的循环次数与其起始模板量关系不大
D．该项技术可用于检测某种细胞中不同基因的转录水平
【答案】C
【解析】A、引物与模板按照碱基互补配对原则结合，引物是单链DNA 或单链RNA，但引物1 和2 结合部
位不同，序列也不同，A 正确；
B、由图可知，Taq 酶催化DNA 的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸，则对应的母链为3'端向
5'端延伸，B 正确；
C、题干中提出“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，
就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA 含量呈正相关，C 错误；
D、该技术可通过检测 cDNA 的含量来反映细胞中不同基因的转录水平（先将 mRNA 反转录为 cDNA，再
进行 PCR），D 正确。
6．（2026·辽宁抚顺·一模）目的基因的序列长度为2.0kb(1kb 为1000 个碱基对)，质粒的序列长度为
3.8kb，两者具有限制酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ的识别切割位点，如图所示。使用BamH Ⅰ对目的基
因和质粒进行酶切后构建重组质粒，通过酶切和电泳可检测目的基因是否正确接入质粒。检测时选用的
限制酶是（ ）
A．
和
B．
和
C．
和
D．
或
【答案】B
【解析】目的基因长度为2kb，则重组质粒（插入目的基因）总长度 = 5.8kb。 有两种连接方式，如图
10
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目的基因内部有Hind Ⅲ 位点，质粒有EcoR Ⅰ 位点，双酶切后：图1 的酶切结果为，1.3kb 和4.5kb，
图2 结果为，2.3kb 和3.5kb，能区分连接方式，B 正确。
7．（2026·辽宁·一模）D 基因位于X 染色体上，X 染色体发生图示断裂，且断裂点I、Ⅱ间的染色体片
段发生颠倒重接会使D 基因的结构改变。用PCR 技术对变异后的D 基因进行扩增，下列叙述正确的是（
）
注：S1和S2、R1，和R2为相应的引物。
A．选择引物S1和R1，DNA 聚合酶只能沿引物的3′端连接脱氧核苷酸
B．选择引物S2和R2，4 种引物均是具有特定碱基排列顺序的短单链核酸
C．选择引物S1和R1，引物在延伸阶段（72℃时）与模板链结合并开始工作
D．选择引物S1和R2，至少消耗6 个引物后才能得到等长的变异后的D 基因
【答案】A
【解析】AB、发生染色体的断裂和重接后，D 基因的位置不会发生改变，选择引物S1和R1能扩增出变异
后的D 基因，DNA 聚合酶只能沿引物的3′端连接脱氧核苷酸，A 正确，B 错误；
C、引物在复性阶段（50℃时）与模板链结合并开始工作，C 错误；
D、选择引物S1和R1对D 基因进行扩增，从第3 轮开始才出现等长的变异后的D 基因片段，至少消耗的引
物个数为23×2-2=14 个，D 错误。
故选A。
8．（2026·安徽·一模）水杨酸是一种常见的水体污染物。科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过
向大肠杆菌体内导入含特殊DNA 序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如图1 所示），为环境污染治
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理提供新方法。水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基
因与mrfp 基因连接成融合基因（图2），则工程菌可同时实现对水杨酸的动态监测和清除。下列相关说
法错误的是（ ）
A．启动子是mRNA 上一段特殊的序列，是转录的起始位点
B．当环境中存在水杨酸时，水杨酸—调控蛋白激活Ps，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境
中的水杨酸浓度
C．可在
基因前插入水杨酸诱导型强启动子，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度增强为原
来的2 倍，从而提高传感器的灵敏度
D．欲通过PCR 判断融合基因是否准确连接，应选择图2 中的引物组合1 和3
【答案】A
【解析】A、基因工程中启动子与基因转录有关，位于DNA（基因）上，是RNA 聚合酶识别结合位点，启
动转录，A 错误；
B、由图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活Ps 启动子，启动基因表达红色
荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度，B 正确；
C、选择表达效率更高的启动子替代Ps，在mrfp 基因前插入提高表达效率的DNA 序列，使启动子能更高
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效地启动下游基因表达，从而提高红色荧光蛋白的表达量，增强荧光强度，C 正确；
D、PCR 技术要求引物与模板链的3'端互补配对，且DNA 聚合酶从引物的3'端开始延伸子链。要判定水杨
酸羟化酶基因与mrfp 基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合。引物
1 和引物3 可以分别与融合基因中水杨酸羟化酶基因的3'端和mrfp 基因的3'端互补配对，从而扩增出融
合基因，所以应选择的引物组合是引物1 和引物3，D 正确。
9．（2026·天津宁河·一模）RCA 是一种核基因（rca）编码的叶绿体蛋白。为研究RCA 对光合作用的影
响及机理，科研人员构建反义rca 基因表达载体（rca 基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入
大豆细胞，成功获得rca 基因沉默的转基因品种，如下图所示，①～⑥表示相关过程。
(1)过程①一般从_____细胞中提取总RNA，参与该过程的酶有_____（写两种）。
(2)已知①过程rca 基因的b 链和获取它的模板mRNA 互补，依据图1 中给出的引物1 设计区的碱基序列及
限制酶的信息，从5'端到3'端写出引物1 的碱基序列______（只写出前8 个碱基即可）。
(3)过程②用C4pdk 启动子替换Ti 质粒上原有启动子的目的是______，过程④常用的方法是______，⑤过
程后可用含抗生素______的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。
(4)培育成功的转基因玉米叶肉细胞中反义基因rac 表达会产生反义mRNA，从而使rac 基因沉默，其原理
可能是_____，进而抑制翻译过程。
A．反义mRNA 与DNA 上相关基因的启动子结合
B．反义mRNA 与DNA 上相关基因的起始密码子结合
C．反义mRNA 与正义mRNA 结合，引发正义mRNA 降解
D．反义mRNA 与正义mRNA 结合，阻止正义mRNA 与核糖体的结合
(5)科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，
结果如下表（Rubisco 是光合作用暗反应中的一种关键酶）。据表分析，RCA 对光合作用的影响是______
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（填“促进”或“抑制”），机理是______。
品种
检测指标
光合速率
叶绿素总量
Rubisco 含量
Rubisco 活力
野生型玉米
19.88
9.07
1.68
32.68
转基因玉米
9.57
9.09
3.21
14.95
【答案】(1) 叶肉(含叶绿体的) 反(逆)转录酶、TaqDNA 聚合酶
(2)5'CTCGAGGT3'
(3) 驱动目的基因在光诱导下在叶肉细胞中特异性表达 感受态细胞法（或 Ca ² 处理法）
⁺
潮霉素
(4)CD
(5) 促进 RCA 可提高Rubisco 活力(促进暗反应)，进而提高光合速率
【解析】（1）RCA 是叶绿体蛋白，其基因在叶肉(含叶绿体的)细胞中表达，故从大豆叶肉细胞提取总
RNA；过程①是反转录PCR，需要反(逆)转录酶、TaqDNA 聚合酶。
（2）①过程rca 基因的b 链和获取它的模板mRNA 互补，说明b 链为模板链，rca 基因需反向插入表达载
体，引物1 需与模板链互补，且要引入限制酶识别位点。结合图中引物设计区序列
（3′CTTCATTCTCTGCTTG5′），其互补链为5′GAAGTAAGAGACGAAC3′，据图可知，应保留终止子，去除
右侧的启动子，同时需匹配Xho Ⅰ的识别序列5'GTCGAC3'，故前8 个碱基为5'CTCGAGGT3'。因rac 基因
中存在Sal Ⅰ的酶切位点，引物中不能添加Sal Ⅰ识别序列。Xho Ⅰ和Sal Ⅰ可切出相同的黏性末端。
（3）C4pdk 启动子是光诱导的叶肉细胞特异启动子，替换后可驱动目的基因在光诱导下在叶肉细胞中特
异性表达；将重组质粒导入农杆菌后，通过农杆菌侵染植物细胞，表达载体含潮霉素抗性基因，故用含
潮霉素的培养基筛选。过程④是将重组质粒导入农杆菌，常用的方法是感受态细胞法（或 Ca ² 处理法）
⁺
：
用 CaCl 处理农杆菌，使其处于感受态，便于吸收外源
₂
DNA。
（4）A、启动子属于非编码序列，反义mRNA 不能与它结合，A 错误；
B、起始密码子位于 mRNA 上，而非 DNA 上，B 错误；
CD、反义 mRNA 与正义 mRNA（rca 基因的正常 mRNA）互补配对，会产生两种效应： 引发正义 mRNA 被
降解，阻止正义 mRNA 与核糖体结合，抑制翻译，CD 正确。
（5）转基因大豆（rca 基因沉默）的光合速率、Rubisco 活力均低于野生型，说明RCA 能促进光合作用，
主要通过提高Rubisco 活力实现。
10．（2026·广西河池·一模）溶瘤病毒是极具潜力的抗肿瘤工具。新城疫病毒（NDV）天然具有靶向裂
解肿瘤、对正常细胞无感染性的特点，是研发溶瘤病毒的理想载体。科研团队将猪α1，3 半乳糖基转移
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酶（α1，3-GT）基因插入NDV 基因组，构建重组溶瘤病毒（NDV-GT）（见下图1），NDV-GT 通过直接溶
瘤、超急性排斥反应和免疫激活的三重机制发挥抗肿瘤作用。结合该研究及基因工程相关知识，回答下
列问题：
(1)采用Pme Ⅰ限制性内切酶对NDV LaSota 株质粒进行单酶切获得线性化NDV 载体，若直接用DNA 连接酶
将线性化NDV 载体与α1，3-GT 基因连接构建重组载体，常因_________（答出两点）等问题导致构建成
功率极低，因此科研团队采用重叠延伸PCR 同源重组法构建重组质粒。
(2)科学家将α1，3-GT 基因与线性化NDV 载体进行重叠延伸PCR 同源重组，形成重组NDV-GT 质粒。重叠
延伸PCR 引物必须按照载体与基因序列设计，引物是一小段_________________________________。
为了使α1，3-GT 基因与线性化NDV 载体形成重叠序列，图中特异性引物2．3 的设计原则是：_________。
(3)该表达载体采用双启动子/双终止子设计，一套驱动NDV_________的转录以保障病毒复制与增殖能力，
维持溶瘤活性；另一套驱动_________的转录，实现抗肿瘤基因的高效稳定表达。
(4)科研团队构建食蟹猴原发性肝癌模型以验证重组溶瘤病毒的疗效，实验中用到的食蟹猴为动物体细胞
克隆猴，由于同一个体的体细胞克隆出的后代_________，用于药物对照实验能够更准确地评估药效。
【答案】(1)载体自身重新环化、目的基因反向插入载体、多个目的基因插入同一载体
(2) 一小段能与模板链互补配对的短单链核酸 引物2（扩增载体的引物）携带目的基因的同源
序列，引物3（扩增目的基因的引物）携带载体的同源序列
(3) 自身复制必需的核心基因 目的基因α1,3−GT
(4)核遗传物质（基因型）基本一致
【解析】（1）单酶切后，载体和目的基因的末端均为相同的黏性末端，连接时容易出现载体自身重新环
化、目的基因反向插入载体、多个目的基因插入同一载体这些问题，导致重组载体构建成功率极低。
（2）根据PCR 技术的基本原理，引物是一小段能与模板链互补配对的短单链核酸，多数为DNA、少数为
RNA；重叠延伸PCR 需要两个PCR 产物产生重叠同源序列才能后续重组，因此需要引物2（扩增载体的引
物）携带目的基因的同源序列，引物3（扩增目的基因的引物）携带载体的同源序列，保证扩增后两个片
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段末端有互补重叠区。
（3）双启动子/双终止子分别驱动两类基因：一套驱动病毒（NDV）自身复制必需的核心基因的转录，保
证病毒的复制增殖和溶瘤活性；另一套驱动插入的目的基因α1,3−GT 的转录，保证目的基因正常表达，
发挥抗肿瘤作用。
（4）体细胞克隆属于无性繁殖，同一个体的体细胞克隆获得的后代核遗传物质（基因型）基本一致，可
以排除个体遗传差异对药物实验的干扰，让实验结果更准确。
11．（2026·山东青岛·一模）鲍迪苷D（RD）是来自甜叶菊的高品质低热量天然甜味剂，在自然界中含
量很低。体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG 转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成RD，来
源于水稻的葡萄糖基转移酶E11 是体外制备RD 的关键酶。研究人员通过基因工程技术制备能够表达E11
的工程菌，为实现生物转化法合成RD 奠定了基础，制备流程及限制酶酶切位点如图1。
限制酶
识别序列及切割位点
Nsi Ⅰ
5' ATGCA↓T3'
3' T↑ACGTA5'
Apa Ⅰ
5' GGGCC↓C3'
3' C↑CCGGG5'
Pst Ⅰ
5' CTGCA↓G3'
3' G↑ACGTC5'
PspOM Ⅰ
5' GGGCC↓C3'
3' C↑CCGGG5'
Sal Ⅰ
5' G↓TCGAC3'
3' CAGCT↑G5'
(1)可从______中查询基因E11 的编码序列，设计特定引物。提取水稻细胞中的______，经逆转录获得总
cDNA，将其作为PCR 反应的模板，在制备PCR 反应体系时，用微量移液器吸取不同试剂前，除需要确认或
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调整刻度和量程外，还需要______。
(2)为保证基因E11 与pET 质粒连接的准确性和效率，结合图1 分析，应在基因E11 转录模板链的5' 端和
3' 端分别添加限制酶______的酶切序列。若基因E11 转录模板链的3' 端不添加限制酶酶切序列，要实
现基因E11 与质粒载体的定向连接，对pET 质粒应进行的操作是______。
(3)使用相关限制酶处理质粒和目的基因，连接后转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌接种到含有______
的培养基中培养。假设限制酶切割前后，pET 质粒大小基本不变，为进一步筛选重组质粒，随机挑取菌落
（分别编号为1、2、3、4）培养并提取1～4 号菌落中的质粒电泳，结果如图2。推测______号菌落含有
重组质粒，其他菌落的条带出现的原因可能是______。
(4)将纯化得到的蛋白E11 添加到含有______（填物质）的反应体系中，通过检测RD 的合成速率以验证蛋
白E11 的酶活性。
【答案】(1) 序列数据库 （总）RNA 更换微量移液器的枪头
(2) Nsi Ⅰ，Sal Ⅰ 选择Sal Ⅰ和Pst Ⅰ对质粒进行完全酶切，利用DNA 聚合酶将Sal Ⅰ产生的
黏性末端补平
(3) 四环素 1 2 号、3 号导入的重组载体是两个pET 质粒环化形成，4 号导入的是空白pET
质粒
(4)U-DPG 和RA
【解析】（1）基因的编码序列属于公开的核酸序列信息，可从序列数据库中查询获取，以此为依据设计
扩增基因E11 的特定PCR 引物。逆转录法获取cDNA 的原理是以RNA（主要是mRNA） 为模板，在逆转录酶
的作用下合成互补的DNA 链，因此需要先提取水稻细胞中的总RNA，再经逆转录获得总cDNA，作为PCR 扩
增基因E11 的模板。微量移液器的枪头为一次性使用耗材，吸取不同试剂前更换枪头，可避免不同试剂
之间的交叉污染，保证PCR 反应体系的纯度和实验结果的准确性。
（2）质粒的转录方向为从启动子到终止子，目的基因E11 需与质粒转录方向一致，才能正常表达；质粒
上可用于插入目的基因的酶切位点需位于启动子和终止子之间，且不破坏氯霉素/四环素抗性基因、复制
原点等关键元件，可选位点为Pst Ⅰ、Sal Ⅰ。由限制酶识别序列可知：Nsi Ⅰ的切割位点为
5'ATGCA↓T3'，Pst Ⅰ的切割位点为 5'CTGCA↓G3'，二者切割后可产生互补的黏性末端（均含-TGCA-序
列），能实现连接；Sal Ⅰ的酶切位点唯一且位于启动子/终止子之间，可与Nsi Ⅰ 配合实现定向酶切。
基因E11 转录模板链的5'端对应编码链的3'端，需添加Nsi Ⅰ 酶切序列（与质粒Pst Ⅰ 互补），3'端
添加Sal Ⅰ 酶切序列，使目的基因与酶切后的质粒定向连接，避免反向连接。若基因E113'端不添加酶
切序列，需通过改造质粒实现定向连接，避免目的基因随机连接或质粒自连：先用Sal Ⅰ和Pst Ⅰ对质粒
完全酶切，产生两个不同的末端（Sal Ⅰ黏性末端、Pst Ⅰ黏性末端）； 用DNA 聚合酶将Sal Ⅰ切割产生
的黏性末端补平，使质粒形成一个平末端（Sal Ⅰ处）+ 一个黏性末端（Pst Ⅰ处）； 目的基因仅5'端
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有与Pst Ⅰ互补的黏性末端，3'端为天然平末端，只能与质粒的黏性末端、平末端分别配对，从而实现
定向连接。
（3）质粒上含氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，目的基因插入位点位于氯霉素抗性基因内部：当目的
基因与质粒连接形成重组质粒时，氯霉素抗性基因被破坏，失去抗性；而四环素抗性基因保持完整，仍
具有抗性。因此需将转化后的大肠杆菌接种到含四环素的培养基中培养，筛选出成功导入质粒（空白质
粒或重组质粒）的大肠杆菌。结合电泳结果和质粒/目的基因长度分析： 空白pET 质粒长度为5369bp
（约 5000bp），重组质粒为质粒+基因E11，总长度为5369+1369=6738bp（约6000bp）； M1 为链状DNA
分子 Marker（6000bp、5000bp、3000bp、1500bp），M2 为环状DNA 分子Marker；环状DNA 分子电泳迁移
速率快于同长度的链状DNA 分子；1 号菌落的质粒条带位置对应M2 的 6000bp 左右，与重组质粒（约
6738bp）的电泳位置相符，因此1 号菌落含有重组质粒。2 号、3 号：条带位置比1 号更靠近点样孔（分
子量更大），原因是两个空白pET 质粒经酶切后自身环化形成二聚体质粒，分子量远大于重组质粒，电
泳迁移速率更慢； 4 号：条带位置对应M2 的5000bp 左右，与空白pET 质粒（5369bp）的电泳位置相符，
说明导入的是未插入目的基因的空白pET 质粒。
（4）题干明确：体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG 转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成
RD，葡萄糖基转移酶E11 是该过程的关键酶。酶的活性验证需在底物存在的条件下进行，因此反应体系
中需加入该酶的两种底物（U—DPG 和RA），通过检测产物RD 的合成速率，即可验证蛋白E11 的葡萄糖基
转移酶活性。
12．（2026·青海西宁·一模）类胡萝卜素具有预防、改善夜盲症和延缓衰老的功能。番茄红素β-环化
酶（LCYB）是类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶，在桂花中该酶的含量较高。某科研团队将“堰虹
桂”（桂花品种）的LCYB 基因转入烟草，获得了高产类胡萝卜素烟草。图1 表示扩增LCYB 基因的引物序
列，图2 表示SmaI 和XhoI 酶的识别序列和酶切位点。请回答下列问题：
(1)LCYB 基因克隆。提取“堰虹桂”的总RNA，经_________得到cDNA，利用PCR 技术扩增LCYB 基因，若
在PCR 反应体系中加入1 个LCYB 基因和其他充足的原料，经过40 个循环，共有_________个引物参与
LCYB 基因的合成。经该方法获得的目的基因片段缺少_________，因此不能直接在受体细胞中表达。
(2)构建基因表达载体。将扩增的目的基因插入质粒的SmaI 和XhoI 酶切位点之间，为保证目的基因与质
粒准确连接，应对目的基因进行的操作是_________。选用两种限制酶分别处理质粒和含目的基因的DNA
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片段的目的是______________________________（答两点）。
(3)将目的基因导入受体细胞。为获得仅在烟草叶肉细胞中特异性表达LCYB 基因的烟草，应将LCYB 基因
与_________等调控元件重组在一起，选择_________法完成烟草的转化，利用植物组织培养技术，将含
LCYB 基因的烟草体细胞培育成烟草植株的过程中应调整培养基中生长素和细胞分裂素的_________。
(4)为探究低温处理对“堰虹桂”花瓣中类胡萝卜素含量和LCYB 基因表达的影响，可在花期检测花瓣中
_________的含量。若低温条件下，LCYB 基因的表达量增加，请提出在生产上的一种应用：
______________________________。
【答案】(1) 逆转录 241-2 启动子和终止子
(2) 在PCR 引物5'端分别引入与载体对应的SmaI 和XhoI 酶识别序列 使目的基因两端产生不同
末端，实现定向连接，并降低载体自连、目的基因自连、目的基因与载体反向连接的概率
(3) 叶肉（叶片）特异性启动子 农杆菌转化 浓度和比例
(4) 类胡萝卜素和番茄红素β-环化酶 对转基因烟草进行低温处理以提高类胡萝卜素的含量、
在花期采取适度低温（控温/冷凉管理）以提高花瓣类胡萝卜素积累、增强花色与品质（或筛选/优化低
温处理条件用于提升桂花观赏与加工品质）
【解析】（1）提取“堰虹桂”的总RNA，利用RNA 合成cDNA 的过程是逆转录。若在PCR 反应体系中加入
1 个LCYB 基因和其他充足的原料，经过40 个循环，生成的240个DNA 分子中共有241个脱氧核苷酸链，其
中亲本的2 条链不需要引物，共有241-2 个引物参与合成LCYB 基因。经过该方法合成的LCYB 基因缺少启
动子和终止子，启动子驱动基因转录，终止子则提供转录终止的信号，没有这些元件，目的基因不能直
接在受体细胞中表达。
（2）将扩增的目的基因插入质粒的Xho I 和Sma I 酶切位点之间，为保证目的基因与质粒准确连接，需
要在PCR 引物5'端分别引入与载体对应的Sma I 和Xho I 酶识别序列。由于两种限制酶切割产生的末端
不同，因此用两种限制酶分别处理质粒和含目的基因的DNA 片段的目的是使目的基因两端产生不同末端，
防止质粒、目的基因的自身环化以及目的基因与载体反向连接，保证目的基因的正向连接。
（3）为获得仅在烟草叶肉细胞中特异性表达LCYB 基因的烟草，应将LCYB 基因与烟草叶肉细胞中特异性
表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，以保证目的基因仅在烟草叶肉细胞中特异性表达，此后采
用农杆菌转化法完成对烟草的转化，将含LCYB 基因的烟草体细胞培育成烟草植株采用的技术是植物组织
培养，该过程包括脱分化和再分化阶段，需要调整生长素和细胞分裂素的浓度和比例。
（4）由于LCYB 基因表达产生番茄红素β-环化酶，所以为探究低温条件对“堰虹桂”花瓣中类胡萝卜素
含量和LCYB 基因表达的影响，可在花期检测花瓣中类胡萝卜素和番茄红素β-环化酶的含量，若低温条
件下，LCYB 基因的表达量增加，可在生产上通过花期适度低温调控，促进LCYB 基因表达，以提高花瓣类
胡萝卜素积累、增强花色与品质。
13．（2026·北京东城·一模）学习以下材料，回答（1）～（5）题。
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病毒与细菌“携手”靶向治疗癌症
细菌疗法与溶瘤病毒法都利用了微生物特性实现精准抗癌，鼠伤寒沙门氏菌（S 菌）是细菌疗法的常用菌，
这种胞内寄生的兼性厌氧菌能选择性定植到肿瘤组织中并诱导癌细胞死亡。肿瘤组织内独特的免疫抑制
特性为它提供了“庇护所”，但它通常只定植于缺氧的肿瘤组织内部，对周围和远处癌细胞的杀伤能力
有限。塞内卡病毒A（SVA）是一种具有天然肿瘤选择性的溶瘤病毒，其生命周期如图1，蛋白酶P 可特异
性识别并切割多聚蛋白，形成病毒衣壳蛋白、RNA 复制酶等多种蛋白。癌症患者注射SVA 后，增殖出的子
代SVA 能裂解癌细胞并在体内继续传播，但体液免疫会将其清除，这限制了溶瘤病毒的疗效。
科研人员改造S 菌获得了工程菌，改造系统如图2。启动子PJ 和PA 均只在工程菌进入癌细胞后启动，表
达出的裂解蛋白E1 和E2 可分别破坏细菌细胞膜和囊泡膜。启动子PT7 被T7RNA 聚合酶特异性识别，转录
出的RNA 可以穿过被破坏的细菌细胞膜和囊泡膜释放至癌细胞的细胞质，并完成子代SVA 的合成、组装与
释放。红色荧光蛋白基因的插入不影响RNA 聚合酶的功能，绿色荧光蛋白基因的插入不影响SVA 病毒多聚
蛋白的形成和切割。工程菌与癌细胞共培养的体外实验和工程菌注射到肿瘤模型鼠的体内实验的结果，
均表明了工程菌向癌细胞递送了具有复制活性的SVA，能引发癌细胞裂解并继续传播病毒。
本研究开发了一种用细菌递送溶瘤病毒治疗癌症的方法，为癌症的靶向治疗提供了新思路。
(1)工程菌进入癌细胞的方式是______。
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(2)请根据学习材料，对下列选项进行排序，说明使用工程菌实现癌症靶向治疗的过程：工程菌进入癌细
胞→______→子代SVA 侵染癌细胞。
a．SVA 的RNA 释放至癌细胞的细胞质
b．形成病毒衣壳蛋白、RNA 复制酶等
c．合成SVA 的RNA
d．合成SVA 的多聚蛋白
e．子代SVA 组装并释放
f．表达E1、E2 蛋白和T7RNA 聚合酶等
(3)将少量工程菌与癌细胞共培养，工程菌进入癌细胞后，释放的SVA 能继续增殖，扩大传播，随时间推
移可观察到荧光的变化是______。
(4)为证明工程菌可以避免血液中SVA 抗体的影响，进而发挥抗肿瘤作用，应选择免疫功能______（填
“正常”或“缺陷”）的小鼠进行实验。实验组在第0 天、第7 天和第14 天的处理应依次为______，一
段时间后，检测肿瘤体积和小鼠生存率。
A．注射肿瘤细胞 B．注射工程菌 C．注射SVA D．注
射S 菌
(5)对工程菌进行改进，增添下图中元件4，并将图2 元件3 中蛋白酶P 的识别位点相应编码序列替换为
蛋白酶T 的。请解释与原工程菌相比，改进后工程菌的优点______。
【答案】(1)胞吞
(2)fcadb(c)e
(3)荧光强度会随时间逐渐增强
(4) 正常 C → A → B
(5)在蛋白酶识别位点的替换上。原工程菌中蛋白酶P 的识别位点被替换为蛋白酶T 的识别位点，这一改
动使得工程菌在表达目标蛋白时，能够更精确地被蛋白酶T 切割，从而提高目标蛋白的纯度和产率。此
外，TEV 病毒蛋白酶T 具有高度特异性的识别序列，这有助于减少非特异性切割，进一步优化蛋白表达和
加工过程。因此，改进后的工程菌在蛋白表达和纯化方面具有更高的效率和更好的可控性
【解析】（1）工程菌作为外源颗粒，通常通过细胞膜的内陷形成囊泡，将自身包裹进入细胞内部，这一
过程称为胞吞。
（2）由材料“启动子PJ 和PA 均只在工程菌进入癌细胞后启动，表达出的裂解蛋白E1 和E2 可分别破坏
细菌细胞膜和囊泡膜。启动子PT7 被T7RNA 聚合酶特异性识别，转录出的RNA 可以穿过被破坏的细菌细胞
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膜和囊泡膜释放至癌细胞的细胞质，并完成子代SVA 的合成、组装与释放。”可以知道，应是先表达
E1、E2 蛋白和T7RNA 聚合酶等，即f，然后合成SVA 的RNA，RNA 再进入细胞质，完成病毒增殖，顺序应
为fcadb(c)e。
（3）由于SVA 在癌细胞内不断增殖并扩散，感染的细胞数量增加，导致荧光标记的表达量也随之增加，
因此荧光强度会随时间逐渐增强。
（4）为了证明工程菌可以避免血液中SVA 抗体的影响，进而发挥抗肿瘤作用，应选择免疫功能正常的个
体。这是因为免疫功能正常的个体会产生针对SVA 的抗体，这些抗体会中和或清除SVA，从而影响其抗肿
瘤效果。实验组处理顺序为：第0 天：注射SVA ，刺激机体产生抗体。第7 天：注射肿瘤细胞，使其产
生肿瘤。第14 天：注射工程菌，观察其抗肿瘤效果。对照组注射S 菌，以对比两者差异。实验组处理顺
序为：C → A → B。
（5）改进后工程菌的优点主要体现在蛋白酶识别位点的替换上。原工程菌中蛋白酶P 的识别位点被替换
为蛋白酶T 的识别位点，这一改动使得工程菌在表达目标蛋白时，能够更精确地被蛋白酶T 切割，从而提
高目标蛋白的纯度和产率。此外，TEV 病毒蛋白酶T 具有高度特异性的识别序列，这有助于减少非特异性
切割，进一步优化蛋白表达和加工过程。因此，改进后的工程菌在蛋白表达和纯化方面具有更高的效率
和更好的可控性。
14．（2026·贵州·一模）科学家将鱼的抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，使其可
以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、Hin d Ⅲ、Alu Ⅰ四种限制性内切核酸酶切割位
点，如图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（AmpR为氨苄青霉素抗性基因），其中①~④是转基因抗冻
番茄培育过程中的相关步骤，甲、乙表示相关结构或细胞。请据图回答下列问题：
(1)在构建重组DNA 时，可用一种或多种限制性内切核酸酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后
产生的末端发生任意连接，在此实验中应该选用限制性内切核酸酶_____分别对含鱼的抗冻蛋白基因的
DNA 片段和质粒进行切割，充分切割后产生的DNA 片段分别为_____种和_____种。
(2)基因工程中的核心步骤是_____（填序号），该步骤的目的是_____。为了使目的基因正常表达，其上
游必须有启动子，它是_____识别和结合的部位。若限制酶切出了黏性末端，要选择_____（填“E.coli
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DNA 连接酶”“T4 DNA 连接酶”或“E.coli DNA 连接酶或T4 DNA 连接酶”）进行连接。
(3)图中将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄细胞的方法称为_____。它是利用载体Ti 质粒中含有_____，可以
将目的基因整合到宿主细胞的染色体DNA 上。
(4)检测番茄植株细胞中鱼的抗冻蛋白基因是否成功表达，从分子水平上常采用的方法是_____。
【答案】(1) Pst Ⅰ、Sma Ⅰ 4/四 2/二/两
(2) ① 使目的基因在受体细胞中稳定存在、成功表达和发挥作用并能遗传给下一代 RNA 聚
合酶 E.coli DNA 连接酶或T4 DNA 连接酶
(3) 农杆菌转化法 T-DNA
(4)抗原—抗体杂交
【解析】（1）据图分析，鱼的抗冻蛋白基因（目的基因）上具有三种限制酶切割位点，Alu Ⅰ的切割位
点存在于目的基因中，因此不宜选用Alu Ⅰ，质粒上有Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、Hind Ⅲ、Alu Ⅰ四种限制酶切割
位点，Pst Ⅰ的切割位点存在于目的基因的两侧，Sma Ⅰ的切割位点存在于目的基因的左侧，为避免目的
基因和载体酶切后自身环化、任意连接，需要用两种限制酶切割产生不同末端，应该选择Pst Ⅰ、Sma Ⅰ
分别切割目的基因和质粒； 含目的基因的DNA 是线性分子，共有3 个酶切位点（2 个Pst Ⅰ、1 个
Sma Ⅰ），线性DNA 中n 个酶切位点产生n+1 个片段，因此共产生3+1=4 个片段；质粒是环状DNA，共有2
个酶切位点（1 个Pst Ⅰ、1 个Sma Ⅰ），环状DNA 中n 个酶切位点产生n 个片段，因此产生2 个片段。
（2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即图中的①步骤，构建基因表达载体的目的是使目的
基因在受体细胞内稳定存在和成功表达、并能遗传给下一代；启动子是RNA 聚合酶识别和结合的位点，
驱动目的基因转录；E.coliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶都可以连接黏性末端，故要选择E.coli DNA 连接
酶或T4 DNA 连接酶进行连接。
（3）将目的基因导入番茄细胞等植物细胞常用农杆菌转化法，利用载体Ti 质粒中含有T—DNA，可以将
目的基因整合到宿主细胞的染色体DNA 上。
（4）番茄植株细胞中鱼抗冻蛋白基因表达的产物是抗冻蛋白，可以利用抗原一抗体杂交技术进行检测。
15．（2026·北京石景山·一模）野生型黄瓜为雌雄同株异花植物，植株上存在单性雄花（只有雄蕊）
和单性雌花（只有雌蕊），雌花直接影响果实产量。乙烯和生长素在调控雄花和雌花发育中起重要作用，
某科研团队对此开展了系列实验。
(1)黄瓜开花是由激素调节、_______和环境因素调节共同构成的网络调控的。黄瓜花芽最初都存在雌蕊
原基和雄蕊原基。在发育特定阶段，雌蕊或雄蕊原基选择性败育分别产生雄花或雌花。
(2)施加适宜浓度的外源生长素，可诱导野生型黄瓜开雌花 检测生长素响应因子ARF3 在雌、雄花中
的表达量，结果如图1．图1 结果显示_______。
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(3)已知STM 与WIP1 是影响雌蕊发育的关键因子。在研究中，有以下相关发现：第一，花发育早期，雌蕊
原基中特异性表达的STM 基因缺失会导致雌蕊原基完全败育。研究显示ARF3 能直接结合STM 基因启动子
中的P4 元件，调控基因表达。为验证这种相互作用，将不同组分混合保温后，电泳检测荧光素标记条带，
结果见图2，请补充3～5 组的电泳条带结果_______。
第二，ARF3 还可结合WIP1 基因启动子元件。wip1 突变体的表型与arf3 突变体不同。
(4)在花发育极早期，雌蕊原基中的S1 酶（一种乙烯合成酶）催化乙烯大量合成，乙烯通过生长素调控
雌蕊发育。研究揭示，雌蕊发育时，生长素调控S2 酶（另一种乙烯合成酶）合成，该酶还可激活雄蕊抑
制因子。请推测，施加生长素可诱导S1 酶合成缺失突变体开_______花。可见，乙烯与生长素在调控黄
瓜雌花发育中存在_______关系。
(5)请根据上述研究，完善黄瓜雌花发育的调控模型_______。
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【答案】(1)基因表达调控
(2)花发育早期ARF3 在雌花中表达量高，雄花中几乎不表达，且这种差异在阶段1 更明显
(3)
(4) 雌 协同作用
(5)
【解析】（1）植物的生长发育是由激素调节、基因表达调控和环境因素调节共同构成的网络调控的，黄
瓜花芽的性别分化也遵循这一规律。
（2）由图1 可知，阶段1（花早期发育关键阶段）雌花的ARF3 相对表达量远高于雄花，雄花中几乎不表
达；阶段2（花发育后期阶段）雌花中ARF3 表达量也高于雄花，但差异不显著，因此核心结论为花发育
早期ARF3 在雌花中表达量高，雄花中几乎不表达，且这种差异在阶段1 更明显。
（3）该实验原理是ARF3 与荧光标记P4 结合后，电泳迁移速率减慢，出现滞后条带；加入未标记P4 会竞
争性结合ARF3，导致标记P4 的结合量减少，滞后条带亮度降低，游离P4 条带亮度升高。1 组仅加标记
P4，仅出现游离P4 条带；2 组加标记P4+ARF3，出现滞后条带；3~5 组加入不同浓度未标记P4，竞争性抑
制作用随浓度升高增强，因此滞后条带逐渐变暗，游离条带逐渐变亮。
（4）S1 酶是乙烯合成酶，其合成缺失突变体无法合成大量乙烯，但施加生长素可诱导开雌花，说明生长
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素可独立于S1 酶调控雌花发育；乙烯通过生长素调控雌蕊发育，生长素又调控S2 酶合成，二者共同促进
雌花发育，因此乙烯与生长素在调控黄瓜雌花发育中存在协同作用关系，施加生长素可诱导S1 酶缺失突
变体开雌花。
（5）花发育极早期，雌蕊原基中的S1 酶催化乙烯大量合成使乙烯含量增多，乙烯激活生长素信号通路，
生长素一方面促进ARF3 基因表达，ARF3 通过直接结合STM 基因启动子激活STM 基因表达以启动和促进
雌蕊发育，同时抑制WIP1 基因表达以解除其对雌蕊发育的抑制，另一方面调控S2 酶合成增多，S2 酶激
活雄蕊抑制因子以抑制雄蕊发育，最终通过促进雌蕊发育、抑制雄蕊发育的双重调控，使花芽选择性败
育雄蕊原基，形成雌花，具体调控模型见答案。
16．（2026·辽宁抚顺·一模）条锈病是小麦的一种常见疾病，不仅会直接影响产量，更会对品质、种
植成本甚至生态环境造成深远影响。科研人员从野生二粒小麦等近缘种中找到广谱抗病基因Yr15，并欲
通过基因工程获得抗条锈病小麦。基因Yr15 及质粒的结构如图所示，相关酶的识别序列及酶切位点如表
所示。回答下列问题：
注：LB/RB 为T-DNA 的边界序列，
为卡那霉素抗性基因。
(1)科研人员利用获得的基因Yr15 的mRNA 通过___________过程获得目的基因，并通过___________技术
对目的基因进行扩增。
(2)已知不同平末端携带的化学基团不同，这导致平末端的连接具有特异性，需要由不同的DNA 连接酶催
化完成。为了将切割后的目的基因Yr15 同质粒连接形成重组质粒，需要使用Sma Ⅰ和___________(填表
格中限制酶)对质粒进行切割并将切割后的黏性末端补齐为平末端，不使用另外一种限制酶的原因是
___________。若只使用Sma Ⅰ连接目的基因和质粒，则弊端是___________。
(3)据图可知，可将导入重组质粒的小麦组织细胞放入含___________的培养基中进行初步筛选，为了使
愈伤组织朝着人为既定方向分化，通常可通过调整___________的含量来实现。
【答案】(1) 逆转录#反转录 PCR（多聚酶链式反应）
(2) Xba Ⅰ或Pst Ⅰ 质粒上有2 个BamH Ⅰ酶切位点，其中一个位于终止子内部，切割后会破坏
终止子，丢失终止子片段 目的基因和质粒易发生自身环化，目的基因易反向连接，降低重组质粒的
获得效率
(3) 卡那霉素 生长素和细胞分裂素
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【解析】（1）以mRNA 为模板合成DNA 的过程为逆转录，是获取真核生物目的基因的常用方法，科研人员
利用获得的基因Yr15 的mRNA 通过逆转录（反转录）过程获得目的基因，体外扩增目的基因的技术为PCR
技术。
（2）由图可知，目的基因两端仅含Sma Ⅰ酶切位点，切割后产生平末端；需选择不破坏启动子、终止子
的限制酶切割质粒，由于质粒上有两个BamH Ⅰ识别位点，其中一个位于终止子内部，切割后会破坏终止
子，丢失终止子片段，导致转录无法终止，而Xba Ⅰ和Pst Ⅰ的酶切位点位于启动子和终止子之间，不会
破坏启动子和终止子，故需要使用Sma Ⅰ和Pst Ⅰ或Xba Ⅰ对质粒进行切割并将切割后的黏性末端补齐为
平末端，而不使用BamH Ⅰ。仅用Sma Ⅰ单酶切时，由于所有末端相同，会出现目的基因和质粒易发生自
身环化，目的基因易反向连接，降低重组质粒的获得效率等弊端。
（3）质粒上的标记基因是卡那霉素抗性基因，因此可将受体细胞放在含卡那霉素的培养基中初步筛选；
植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的含量比例可以调控愈伤组织的分化方向，因此可通过调整生长
素和细胞分裂素含量实现定向分化。
17．（2026·辽宁丹东·一模）为解决转基因作物中抗生素抗性标记基因（如潮霉素抗性基因hpt）残留
带来的安全风险，研究人员构建了一种可在获得转基因植株后主动剔除标记基因的化学诱导系统。回答
问题：
(1)loxP 是一段DNA 序列，Cre 酶遇到两段同向的loxP 序列时，能将其中间的序列删除。利用Cre-loxP
重组系统将Cre 基因和hpt 基因置于两段同向loxP 序列中，导入农杆菌T-DNA 内进行抗虫棉的转化，T-
DNA 将整合到受体细胞的_________上，导入植物细胞后Cre 表达并发挥作用，这阻碍了标记基因发挥
_________的功能。
(2)糖皮质激素受体（GR）合成后会与HSP 蛋白形成复合物停留在细胞质基质中，一旦有糖皮质激素
（GC）的存在，二者将分离，在GC 的诱导下GR 进入细胞核发挥作用。基于此科学家构建了GR-Cre 融合
蛋白，通过人为喷施地塞米松溶液（人工合成的糖皮质激素）引导GR-Cre 融合蛋白进入细胞核，以实现
标记基因的主动剔除。
①将糖皮质激素受体（GR）基因插入含Cre 基因的表达载体中，使其在棉花细胞中表达GR-Cre 融合蛋白
（如图1）。GR 蛋白的功能端（C 端）含有与HSP 蛋白结合的位点，Cre 蛋白的功能端（N 端）是发挥切
割DNA 活性的部位。研究表明，若两种蛋白的功能端连接，会导致融合蛋白功能异常，据此推测改造后
的上下游基因结构应为_________（填A 或B）。
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②为使扩增后的GR 基因与Cre 基因正确连接形成融合基因，应选用限制酶_________对Cre 质粒进行双酶
切割。用PCR 技术扩增GR 基因时，b 链对应引物所包含的碱基序列为5’-_________（写出12 个碱基序
列）-3’，若上游基因中编码终止密码的序列未切除，则融合基因表达的蛋白为_________。
(3)图2 是构建完成的T-DNA 序列，LB 和RB 代表T-DNA 的左右边界，目的基因省略。gus 基因编码的酶可
催化无色底物生成蓝色产物，以配合Cre-loxP 重组系统检测标记基因是否删除成功。假设利用该载体成
功获得了多个转基因棉花株系，对叶片进行酒精脱色后进行以下两组实验：（注：图中启动子只能驱动
其下游第一个基因的表达）
实验组：_________；对照组：喷施等量的清水。一段时间后，检测两组叶片的颜色，若标记基因删除成
功则实验组叶片应出现_________（无色/蓝色）斑块。
【答案】(1) 染色体DNA 筛选重组DNA 分子
(2) A EcoRI 和HindIII GAATTCTCTCCG Cre 酶
(3) 喷施一定浓度的地塞米松溶液 蓝色
【解析】（1）农杆菌转化法中，农杆菌Ti 质粒的T-DNA 会整合到植物受体细胞的染色体DNA 上；抗性标
记基因的功能是筛选重组DNA 分子，Cre 酶切除标记基因后，标记基因无法发挥筛选功能。
（2）①由题意可知：Cre 的功能端是N 端，GR 的功能端是C 端，两种功能端连接会导致融合蛋白功能异
常。A 结构中，Cre 的非功能端C 端与GR 的非功能端N 端连接，两个功能端不直接连接，功能正常，因此
改造后的上下游基因结构应为A。
②要将GR 基因正确连接在Cre 基因下游、终止子上游，需要对Cre 质粒的Cre 下游、终止子上游区域双
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酶切，据图可知对应限制酶为EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ。b 链是转录模板链，双链反向平行，b 链3'端序列为
5'−TTGATA…CGGAGA−3'，PCR 引物与模板互补，延伸方向为5'→3'，且需要添加EcoR Ⅰ切割序列，因此
对应b 链的引物5'端12 个碱基为5'−GAATTCTCTCCG−3'。若上游Cre 基因的终止密码子编码序列未切除，
翻译会提前终止，仅能翻译出Cre 酶，无法得到完整的融合蛋白。
（3）实验是检测地塞米松诱导下标记基因是否删除，因此实验组为喷施适量的地塞米松溶液，对照组喷
施等量清水。若标记基因删除成功，两个同向loxP 之间的序列被Cre 酶切除，原本位于最上游的启动子
下游第一个基因变为gus 基因，启动子驱动gus 基因表达，其产物催化无色底物生成蓝色产物，因此实验
组叶片会出现蓝色。
18．（2026·四川宜宾·一模）异丁胺是一种重要的化工原料，其胞内合成代谢途径见图。通过微生物
发酵生产异丁胺时常难以兼顾菌株生长和产物合成间的平衡，研究人员尝试利用基因工程技术提高菌株
的生产能力。回答下列问题：
(1)据图推测，真核细胞中TCA 循环发生在线粒体______（填“基质”或“内膜”）。将asgltA 基因导入
菌株中，其转录形成的RNA 能与gltA 基因的mRNA 结合形成部分双链，gltA 基因表达的_______（填“转
录”或“翻译”）过程受阻，减少丙酮酸进入TCA 循环，积累丙酮酸用于异丁胺的生产，但此时菌株的
生长未受明显影响。
(2)为实现利用温度对大肠杆菌代谢的调控，研究人员构建了两种质粒，并分别以红色荧光蛋白mCherry
和绿色荧光蛋白GFP 为模式蛋白，检测质粒的调控能力。
注：PRM为持续性表达启动子，PR和Ptrc-box为特异型启动子（分别被CI 蛋白二聚体和pdhR 蛋白识别并抑
制），
或
代表抑制，
代表终止子。
①为了使细胞中质粒1 中mCherry 蛋白的表达同时受到温度和丙酮酸的调控，可在质粒2 的_________处
（填“A”或“B”）插入pdhR 基因，将改造后的质粒1 和质粒2 导入敲除pdhR 基因的大肠杆菌获得菌株
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L1，菌株L1 在30℃时会发出___色荧光。
②pdhR 蛋白无法结合天然启动子Ptrc。在Ptrc 后插入box 序列即可得到质粒1 中的启动子Ptrc-box。
研究人员通过下图实验证明pdhR 蛋白可以直接结合启动子Ptrc-box。由此推测，实验中P 是指无荧光标
记的_________（填“Ptrc-box”或“无关启动子”），并在泳道5 的方框中补充可能的条带宽度
____________。
【答案】(1) 基质 翻译
(2) B 红 Ptrc-box
【解析】（1）真核细胞的 TCA 循环发生在线粒体基质，线粒体内膜是有氧呼吸第三阶段的场所。将
asgltA 基因导入菌株中，asgltA 转录的 RNA 与 gltA 的 mRNA 结合形成部分双链，会阻碍核糖体与
mRNA 结合，使其翻译过程受阻，减少丙酮酸进入 TCA 循环，为异丁胺合成积累原料，因而能提高异丁
胺的产量。
（2）①将 pdhR 基因插入质粒 2 的 B 处，使 pdhR 表达受温度调控，进而通过 pdhR 调控质粒 1 的
mCherry，实现温度和丙酮酸的控制，将改造后的质粒1 和质粒2 导入敲除pdhR 基因的大肠杆菌获得菌株
L1，30℃时 CI 蛋白形成二聚体，抑制 pdhR 表达，进而不能对启动子 Ptrc 起到抑制作用，因而
mCherry 基因（红色荧光）持续表达，故菌株发红光。
②在Ptrc 后插入box 序列即可得到质粒1 中的启动子Ptrc-box。研究人员通过下图实验证明pdhR 蛋白可
以直接结合启动子Ptrc-box。图示实验为凝胶迁移实验，P 是无荧光标记的Ptrc-box，用于验证 pdhR
与该启动子的直接结合，实验仅检测荧光标记的 Ptrc-box，与泳道 2 相比，泳道 5 的 pdhR 与标记
Ptrc-box 的结合效率完全相同，因此条带 1 的宽度与泳道 2 一致，条带 2 的宽度也与泳道 2 一致，
补充可能的条带宽度如图：
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基因工程的应用和蛋白质工程
考点3
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。
1．（2026·北京朝阳·一模）LMNA 基因编码的蛋白可维持细胞核的结构稳定。研究者利用CRISPR/Cas9
技术获得LMNA 突变基因被修复的iPSC 细胞系。该细胞系作为对照在研究中的价值是（ ）
A．验证CRISPR/Cas9 系统对LMNA 基因的编辑效率
B．排除遗传背景差异以确定LMNA 基因突变与表型关系
C．制备可供异体移植的通用型干细胞治疗产品
D．比较LMNA 基因不同突变类型对细胞功能的影响
【答案】B
【解析】A、验证CRISPR/Cas9 系统的基因编辑效率，需要统计处理后成功发生基因编辑的细胞占总处理
细胞的比例，题中仅仅指出已经获得的修复成功的细胞系，A 错误；
B、修复后的细胞系与原突变细胞系的遗传背景几乎完全相同，唯一变量为LMNA 基因是否发生突变，作
为对照可以排除其他遗传背景差异的干扰，准确确定LMNA 基因突变与表型的对应关系，B 正确；
C、通用型异体移植干细胞需要进行基因修饰以消除免疫排斥相关的抗原，本题仅修复了LMNA 突变，C 错
误；
D、该细胞系仅将突变的LMNA 基因修复为正常类型，没有多种不同突变类型的LMNA 基因，无法比较不同
突变类型对细胞功能的影响，D 错误。
2．（2026·天津·一模）烈酒辛辣的口感和强烈的“后劲”并非因为高浓度的酒精，而是由酿造过程中
其他的发酵产物——杂醇油产生的。为了增强烈酒的顺滑度，研究人员开发了分解杂醇油的酶系
viriato，并试图优化生产该酶系的微生物。下列分析合理的是（ ）
A．通过增加viriato 的使用量可以提高烈酒的“辣”度
B．发酵过程中，通过稀释涂布平板法能直接计数生产viriato 的微生物的数量
C．viriato 属于单细胞蛋白类产品，可通过提取、分离和纯化获得产品
D．可采用诱变、基因工程等技术对生产viriato 的微生物进行优化
【答案】D
【解析】A、viriato 是分解杂醇油的酶系，杂醇油是导致烈酒辛辣口感的物质，增加viriato 使用量会
使杂醇油分解量增多，降低烈酒的“辣”度，A 错误；
B、稀释涂布平板法通过统计菌落数推算活菌数量，属于间接计数法，且统计结果一般低于实际活菌数，
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不能直接计数微生物数量，B 错误；
C、单细胞蛋白指微生物菌体本身，viriato 是微生物产生的酶系，属于代谢产物，不属于单细胞蛋白，C
错误；
D、诱变育种（通过诱导基因突变筛选高产菌株）、基因工程技术（定向改造微生物的遗传特性）都可用
于优化生产viriato 的微生物，提高酶系产量，D 正确。
3．（2026·湖北·一模）某同学利用我国人工智能大模型检索现代发酵工程应用相关的问题。下列检索
的结果存在科学性错误的是（ ）
A．发酵工业体系形成得益于原料丰富价廉、产物种类多、生产条件严苛
B．发酵工程生产的单细胞蛋白就是微生物菌体，可作为食品添加剂或饲料
C．可通过人工诱变、基因工程、从自然界直接筛选等方式获得性状优良的菌种
D．啤酒的工业化生产主发酵阶段完成酵母菌繁殖、大部分糖的分解及代谢物生成
【答案】A
【解析】A、发酵工业的优势在于原料来源广泛且成本低廉（如农副产品）、产物种类多样（如抗生素、
酶制剂等），但发酵工程的生产条件通常是相对温和的（比如常温常压），而非“严苛”，A 错误；
B、单细胞蛋白指通过发酵工程获得的微生物菌体本身（如酵母菌、细菌），富含蛋白质，可作为食品添
加剂（如营养强化剂）或动物饲料，B 正确；
C、优良菌种的选育方法包括人工诱变（诱导基因突变）、基因工程（定向改造遗传物质）及从自然界筛
选（分离野生型菌株），均为现代发酵工程常用技术，C 正确；
D、啤酒工业化生产中，主发酵阶段主要完成酵母菌的大量繁殖、大部分糖类分解（产生乙醇和CO ）及
₂
代谢产物积累（如风味物质），后发酵阶段则进行澄清与熟化，D 正确。
故选A。
4．（2026·福建泉州·一模）普通大肠杆菌存在如图虚线框所示的代谢途径。研究人员尝试通过转入
PKS 基因改变大肠杆菌相关代谢途径以生产聚酮类化合物（一种药物原料），结果发现转PKS 基因大肠杆
菌聚酮类化合物的产量低，原因是：①受生物素调控的M-CoA 合成量低；②M-CoA 是细胞中脂肪酸唯一合
成来源；③ACC 途径的存在会干扰PKS 起作用。为提高产量，研究人员通过敲除生物素合成基因同时导入
一条M-CoA 外源合成途径（建立一条新“生产线”），使其能够利用外源补充的丙二酸合成M-CoA。下列
叙述正确的是（ ）
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A．切断M-CoA 内源合成途径，利于精准控制聚酮类化合物产量
B．改造转PKS 基因大肠杆菌时，也可敲除丙酮酸生成途径的基因
C．培养改造后的大肠杆菌时，应以丙二酸为培养基中的唯一碳源
D．进一步切断脂肪酸合成途径，以大幅度提高聚酮类化合物产量
【答案】A
【解析】A、切断M-CoA 内源合成途径，导入一条M-CoA 外源合成途径，有利于精准控制聚酮类化合物产
量，A 正确；
B、丙酮酸是许多代谢过程的重要中间产物，不可敲除丙酮酸生成途径的基因，B 错误；
C、丙二酸是合成M-CoA 的原料，但大肠杆菌仍需要丙酮酸等其他代谢中间产物，因此不能以丙二酸为唯
一碳源，C 错误；
D、脂肪酸是合成磷脂的前体，因此不能切断脂肪酸合成途径，否则大肠杆菌的结构和代谢会异常，D 错
误。
5．（2026·北京丰台·一模）人类的cGAS 蛋白会抑制DNA 断裂后的修复，导致DNA 损伤积累。但裸鼹鼠
的cGAS 蛋白却能促进DNA 修复。研究发现两者的cGAS 蛋白有4 个氨基酸不同。下列叙述错误的是
（ ）
A．DNA 损伤积累可能会诱发细胞衰老和癌变
B．氨基酸不同会引起cGAS 蛋白空间结构不同
C．裸鼹鼠与人类的cGAS 基因上的密码子不同
D．通过基因工程可以改造人类的cGAS 蛋白
【答案】C
【解析】A、细胞衰老的诱因包括DNA 损伤长期积累，同时DNA 损伤积累可能导致原癌基因、抑癌基因发
生突变，进而诱发细胞癌变，因此DNA 损伤积累可能会诱发细胞衰老和癌变，A 正确；
B、蛋白质的空间结构由氨基酸的种类、数目、排列顺序以及肽链的盘曲折叠方式共同决定，两种生物的
cGAS 蛋白存在氨基酸差异，会引起其空间结构不同，B 正确；
C、密码子是mRNA 上决定一个氨基酸的三个相邻碱基，基因是有遗传效应的DNA 片段，基因上不存在密码
子，C 错误；
D、基因工程可定向改造目的基因，进而改造其表达的蛋白质，因此可通过基因工程改造人类的cGAS 蛋
白，D 正确。
6．（2026·河北邯郸·一模）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料难以降解，易造成严重的环境污染。
科研人员从某种细菌中发现了一种能降解PET 的酶（PETase），但其热稳定性和降解效率较低。通过分
析PETase 的三维结构，将其中第238 位的甘氨酸替换为酪氨酸后，获得的新型酶（FAST-PETase）在40
～50℃下的降解效率提高了数百倍，其在塑料回收中展现出应用前景。下列叙述错误的是（ ）
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A．改造PETase 从根本上是对其编码基因进行修饰
B．对PETase 分子结构与功能的深入了解是成功改造的关键
C．获得FAST-PETase 的基因后，可将其直接导入工程菌用于工业化生产
D．该改造体现了“从预期功能出发→设计蛋白质结构→改造基因”的蛋白质工程思路
【答案】C
【解析】A、蛋白质是由基因编码的，要对蛋白质进行改造，从根本上来说就是要对其编码基因进行修饰，
A 正确；
B、蛋白质工程的前提是明确蛋白质结构与功能的对应关系，对PETase 分子结构与功能的深入了解才能
实现针对性改造，是成功改造的关键，B 正确；
C、获得FAST-PETase 的基因后，需要先构建基因表达载体后才能导入工程菌，使目的基因在受体细胞中
稳定存在并表达，C 错误；
D、蛋白质工程的基本思路就是从预期功能出发，设计出具有相应功能的蛋白质结构，然后根据蛋白质结
构推测出对应的氨基酸序列，进而确定相应的基因序列，对基因进行改造，D 正确。
7．（2026·山东青岛·一模）抗体结构分为可变区（V 区）和恒定区（C 区，是抗体分子中相对较为保
守的区域，在不同物种间的差异较大），与抗原特异性结合的区域为CDR 区，位于V 区中。单克隆抗体在
疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从
而削弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，主要流
程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．鼠—人嵌合抗体至少含有4 个游离氨基，其抗体特异性由肽链的C 区决定
B．鼠源单抗易引发人体免疫排斥反应可能与其可变区有关
C．为提高嵌合基因与载体的连接效率，扩增时应在两条引物的5'端添加同种限制酶酶切位点
D．鼠—人嵌合抗体的研制过程属于蛋白质工程，图中转染细胞的方法可能是显微注射法
【答案】D
【解析】A、由图可知，鼠—人嵌合抗体含有4 条肽链，因此至少含有4 个游离氨基，抗体与抗原特异性
结合的区域为CDR 区，位于V 区中，因此，抗体特异性由肽链的V 区决定，A 错误；
B、恒定区是抗体分子中相对较为保守的区域，在不同物种间的差异较大，鼠源单抗易引发人体免疫排斥
反应可能与其恒定区有关，B 错误；
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C、子链延伸只能从5′端向3′端，为避免自身环化和反向链接，应使用两种不同的限制酶进行酶切，
因此应在两条引物的5′端添加不同的限制酶酶切位点，C 错误；
D、鼠—人嵌合抗体是对鼠源抗体改造，即对蛋白质改造，属于蛋白质工程；将基因表达载体导入动物细
胞常用显微注射法，D 正确。
8．（2026·河北承德·一模）葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，科研人员将其第138 位甘氨酸
（GGU）以脯氨酸（CCU）替代，其最适反应温度提高10～12℃，从而提高了该酶的热稳定性。下列叙述
错误的是（ ）
A．可通过PCR 技术实现GI 基因定点突变
B．改造后的基因嘧啶碱基比例与改造前相同
C．可将改造后的GI 基因直接导入大肠杆菌中生产GI
D．改造后的GI 的空间结构可能发生了改变
【答案】C
【解析】A、可以通过设计特定的引物，利用PCR 技术实现GI 基因的定点突变，A 正确；
B、基因中嘧啶碱基与嘌呤碱基相等，B 正确；
C、应先构建GI 基因的表达载体再导入大肠杆菌中，C 错误；
D、由于将第138 位甘氨酸（GGU）以脯氨酸（CCU）替代，氨基酸种类改变，其空间结构可能发生了改变，
D 正确。
9．（2026·江西吉安·一模）天然β-淀粉酶（M0）大多耐热性差，不利于工业化应用。科研人员将β-
淀粉酶第2 位的酪氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸可与第97 位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，从而获
得了耐高温β-淀粉酶（M1）。下列叙述错误的是（ ）
A．上述获得M1的过程属于蛋白质工程范畴
B．M0与M1耐热性的差异与两者的空间结构有关
C．检测M1活性时应先将M1与底物混合再设置高温环境
D．替换氨基酸的过程涉及到对相关基因的改造
【答案】C
【解析】A、科研人员通过改变β- 淀粉酶中氨基酸的种类，获得了耐高温β-淀粉酶（M1），这属于对
现有蛋白质进行改造，因此上述获得M1的过程属于蛋白质工程范畴，A 正确；
B、蛋白质的结构决定其功能，M0 与M1 耐热性的差异与两者的空间结构有关，由于M1中形成了二硫键，
其空间结构与M0不同，从而导致耐热性也不同，B 正确；
C、检测 M1 活性时应先将M1置于高温环境中处理一段时间，使M1在高温下保持一定时间后，再与底物混
合，C 错误；
D、蛋白质是由基因控制合成的，替换氨基酸的过程需要通过对相关基因进行改造，使其表达出具有特定
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氨基酸序列的蛋白质，D 正确。
10．（2026·河北承德·一模）人的胰岛素由A 链和B 链构成，德谷胰岛素是在人胰岛素基础上，去除B
链第30 位的苏氨酸、在B 链第29 位赖氨酸上添加脂肪酸侧链制成。进入血液的德谷胰岛素与血清白蛋白
发生可逆性结合，能持续缓慢释放胰岛素，1 次注射即可实现24 小时平稳控糖。下列相关描述错误的是
（ ）
A．德谷胰岛素主要是通过蛋白质工程制备
B．德谷胰岛素可用于1 型糖尿病的治疗
C．德谷胰岛素激活胰岛素受体后，促进葡萄糖通过胰岛素受体进入细胞内
D．使用德谷胰岛素，可有效避免注射普通胰岛素后出现的暂时低血糖现象
【答案】C
【解析】A、蛋白质工程是通过改造或合成基因，对现有蛋白质进行定向改造的技术，德谷胰岛素是对人
胰岛素的氨基酸序列进行改造获得的，属于蛋白质工程的应用范畴，A 正确；
B、1 型糖尿病的发病原因是胰岛B 细胞受损，胰岛素分泌不足，德谷胰岛素具备胰岛素的降血糖功能，
可用于1 型糖尿病的治疗，B 正确；
C、胰岛素受体的作用是识别并结合胰岛素，向细胞内传递降血糖的信号，葡萄糖是通过细胞膜上的葡萄
糖转运载体进入细胞的，并非通过胰岛素受体进入细胞，C 错误；
D、由题干可知，德谷胰岛素进入血液后可缓慢释放，平稳控糖，避免了普通胰岛素注射后短时间内血糖
骤降引发的暂时低血糖现象，D 正确。
11．（2026·宁夏·一模）阪崎克罗诺杆菌是一种严重威胁婴幼儿健康的食源性致病菌，可引发败血症、
脑膜炎等疾病，在乳品中污染风险较高。为实现对该菌的快速、灵敏检测，科研团队构建了基于
CRISPR/Cas12a 系统与PCR 技术结合的荧光检测方法，其核心原理如图，通过检测荧光强度即可判断是否
存在目标致病菌。
注：A．基于CRISPR/Cas12a 的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法检测阪崎克罗诺杆菌的原理；B．有靶标DNA
存在时，crRNA 与DNA 序列结合，激活Cas12a 的反式切割活性，荧光探针（FQ-ssDNA）被剪切；C．无靶
标DNA 存在时，Cas12a 保持未激活状态，荧光探针（FQ-ssDNA）保持完整，检测不到荧光信号
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请结合上述信息和基因工程相关知识，回答下列问题：
(1)PCR 技术扩增阪崎克罗诺杆菌的ompA 基因时，需要在反应体系中加入模板DNA、引物、________和
________等物质。
(2)与传统的菌落平板计数法相比，该荧光检测方法具有灵敏度高、检测速度快等优势。其灵敏度高的原
因之一是PCR 技术能将目标DNA 片段________，另一原因是Cas12a 蛋白被激活后具有________活性，可
放大荧光信号。
(3)该检测方法中，crRNA 与靶DNA 的结合遵循_________原则，Cas12a 蛋白的作用类似于限制酶，但与普
通限制酶相比，其独特之处在于_______。
(4)为验证该检测方法的特异性，科研团队用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等其他食源性致病菌的基因组进
行检测，结果均未出现明显荧光信号。请分析其原因：_______。
【答案】(1) Taq 酶（热稳定DNA 聚合酶） 4 种脱氧核苷酸
(2) 大量扩增（扩增数百万至数十亿倍） 反式切割（非特异性切割单链DNA）
(3) 碱基互补配对 需要crRNA 引导才能特异性识别靶DNA（普通限制酶可直接识别特定核苷酸
序列）
(4)其他致病菌的基因组中无ompA 基因的同源序列，crRNA 无法与其结合，Cas12a 反式切割活性无法被激
活，荧光探针不会被剪切
【解析】（1）PCR 技术扩增目的基因时，反应体系中需要加入模板DNA、引物、Taq 酶（热稳定DNA 聚合
酶）和4 种脱氧核苷酸等物质。
（2）PCR 技术能将目标DNA 片段大量扩增（扩增数百万至数十亿倍），这是该荧光检测方法灵敏度高的
原因之一，由图可知，Cas12a 蛋白被激活后具有反式切割（非特异性切割单链DNA）活性，可放大荧光
信号，这是灵敏度高的另一原因。
（3）在该检测方法中，crRNA 与靶DNA 的结合遵循碱基互补配对原则。Cas12a 蛋白的作用类似于限制酶，
但普通限制酶能特异性识别特定核苷酸序列并在特定位点切割，而Cas12a 蛋白独特之处在于需要crRNA
引导才能特异性识别靶DNA（普通限制酶可直接识别特定核苷酸序列）。
（4）因阪崎克罗诺杆菌的基因组中有ompA 基因的同源序列，crRNA 可以与其特异性结合，Cas12a 反式切
割活性被激活，荧光探针被剪切，会出现明显荧光信号，而金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等其他致病菌的
基因组中无ompA 基因的同源序列，crRNA 无法与其结合，Cas12a 反式切割活性无法被激活，荧光探针不
会被剪切，所以用这些致病菌的基因组进行检测时，结果均未出现明显荧光信号。
12．（2026·湖南长沙·一模）蚊子传播疟疾等疾病，每年影响全球超20 亿人。传统化学杀虫剂因蚊虫
产生广泛抗性而效果下降，急需开发新型环保防控手段。昆虫病原真菌对蚊虫致病力强，对环境较安全，
但自然传播效率低。为此，科研人员通过在昆虫病原真菌中表达长叶烯基因（L）以吸引蚊虫，构建了传
播能力更强的基因工程菌。请回答下列问题：
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限制酶
识别序列和酶切位点
Bgl Ⅱ
A↓GATCT
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
BamH Ⅰ
G↓GATCC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
URA3：真菌筛选标记基因，缺失该基因真菌无法合成尿嘧啶
Ampr：大肠杆菌的筛选标记基因编码氨苄青霉素抗性基因
(1)L 基因可通过人工合成获取，也可以通过________（写出两种方法）获取。
(2)构建重组DNA 分子时，图中质粒还缺少的必备元件是________。为使基因L 能正确连接到图中质粒，
应选用限制酶________来处理质粒。
(3)培育基因工程菌的关键步骤是构建长叶烯基因表达载体，其目的是________（答两点）。将长叶烯基
因表达载体导入野生真菌中后，应在________的培养基上筛选工程菌。通过PCR 鉴定是否成功导入目的
基因时，若模板DNA 分子上两个引物结合区之间有一个与引物识别序列高度相似的序列，则电泳结果除
目的基因所在条带外，还出现一个与加样孔距离更________（填“远”或“近”）的条带。
(4)利用真菌消灭蚊虫属于________防治。为进一步提升工程菌的防控效果，科学家准备将继续改造真菌
使其能定殖于蚊虫滋生地（如水体边缘），持续释放吸引物质。请分析其可能带来的潜在风险：
________（答1 点）。
【答案】(1)构建基因文库、PCR
(2) 复制原点 BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ
(3) 让长叶烯基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；使长叶烯基因能够表达和发挥作用
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缺少尿嘧啶 远
(4) 生物 基因工程菌在环境中持续存活和扩散，可能对局部生态系统产生未知影响；存在基因
向环境中其他微生物发生水平转移的潜在风险，造成基因污染
【解析】（1）基因工程菌是指用基因工程方法，使外源基因得到高效表达的菌类；L 基因可通过人工合
成，也可以通过构建基因文库、利用PCR 扩增获取。
（2）构建重组DNA 分子时，质粒有启动子、终止子，质粒还缺少的必备元件是复制原点；
由于模板链两端具有Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ酶切位点，而Bgl Ⅱ会切掉启动子，因此选择与Bgl Ⅱ具有相同酶
切末端的BamH Ⅰ，质粒上具有BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ，选择限制酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ，基因L 能正确连接，
因此应选用限制酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ处理质粒。
（3） 获得转基因真菌的关键步骤是构建长叶烯基因表达载体，目的主要有两点： 使长叶烯基因在受体
细胞中稳定存在，并遗传给下一代； 使长叶烯基因能够表达和发挥作用。
由于质粒上含有URA3，是真菌筛选标记基因，缺失该基因真菌无法合成尿嘧啶，因此转入该质粒的真菌
能合成尿嘧啶，因此应在缺少尿嘧啶的培养基上筛选；
通过PCR 鉴定是否成功导入目的基因时，若模板DNA 分子上两个引物结合区之间有一个与引物识别序列高
度相似的序列，则可能有部分引物与该高度相似的序列结合，扩增出比模板DNA 更短的一系列DNA 分子，
则电泳结果除目的基因所在条带外，还出现一个与加样孔距离更远的条带。
（4） 生物防治包括利用生物之间的种间关系达到防治的目的，因此利用真菌消灭蚊虫属于生物防治；
该方法可能带来的潜在风险：基因工程菌在环境中持续存活和扩散，可能对局部生态系统产生未知影响；
存在基因向环境中其他微生物发生水平转移的潜在风险，造成基因污染。
13．（2026·广东东莞·一模）瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，因具有显著健康功效，全球市场需求持
续增长。大肠杆菌BL21 产生瓜氨酸的代谢过程如图a 所示，研究人员以该菌株为基础通过基因工程技术
逐步构建了一株高效、无质粒、无需诱导的瓜氨酸生产菌株。
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注：酶后面的英文表示控制该酶合成的基因的缩写；脯氨酸、谷氨酸和精氨酸是组成蛋白质的氨基酸，
缺乏这些氨基酸会影响大肠杆菌的生命活动。
回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是_________。研究人员把大肠杆菌BL21 拟核DNA 上的argG 基因敲除，构建出
CTL1 菌株。配制含不同浓度精氨酸的培养液，发酵结果见下表，实验结果说明精氨酸对瓜氨酸的合成起
_________作用。据图表分析，BL21 菌株中未检测到瓜氨酸的两个主要原因分别是____________。
检测指标
BL21
CTL1+精氨酸（g/L）
CTL1+0
CTL1+0.1
CTL1+0.3
CTL1+0.5
CTL1+1.0
瓜氨酸
（g/L）
0
0.32
0.31
0.17
0.12
0.10
(2)研究人员将CTL1 菌株的proB 基因敲除，构建出CTL2 菌株，发酵48h 后检测发现CTL2 菌株的瓜氨酸
产量显著下降。推测出现此结果的原因是_____。据此，为减少CTL1 菌株中脯氨酸对瓜氨酸产量的影响，
请提出一种改造菌株的新策略______。
(3)为进一步提高瓜氨酸产量，研究人员分别敲除CTL1 菌株的speC 和speE 基因，构建出CTL3 和CTL4 菌
株。根据下图b 的发酵结果，正确的策略是保留____基因，敲除____基因。
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(4)相比目的基因在受体菌的质粒上，目的基因位于拟核DNA 上有什么优势：_________（答出1 点即可）。
【答案】(1) 构建基因表达载体 抑制 精氨酸的合成以瓜氨酸为底物，导致瓜氨酸无法积
累；精氨酸会抑制瓜氨酸的合成，精氨酸浓度越高抑制作用越强
(2) CTL2 菌株因无法合成脯氨酸而生长增殖受到抑制，削弱了瓜氨酸的合成 将PutP 基因敲除
(3) speC speE
(4)能稳定遗传，传代过程中不易丢失
【解析】（1）基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心步骤；根据表格结果，敲
除argG 后，添加的精氨酸浓度越高，瓜氨酸产量越低，说明精氨酸对瓜氨酸合成起抑制作用；BL21 有完
整的argG 基因，其表达的酶会催化瓜氨酸转化为精氨酸，瓜氨酸无法积累；同时细胞内合成的精氨酸进
一步抑制瓜氨酸合成，精氨酸浓度越高抑制作用越强，因此BL21 检测不到瓜氨酸。
（2）proB 编码谷氨酸激酶，催化谷氨酸合成脯氨酸，而脯氨酸是大肠杆菌必需的氨基酸，敲除proB 后
大肠杆菌CTL2 菌株因无法合成脯氨酸而生长增殖受到抑制，削弱了瓜氨酸的合成，因此瓜氨酸产量下降；
若要减少CTL1 菌株中脯氨酸对瓜氨酸产量的影响，可将PutP 基因敲除，既满足大肠杆菌对脯氨酸的需求，
又能让更多谷氨酸流向瓜氨酸合成途径。
（3）根据题意：敲除speC 得到CTL3，敲除speE 得到CTL4。从柱状图可知，敲除speE 的CTL4 瓜氨酸产
量最高，敲除speC 的CTL3 瓜氨酸产量降低，因此正确策略是保留speC，敲除speE。
（4）质粒是游离在拟核外的DNA，细胞分裂时容易丢失，而目的基因整合到拟核DNA 后，可以随拟核DNA
同步复制，能稳定遗传，传代过程中不易丢失。
14．（2026·北京门头沟·一模）枯草芽孢杆菌在营养不足、环境恶劣等条件下会形成抗逆性强的芽孢，
环境适宜时，芽孢恢复活性。我国科学家通过将芽孢包埋在可降解塑料PCL 中，制备出能在特定条件下
加速降解的“活塑料”（制备原理如图1），以期用于食品、日用品等包装。
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(1)为获得用于制备“活塑料”的芽孢，需先在培养基中培养枯草芽孢杆菌。培养基中应提供
____________（答出两种）以及水和无机盐等营养物质，全程保证____________操作。
(2)研究者构建图2 所示的基因表达载体转入枯草芽孢杆菌，获得只有在木糖存在时才能大量表达并分泌
脂肪酶（塑料降解酶）的工程菌。请从以下选项中选择合适的启动子和基因，将所选序号填入相应位置
____________。
启动子：①芽孢杆菌内源启动子②T7 启动子（只被T7RNA 聚合酶识别）③木糖诱导型启动子
基因：
A．脂肪酶基因 B．脂
肪酶基因+分泌信号肽基因
C．T7RNA 聚合酶基因 D．木糖合成酶基因
（注：分泌信号肽能引导蛋白质分泌到细胞外）
(3)研究者将上述表达载体转入用____________处理过的枯草芽孢杆菌中，筛选得到转化成功的工程菌。
再利用重金属刺激工程菌形成工程芽孢，进一步制备出活塑料。
(4)活塑料能实现“在日常使用时不降解、需要回收时启动降解”的目标。活塑料使用完回收后快速降解
所需的条件是____________。
(5)为保证该技术在实际应用中的安全性，在选取工程菌株时，还需要考虑的是____________。
A．对人体和动植物无致病性
B．在完成降解任务后种群会自然衰退
C．在自然环境中具备较强的生存和扩散能力
D．所携带的外源基因不易转移至自然环境
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【答案】(1) 碳源、氮源 无菌
(2)启动子 Ⅰ：③（木糖诱导型启动子），基因Ⅱ：C（T7RNA 聚合酶基因）；启动子Ⅲ：②（T7 启动
子），基因Ⅳ：B（脂肪酶基因+分泌信号肽基因）
(3)CaCl2（或Ca ² ）
⁺
(4)添加木糖；提供适宜环境条件
(5)ABD
【解析】（1）微生物的培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。为获得用于制备“活塑料”的芽孢，
需先在培养基中培养枯草芽孢杆菌，所以培养基中应提供碳源、氮源以及水和无机盐等营养物质。在微
生物培养过程中，为防止杂菌污染，全程要保证无菌操作。
（2）要实现 “木糖存在才大量表达”，必须用木糖诱导型启动子（③） 来控制脂肪酶的表达。同时，
脂肪酶需要分泌到胞外，因此对应的基因必须是脂肪酶基因+分泌信号肽基因（B）。T7 启动子（②）只
能被 T7 RNA 聚合酶识别，因此需要一个 “开关” 来控制 T7 RNA 聚合酶的表达。用木糖诱导型启动
子（③）控制T7 RNA 聚合酶基因（C）：木糖存在时，启动子③激活，表达 T7 RNA 聚合酶；用T7 启动
子（②）控制脂肪酶 + 分泌信号肽基因（B）：T7RNA 聚合酶大量表达后，会特异性识别T7 启动子，启
动下游脂肪酶基因的高强度转录，实现 “大量表达” 的效果。因此启动子Ⅰ（③木糖诱导型启动子）
→基因Ⅱ（C T7 RNA 聚合酶基因）、启动子Ⅲ（②T7 启动子）→基因Ⅳ（B 脂肪酶基因+分泌信号肽基
因）。
（3）将基因表达载体导入微生物细胞时，常用CaCl2（Ca ² ）处理枯草芽孢杆菌，使其成为感受态细胞
⁺
，
便于吸收外源DNA。
（4）由于该“活塑料”是将芽孢包埋在可降解塑料PCL 中，制备出能在特定条件下加速降解的塑料，所
以该塑料使用后回收后快速降解所需的条件是：添加木糖（作为诱导剂，激活木糖诱导型启动子，启动
脂肪酶基因表达）；提供适宜环境条件（包括水分、温度、pH、营养物质等，促使芽孢萌发为活性工程
菌，进而分泌脂肪酶降解PCL）。
（5）A、为保证技术在实际应用中的安全性，工程菌株需对人体和动植物无致病性，这样可以避免对生
物造成危害，A 正确；
B、工程菌株在完成降解任务后种群会自然衰退，能防止其在环境中过度繁殖带来不良影响，保障安全性，
B 正确；
C、工程菌株在自然环境中不应具备较强的生存和扩散能力，否则可能会扩散到不该去的环境中造成生态
问题，C 错误；
D、所携带的外源基因不易转移至自然环境，可防止基因污染等安全隐患，D 正确。
15．（2026·河北廊坊·一模）聚乙烯型塑料应用广泛，但其难降解的特性带来了诸多环境问题。聚酯
酰胺(PEAs)的可水降解性使其有望成为聚乙烯的替代品。某科研团队利用大肠杆菌构建能合成PEAs 的工
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程菌，如图1 表示合成PEAs 相关基因连接形成的DNA 片段，其中①②③④为引物，图2 为载体质粒结
构示意图。回答下列问题：
注:P1、P2 表示启动子;“-1”表示抑制作用。
(1)利用PCR 技术扩增PEAs 合成串联基因时，为保证PEAs 基因能高效表达，应将强启动子碱基序列的
_____端与引物____连接，另一个用于扩增的引物是____。在 PCR 反应体系中，一般要添加Mg ² ，目的
⁺
是____________。
(2)研究人员将强启动子修饰后的PEAs 合成串联基因插入图2 载体质粒的位点1 和位点2 之间。图中的
LacZ 基因编码产生的酶可以分解X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。为了筛选
出含有PEAs 合成串联基因的大肠杆菌，应在培养基中加入_____________，并选择
_______
的菌落。
(3)为了避免工程菌在使用后逃逸造成环境污染，研究人员利用CRISPR/Cas9 系统为工程菌增加了自毁保
护体系，机理如图2 所示。研究结束后，在培养液中加入B 物质，B 物质通过________，使gRNA 基因和
Cas9 基因表达，gRNA 和 Cas9 蛋白形成复合物后，gRNA 通过________识别目标 DNA，Cas9 蛋白对目标
DNA 进行剪切，最终使大肠杆菌死亡。gRNA 基因可设置为______(填“毒蛋白基因”或“生长必需基
因”)的特异性序列。
(4)有人提出还可以在A 蛋白基因上游增加一个温度诱导自毁体系，这样做的优点是___________。
【答案】(1) 3′ ③ ② 激活DNA 聚合酶
(2) X-gal 和四环素 白色
(3) 解除 A 蛋白对P2 启动子的抑制作用 碱基互补配对 生长必需基因
(4)当B 物质诱导途径未能杀死工程菌时，可通过调节温度杀死逃逸的工程菌，避免造成环境污染
【解析】（1）转录过程中子链沿着5'→3'的方向进行，启动子是RNA 聚合酶结合的位点，可驱动下游基
因的转录，为保证PEAs 基因能高效表达，应将强启动子碱基序列的3′端与引物③ 连接，根据子链延伸
方向可知，另一个扩增引物是②；在 PCR 反应体系中，一般要添加Mg2+，Mg2+的作用是激活DNA 聚合酶，
提高酶活性。
（2）研究人员将强启动子修饰后的PEAs 合成串联基因插入图2 载体质粒的位点1 和位点2 之间，此时目
的基因插入LacZ 基因内部，会破坏LacZ 基因，未插入目的基因的质粒LacZ 完整，可表达酶分解X-gal
使菌落变蓝；插入目的基因的质粒LacZ 失活，菌落为白色，同时质粒携带四环素抗性基因，因此培养基
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需要加入X-gal 和四环素，筛选出白色菌落即为含有目的基因的大肠杆菌。
（3）为了避免工程菌在使用后逃逸造成环境污染，研究人员利用CRISPR/Cas9 系统为工程菌增加了自毁
保护体系，机理如图2 所示。原本A 蛋白基因的表达被抑制，在培养液中加入B 物质后，B 抑制了该抑制
作用，即B 物质解除了A 蛋白对P2 启动子的抑制作用，A 蛋白激活启动子P2，使gRNA 基因和Cas9 基因
表达；gRNA 通过碱基互补配对特异性识别目标DNA 序列，Cas9 蛋白对目标 DNA 进行剪切，最终使大肠杆
菌死亡；要使工程菌自毁，需要Cas9 剪切大肠杆菌生存必需的基因，使工程菌死亡，因此gRNA 的识别序
列对应大肠杆菌的生长必需基因。
（4）有人提出还可以在A 蛋白基因上游增加一个温度诱导自毁体系，即可以设计温度敏感型启动子实现，
这样操作的优势为：当B 物质诱导途径未能杀死工程菌时，可通过调节温度杀死逃逸的工程菌，避免造
成环境污染。
16．（2026·宁夏银川·一模）某哺乳动物表皮生长因子（EGF）能够增强该动物肠道屏障，促进肠道发
育，鼠李糖乳杆菌的分泌蛋白p40 能够激活EGF 受体。乳链菌肽是全球唯一获准作为食品添加剂的细菌素，
具有高效的杀菌作用。为实现对该动物肠道具有益生作用的EGF-p40 的安全表达，研究人员构建了食品
级乳酸乳球菌表达系统，过程如下图。回答下列问题。
注：PnisA 为诱导型启动子 nsr 为乳链菌肽抗性基因 CmR 为氯霉素抗性基因
(1)载体P1 中PnisA 位于基因的__________（填“上游”或“下游”），其作用是____________________。
(2)过程①进行PCR 的作用是扩增目的基因和__________。
(3)先用__________处理乳酸乳球菌使其成为感受态细胞，再将获得的载体导入其中，扩大培养后将菌液
涂布在含氯霉素和乳链菌肽的平板上，能否直接鉴定出获得载体P3 的受体细胞？__________，理由是
__________________________________________。
(4)为将融合基因EGF-p40 定向插入载体P2，可以在扩增EGF-p40 的上下游引物的5’端依次添加
__________的识别序列。乳链菌肽被广泛用于食品防腐保鲜，将P1 改造为P2 构建表达载体的优点是
___________________________________________。
【答案】(1) 上游 当诱导物存在时，激活目的基因的表达
(2)去除P1 中的氯霉素抗性基因（CmR）
(3) Ca2+ 不能 受体细胞中无CmR，在含氯霉素的平板上不能存活
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(4) Sac Ⅰ 和 Nco Ⅰ 减少抗生素的使用
【解析】（1）PnisA 为诱导型启动子，启动子是一段特殊的 DNA 序列，位于目的基因的上游，当诱导物
存在时，激活目的基因的表达。
（2）PCR 技术是一种用于体外扩增特定DNA 片段的技术。由图可知，以载体P1 为模板通过过程①进行
PCR 扩增出PnisA 和nsr 相关的DNA 序列，因此过程①进行PCR 的目的是扩增目的基因和去除载体P1 中的
氯霉素抗性基因（CmR）。
（3）用 Ca ² （氯化钙溶液）处理乳酸乳球菌，可以增大细胞膜的通透性，使细胞处于能吸收周围环境
⁺
中 DNA 分子的感受态状态。不能用含氯霉素和乳链菌肽的平板筛选导入载体 P3 的受体细胞，因为受体
细胞中无CmR，在含氯霉素的平板上不能存活。
（4）载体 P2 上存在Sac Ⅰ 和 Nco Ⅰ的酶切位点，在上下游引物 5' 端分别添加Sac Ⅰ 和 Nco Ⅰ的识
别序列，扩增后的融合基因两端就会带有对应的黏性末端，能定向插入到载体 P2 的对应位置。将P1 改
造为P2 的过程中，去除了氯霉素抗性基因，保留了乳链菌肽抗性基因，而乳链菌肽被广泛用于食品防腐
保鲜，因此和载体P1 相比，利用载体P2 构建表达载体可减少抗生素的使用，实现目的基因的安全表达。
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