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专题10 基因工程
1 大考点概览
考点01 基因工程的综合应用
1．（2026·四川广元·二模）科学家利用图示的RNA 干扰技术流程，设计了一种针对某害虫关键基因M
的生物防治策略。他们将靶向基因M 的双链RNA（dsRNA）导入害虫体内，最终导致基因M“沉默”。
下列叙述正确的是（ ）
A．图中Dicer 是一种限制性内切核酸酶，负责将双链RNA 切割成小片段核酸
B．将dsRNA 导入害虫体内后，基因M 的mRNA 会与小核酸在核糖体上发生结合
C．图中dsRNA 中的一条链与基因M 的mRNA 序列互补
D．基因M 沉默后，害虫细胞内所有基因的转录过程都会受到抑制
2．（2026·四川成都·二模）某科研团队在培育铁皮石斛新品种并提取石斛多糖时，分别采用了以下方法：
①将铁皮石斛(二倍体，2n=38)与抗寒的细茎石斛(二倍体，2n=38)体细胞杂交获得杂种植株；②利用铁
皮石斛愈伤组织进行液体悬浮培养规模化提取石斛多糖；③通过农杆菌转化法将冷响应基因导入铁皮
石斛愈伤组织获得转基因植株。下列叙述错误的是（ ）
A．方法①获得的杂种植株含76 条染色体，可通过减数分裂产生正常配子
B．方法②需控制培养基中的激素比例，以利于愈伤组织增殖和多糖合成
C．方法③需筛选含目的基因的愈伤组织，经再分化获得抗寒转基因植株
D．三种方法均依赖植物细胞的全能性，为铁皮石斛品种改良提供新方案
3．（2026·四川乐山·二模）通过动物细胞工程技术，可以利用患者自身细胞在体外诱导发育成特定的组织
器官，然后再移植回患者体内以达到治疗目的。图1 和图2 表示利用患者自身细胞进行器官移植的两种
方法。下列说法正确的是（ ）
考点1
基因工程的综合应用
1
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A．两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的培养
箱中
B．利用两种方法所获得的组织器官的遗传物质均与患者完全相同，因此移植后不会发生免疫排斥反应
C．可利用Ca2＋处理法或显微注射法将Oct3/4 基因、Sox 基因、c-Myc 基因和KIf 基因导入成纤维细胞
D．图2 中供体细胞可不用去除细胞质，将整个供体细胞注入去核的卵母细胞中
4．（2026·四川乐山·二模）据报道，近期武汉科技大学顾朝江团队研发了全球首创的“EMT-Cas12a”疗法：
利用名为“外泌体”的纳米级囊泡搭载基因剪刀“Cas12a”找到被病毒感染的细胞并将病毒基因组剪碎，
从根本上清除病毒。下列说法正确的是（ ）
A．“外泌体”的产生体现了生物膜具选择透过性
B．“外泌体”能精准识别被病毒感染的细胞，依赖的是细胞膜上的磷脂分子
C．“Cas12a”是一种限制性内切核酸酶，不具备特异性
D．可用差速离心法初步分离提纯“外泌体”
5．（2026·四川德阳·二模）某科研团队利用基因工程技术改造里氏木霉（工业上生产纤维素酶的重要菌
株），用于生产人源溶酶体酶，流程如图所示。下列相关叙述正确的是（ ）
A．敲除内源纤维素酶基因的目的是避免发酵产物被降解
B．配制转基因里氏木霉的培养基时应用纤维素作为碳源
C．改造里氏木霉蛋白质分泌途径可以提高目标产物的分泌效率
2
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D．用大肠杆菌代替里氏木霉获得的目标产物分子结构完全相同
6．（2026·四川广安·二模）嵌合抗原受体T 细胞（CAR-T）疗法是一种治疗癌症的新技术。传统方法需从
患者体内分离T 细胞，在体外进行基因改造和扩增后再输回体内。而新方法通过静脉注射靶向脂质纳
米颗粒，将CAR 基因的mRNA 直接送入患者体内的T 细胞，使其转化为CAR-T 细胞。下列叙述正确
的是（ ）
A．传统疗法中T 细胞体外扩增的原理是细胞全能性
B．体内疗法的研发过程不需要动物细胞培养技术支持
C．体内疗法中mRNA 需进入细胞核并整合到染色体DNA 上
D．体内疗法可避免分离T 细胞、体外基因修饰和扩增等流程
7．（2026·四川内江·二模）非特异性过氧合酶（UPO）是一种能催化多种氧化反应的真菌胞外酶。我国科
研人员通过蛋白质工程等技术，将天然UPO 活性中心的一个赖氨酸改造为亮氨酸，以大肠杆菌为受体
细胞，获得了对特定底物的催化效率提升13 倍的UPO。下列有关叙述正确的是（ ）
A．UPO 基本组成单位为核糖核苷酸
B．该研究未涉及UPO 基因结构的改变
C．需依赖受体细胞的内质网等加工UPO
D．通过改变氨基酸序列实现UPO 功能改变
8．（2026·四川广安·二模）我国科学家利用基因工程技术，在烟草中构建“人工叶绿体工厂”，成功合成
治疗糖尿病的多肽药物GLP-1。研究团队将GLP-1 基因与叶绿体特异性启动子连接，构建表达载体，
通过基因枪法导入烟草叶绿体基因组，获得转基因烟草植株。表达载体的结构如图。下列叙述正确的
是（ ）
A．叶绿体特异性启动子应来源于烟草细胞核基因组，以保证在叶绿体中高效转录
B．将目的基因整合到叶绿体基因组中可以降低基因通过花粉向环境扩散
3
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C．该转基因烟草自交后代的所有植株均含有目的基因
D．在含壮观霉素的培养基上筛选得到的植株，其叶片细胞中一定能检测到GLP-1 蛋白
9．（2026·四川凉山·二模）某病毒对动物养殖业危害十分严重，我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为抗原来
制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒。图1 为获得转基因工程菌所示的重组质粒（部分结构），图2
为单克隆抗体制备流程。下列分析错误的是（ ）
A．用P1、P3 进行PCR 扩增可确定工程菌构建是否成功
B．加入PEG 诱导融合形成的②，其中也有未融合细胞
C．③需用选择培养基去除不能产生特异性抗体的细胞
D．④需用克隆化培养和抗体检测，获得检测呈阳性的细胞
10．（2026·四川广安·二模）某研究团队为提升谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸的效率，通过基因敲除技术去
除了乳酸脱氢酶基因（ldh）和丙酮酸氧化酶基因（poxB）以减少副产物，优化菌株糖转运系统，最
终在发酵罐中实现L-缬氨酸高效积累。下列叙述正确的是（ ）
A．基因敲除ldh 和poxB 时，必须使用的工具酶包括限制酶、DNA 连接酶和Taq 酶
B．将改造后的菌株接种到液体培养基中进行扩大培养，用血细胞计数板进行活菌计数
C．该发酵过程中，需维持罐内温度、pH 和溶氧等条件稳定，不必对发酵罐进行灭菌
D．该研究成果表明，基因工程改造菌株并优化发酵工艺，可提高目标产物的产量
11．（2026·四川宜宾·二模）在高中生物学实验中，同一种试剂或溶液往往因浓度、使用时机或搭配方法
不同而发挥不同的作用。下列有关实验试剂的叙述正确的是（ ）
A．在“检测生物组织中的脂肪”实验中，体积分数为50%的酒精可增强染液对脂肪的附着力
B．在“绿叶中色素的提取和分离”实验中，利用不同色素在无水乙醇中溶解度不同进行分离
C．在“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，需用体积分数95%的酒精洗去卡诺氏液
D．在“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，加入体积分数95%的酒精，目的是溶解DNA 获得更多丝状
物
12．（2026·四川内江·二模）研究人员将新型冠状病毒表面刺突蛋白的受体结合域（RBD）基因导入水稻
愈伤组织，培育获得多个稳定表达RBD 的转基因水稻株系。下列叙述错误的是（ ）
A．可通过农杆菌转化法将RBD 基因导入水稻愈伤组织
B．转化后的愈伤组织需经脱分化和再分化才能获得植株
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C．培育过程中需调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例
D．转入的RBD 基因可能因插入位置不同影响内源基因功能
13．（2026·四川成都·二模）生物兴趣小组成员对高中生物学教材中的实验进行探究，下列关于实验的叙
述正确的是（ ）
A．调查遗传病时，选群体中发病率较高的单基因遗传病更容易推断其遗传方式
B．用高倍显微镜观察叶肉细胞，可以观察到叶绿体的形态、分布和双层膜结构
C．进行DNA 粗提取时，采用冷酒精作为DNA 的溶剂可初步分离DNA 与蛋白质
D．探究NAA 促进月季插条生根的最适浓度，进行预实验不需要设置清水对照组
14．（2026·四川成都·二模）2015 年，屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法获得了诺贝尔奖。工业上青
蒿素一般从青蒿植株中提取，产量低，价格高。科研人员利用基因工程改造酵母菌，使其高效生产青
蒿酸（青蒿素前体），再通过优化代谢途径、发酵条件，极大地提高青蒿酸产量，最终再经化学转化
即可合成青蒿素，这一技术将青蒿素生产成本降低80%。下列叙述正确的是（ ）
A．需要利用花粉管通道法将青蒿酸合成基因导入酵母菌
B．青蒿素属于酵母菌代谢过程中产生的次生代谢物
C．发酵结束后，可通过过滤、沉淀等手段从发酵液中获得青蒿酸
D．与上述方法相比，利用青蒿细胞工厂化生产获得青蒿素的周期更长
15．（2026·四川内江·二模）我国育种工作者利用普通小麦（AABBDD，6n=42）与黑麦（RR，2n=14）培
育抗白粉病、抗秆锈病的优质小麦品系，过程如图1。黑麦1 号染色体上紧密连锁着抗白粉病基因
（P）和抗秆锈病基因（S），同时携带的L 基因会降低面粉品质；育种过程中利用如图2 的分子标记
a（与两抗病基因紧密绑定）、b（在两抗病基因下游）、c（位于L 基因内）进行筛选。下列叙述错
误的是（ ）
A．乙的染色体组成为AABBDDRR，其减数分裂过程中可形成28 个四分体
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B．γ 射线处理使黑麦1 号染色体片段插入普通小麦中的变异属于基因重组
C．在丁中检测到标记a 而无b、c 的株系，优于同时检测到a、b 而无c 的株系
D．育种过程中可利用白粉病、秆锈病病菌在个体水平对小麦抗病性进行鉴定
16．（2026·四川绵阳·二模）基因PCR 定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性
配对碱基的引物，再通过PCR 将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR 是发展最早的定点突变技术，
其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（ ）
A．蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质
B．应将引物1、2 与引物3、4 置于两个独立的反应体系中
C．步骤④使用DNA 聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸
D．步骤⑤中如果完成6 轮循环一共需要消耗63 个引物1
17．（2026·四川泸州·二模）研究发现，过敏性哮喘患者体内IgE 浓度显著高于正常范围，下图是生产一
种用于治疗该病的单克隆抗体的流程图。下列叙述错误的是（ ）
A．构建的表达载体含有抗IgE 抗体的基因
B．转化并培养大肠杆菌可获得大量的表达载体
C．该生产流程运用了动物细胞融合技术
D．该单克隆抗体进入患者体内后不会作为抗原被清除
18．（2026·四川绵阳·二模）ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种主要由小白链霉菌生产的聚阳离子多肽。它对细菌、
酵母菌、霉菌和病毒都具有抑制作用，常作为食品抗菌防腐剂。通过连续发酵生产ε-PL 的流程为：①
选育高产抗病毒菌株并扩大培养→②发酵启动（初始pH 为6.8）→③补料发酵→④诱导合成ε-PL
（pH 降至4.0 左右）→⑤提取精制。下列叙述错误的是（ ）
A．食品中添加的ε-PL 可以被人体消化利用
B．可用基因工程或放射线诱变定向改造菌种
C．改变pH 可切换菌体代谢途径从而合成ε-PL
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D．被杂菌污染或病毒侵染均可导致发酵失败
19．（2026·四川绵阳·二模）人类的每条5 号染色体上有2 个SMN1 或其等位基因。SMN1 有基因内长序
列缺失和微小突变（基因中一个或几个核苷酸发生变化）两种变异类型，其中长序列缺失的突变基因
不能通过现有引物进行PCR 扩增。无正常SMN1 基因的个体患脊髓性肌萎缩症（SMA），不考虑其
他变异，下列说法正确的是（ ）
A．SMN1 基因的长序列缺失属于染色体变异，微小突变属于基因突变
B．SMA 患者的基因型有5 种
C．通过PCR 扩增后电泳，有条带的个体均不患SMA
D．正常夫妇生下患病后代属于基因重组
20．（2026·四川绵阳·二模）下列关于实验选材或操作的叙述正确的是（ ）
A．洋葱鳞片叶外表皮细胞和黑藻成熟叶肉细胞均可用来观察质壁分离现象
B．应选择含叶绿体大且多的植物材料来观察叶绿体
C．低温诱导染色体数目加倍实验中，两次使用酒精的目的相同
D．用洋葱粗提取 DNA 实验中，研磨液经离心或低温静置后取沉淀物置于酒精中
21．（2026·四川绵阳·二模）泰番3 号是通过CRISPR/Cas9 技术精准编辑的番茄新品种，果实的产量和品
质显著提升，部分培育过程如图所示。下列说法正确的是（ ）
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A．该实验的目的基因Spr9 只能从番茄果实中获取
B．sgRNA 与靶DNA 特定碱基序列结合，结合区域最多含8 种核苷酸
C．步骤④中Cas9 蛋白的功能类似于限制酶，步骤⑤连接DNA 片段使用DNA 聚合酶
D．诱导生根的植物组织培养基中细胞分裂素/生长素的比例较高
二、解答题
22．（2026·四川凉山·二模）玉米的叶肉细胞能通过PEPC 酶将低浓度的CO2固定成C4，C4转运到维管束
鞘细胞后释放CO2，提高了维管束鞘细胞中CO2的浓度，再进行卡尔文循环，过程如图所示。卡尔文
循环的Rubisco 酶是CO2固定的关键酶，Rubisco 活化酶（RCA）可以调节Rubisco 酶的活化状态，玉
米RCA 基因的表达水平影响其光合速率。研究者以正常植株W 为参照，构建了RCA 基因表达显著增
加的植株R，实验结果如下表。回答下列问题：
植株
净光合速率
（μmol·m-2·s-1）
胞间CO2浓度
（ppm）
气孔导度
（mol·m-2·s-1）
W
29．4
47．5
174．7
R
33．6
30．7
175．1
(1)玉米中的PEPC 酶和Rubisco 酶都能固定CO2，与CO2的亲和力更强的是_____酶。据图所示生理过
程推测，维管束鞘细胞和叶肉细胞中的叶绿体有哪些方面的不同（答出1 点即可）：_____。
(2)图中由C5转变为PEP 的过程属于_____（填“吸能”或“放能”）反应，该过程产生的AMP 是由
ATP 脱离了两个磷酸基团形成的腺苷一磷酸，可以作为_____合成的基本单位。
(3)通过基因工程在玉米RCA 基因的启动子前连接具有组织特异性的增强子，可显著驱动RCA 基因的
表达，下列关于增强子的理解，正确的是_____（多选）。
①增强子是不具有遗传效应的DNA 片段 ②增强子由4 种脱氧核苷酸单体连接而成
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③增强子单链上相邻碱基以氢键相连接 ④脱氧核糖与磷酸交替连接构成基本骨架
(4)用携带改造后的RCA 基因的农杆菌侵染玉米愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA 进入愈伤组织细
胞，将RCA 基因整合到_____上，将成功转化的愈伤组织诱导形成再生植株的过程称为_____。
(5)与植株W 相比，植株R 的气孔导度几乎没有变化，但净光合速率显著增加，原因是_____。
23．（2026·四川广元·二模）甘油三酯脂肪酶（LIP）在高温条件下易失活，限制了其工业应用。研究人员
从嗜热菌中分离得到一种热稳定蛋白HEAT，该蛋白具有耐高温特性。欲将HEAT 蛋白与LIP 融合，
获得耐高温的重组脂肪酶，部分实验流程如图所示。
（注：AUG 是起始密码子，UGA 是终止密码子。Hind Ⅲ、BamHⅠ和EcoRⅠ均表示限制酶）
(1)图中所示过程需将HEAT 基因和LIP 基因用_______（填工具酶）连接成融合基因，并成功表达出
融合蛋白。在连接前必须对HEAT 基因的_______处（填序号）序列进行改造，其目的是
_______________。
(2)构建重组质粒时，应选用图中________限制酶对融合基因和质粒进行双酶切。
(3)获得HEAT-LIP 融合蛋白后，为检测其酶活性及热稳定性，设计了如下实验：
组别
处理条件
相对酶活性（%）
甲组
天然LIP，37℃处理
30min
100
乙组
天然LIP，70℃处理
30min
15
丙组
HEAT-LIP 融合蛋白，
70℃处理30min
82
分析实验结果，得出的结论是___________________________。
(4)研究人员希望将LIP 基因改造为LIP-M 基因，使LIP 第三位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为天冬氨酸
（Asp），以进一步提高其催化效率。
脂肪酶
部分氨基酸序列
LIP
……Val-Glu-Leu-Gly-Phe-Arg……
LIP-M
……Val-Asp-Leu-Gly-Phe-Arg
通过设计引物并利用PCR 扩增技术将LIP 基因改造成LIP-M 基因，请写出基因的改造思路：
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________________________。
24．（2026·四川达州·二模）科研团队为培育出能发荧光的转基因小鼠（性别决定为XY 型），将水母绿
色荧光基因（GFP）插入质粒中，构建基因表达载体。下图为GFP 基因结构（黑色为编码氨基酸的区
域）、质粒结构和几种限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题。
(1)为确保GFP 能正确连接到质粒中，应使用限制酶________（填名称）切割质粒。若用所选限制酶
切割质粒时，发现质粒完全没有被切开，其原因可能是________。
①限制酶已失活 ②质粒DNA 突变导致限制酶识别位点缺失
③限制酶用量少 ④酶切位点被甲基化修饰而不能被限制酶识别
(2)为获得大量用于转基因操作的GFP，应选用的引物组合是________（从P1～P5中选择）。GFP 编码
的前两个氨基酸分别是甲硫氨酸（密码子为AUG）、色氨酸（密码子为UGG），为了既能保证GFP
准确复制又便于限制酶识别和切割，则选用的左侧引物的碱基序列为5′-________-3′（写出前12 个即
可）。
(3)GFP 可突变成黄色荧光基因（YFP）。将导入1 个GFP 的雄鼠与导入1 个YFP 的雌鼠进行多次杂交，
子代中黄色荧光雌鼠∶无荧光雌鼠∶黄绿荧光雄鼠∶绿色荧光雄鼠＝1 1 1 1
∶∶∶。根据杂交实验结果，分
别写出GFP 和YFP 所在的染色体情况________________。
(4)GFP 常作为报告基因，其编码的蛋白质在紫外光激发下能发出稳定的绿色荧光；GFP 常连接在目的
蛋白基因的末端而形成融合基因，表达生成的荧光蛋白与目的蛋白连接在一起，但并不影响各自的功
能。下列分析正确的有________。
A．GFP 在受体细胞中是否表达，最简单的检测方法是DNA 分子杂交
B．GFP 的表达产物可用于检测被研究蛋白基因在受体细胞内的表达量
C．GFP 的表达产物可用于检测被研究蛋白在受体细胞内的加工和运输途径
D．GFP 与染色体蛋白基因形成融合基因，可用于研究细胞分裂中染色体的变化
25．（2026·四川成都·二模）蚊子传播疟疾等疾病，每年影响全球超20 亿人。传统化学杀虫剂因蚊虫产生
广泛抗性而效果下降，急需开发新型环保防控手段。昆虫病原真菌对蚊虫致病力强、环境较安全，但
自然传播效率低。为此，科研人员通过在昆虫病原真菌中表达吸引蚊虫的长叶烯基因（L），构建了
传播能力更强的基因工程菌。请回答下列问题：
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(1)基因工程菌是_________。L 基因可通过人工合成也可以通过____________（写出两种方法）获取。
(2)构建重组DNA 分子时，图中质粒还缺少的必备元件是_____。为使基因L 能正确连接到图中质粒，
应选用限制酶___________来处理质粒。
(3)获得转基因真菌的关键步骤为__________，此后将其导入野生真菌中以获得转基因真菌，并应在
______的培养基上筛选工程菌。通过PCR 鉴定是否成功导入目的基因时，若模板DNA 分子上两个引
物结合区之间有一个与引物识别序列高度相似的序列，则电泳结果除目的基因所在条带外，还出现一
个与加样孔距离更_____（填“远”或“近”）的条带。
(4)利用真菌消灭蚊虫属于_____防治。为进一步提升工程菌的防控效果，科学家准备将继续改造真菌
使其能定殖于蚊虫滋生地（如水体边缘），持续释放吸引物质。请分析其可能带来的潜在风险：
______。
26．（2026·四川南充·二模）乳糖不耐受症是由于人体小肠中乳糖酶缺乏，导致无法消化乳糖而引起的胃
肠不适。利用基因工程菌生产乳糖酶，进而制备低乳糖乳制品，是解决该问题的重要途径。科研人员
将乳酸克鲁维酵母的LacZ 基因（编码乳糖酶）导入大肠杆菌构建工程菌，LacZ 基因和质粒的结构如
图甲所示。回答下列问题。
注：1．AmpR为氨苄青霉素抗性基因；2．限制酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列分别为5′-G↓GATCC-3′和5′-
G↓AATTC-3′。3．甘氨酸的密码子为GGU、GGA，丝氨酸密码子为UCC、UCG。
(1)获取并快速扩增LacZ 基因的常用方法是______。
(2)构建重组质粒是构建工程菌的核心工作。
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①若用单酶切法（仅用一种限制酶）构建重组质粒，应选择限制酶_______；在快速扩增LacZ 基因时，
需在2 个引物的5′端添加_______（填碱基序列）。
②若用双酶切法（EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ）构建重组质粒，需要利用基因编辑技术将LacZ 基因中BamH Ⅰ
识别序列（该序列编码甘氨酸和丝氨酸）替换为_______。
(3)已知乳糖酶可以分解无色物质X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。将重组质粒导入大肠杆菌后，
检测大肠杆菌工程菌构建成功的思路是_______。
(4)为便于分离纯化，研究人员将纤维素结合结构域（CBD）基因与LacZ 基因融合，构建了新的表达
载体（如图乙）。
注：1．F1、F2、R1、R2 为引物；2．CBD 基因编码的蛋白结构域能可逆地吸附在纤维素材料表面。
①构建新的重组质粒后，为了确定CBD 基因连接到质粒中且插入方向和位置正确需要PCR 后电泳检
测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物是_______。
②经检测，融合蛋白成功表达。请简述利用该融合蛋白的特性，分离获得纯净乳糖酶的基本思路
_______。
(5)若希望将该工程菌用于大规模工业化生产乳糖酶，在完成上述实验室构建和验证后，还需在哪些方
面进行深入研究？（答出2 点即可）______。
27．（2026·四川成都·二模）我国科学家于2026 年1 月首次提出长基因递送治疗性策略AAVLINK，该方
法先将长基因分成Ⅰ、Ⅱ两段，分别装进两个腺相关病毒(AAV)中，一个AAV 携带基因Ⅰ片段和
LoxP 位点，另一个AAV 除携带基因Ⅱ片段、LoxP 位点外，还携带Cre 重组酶基因及调控该基因表达
的Poly(A)。两个装载着长基因片段的AAV 载体进入细胞后，Cre 重组酶会精准识别并切割LoxP 位点，
并再将拆分的两个基因片段实现精准重组(如图甲)。图乙为LoxP 序列的结构示意图。回答下列问题：
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(1)该技术中的Cre 酶，其功能兼有DNA 重组技术中两种常见工具的作用，这两种工具是___________。
Cre 酶切开一个LoxP 的间隔序列后形成的末端形式是___________末端。LoxP 位点具有方向性，推测
其方向性是由图乙中的___________序列决定的。
(2)根据图示信息，按照从左往右的顺序，依次写出图甲中第二步重组完成后问号区域DNA 片段的组
成：___________。重组发生后，Cre 重组酶基因的表达会被迅速关闭，以免破坏已拼接好的长基因。
从AAV 载体的相关结构分析，Cre 重组酶基因表达关闭的原因可能是___________。
(3)Cre-LoxP 是一种广泛应用的基因编辑工具。研究者想要敲除某个目的基因，需要在目的基因两端分
别插入LoxP 位点，如图丙所示，方式1 在目的基因两端插入同向的LoxP 位点，方式2 在目的基因两
端插入反向的LoxP 位点。
其中方式___________(填“1”或“2”)才能实现目的基因的敲除；若选择另一种方式，Cre 酶切割下来
的目的基因能翻转180°再连接回去，原因是___________。
28．（2026·四川成都·二模）雄性不育是指雄蕊发育不正常，但雌蕊正常，水稻（2n=24）的雄蕊是否可育
由细胞核基因和细胞质基因共同决定。袁隆平在1987 年曾指出，杂交水稻的育种可以分为三系法、
二系法和一系法三个战略发展阶段。三系法是通过培育雄性不育系、保持系和恢复系三个纯合品系来
培养杂交水稻，培育过程如图1 所示；二系法利用了水稻细胞核中的光温敏基因，光温敏水稻在特定
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的光周期与温度组合条件下表现为雄性不育，杂交水稻的培育过程如图2 所示。回答下列问题：
(1)水稻基因组计划需测定______条染色体上的DNA 序列。
(2)水稻细胞质中存在正常可育基因（N）和雄性不育基因（S），细胞核中存在可育恢复基因（R）和
非恢复基因（r），且R 对r 显性。三系法中雄性不育系基因型可表示为S（rr），只能作____（“父
本”或“母本”），理论上雄性可育水稻的基因型有____种。为了持续获得雄性不育系水稻，应使用
雄性不育系与保持系进行杂交，保持系的基因型为_____。雄性不育系与恢复系杂交得到的杂交水稻
连续自交两代，F2中雄性不育个体所占的比例为____。
(3)二系法中光温敏水稻在不同条件下育性不同的根本原因是______，这说明生物性状由______调控。
(4)已知水稻细胞核中雄性不育基因ms 对雄性可育基因Ms 为隐性。为简化育种流程，科研人员设计
了含有三大功能基因模块的表达载体，并将其导入隐性核雄性不育水稻中，最终筛选出单一位点插入
T-DNA 的水稻植株作为SPT 保持系，以实现保持系自交即可同时得到不育系和保持系。已知表达载体
的T-DNA 片段如图3 所示，在农杆菌侵染植物细胞时T-DNA 会整体转移到植物细胞的染色体DNA 上。
调查统计发现SPT 保持系花粉中，可育花粉与不育花粉的比例约为1:1，据此推测，基因A 的作用是
______。利用SPT 保持系获得并筛选雄性不育水稻种子的最简单的方案是_____。
29．（2026·四川宜宾·二模）传统的CRISPR/Cas9 系统原理如图1、2 所示，科学家通过突变得到一个没有
核酸酶活性的Cas9 蛋白，使其失去切割DNA 的功能，但与sgRNA 结合等功能不变，这样的Cas9 称
之为dCas9，目前CRISPR/dCas9 系统常用于基因组转录调控。研究者设计了一套CRISPR/dCas9 系统
Y，将其导入某大肠杆菌菌株中，可以实现对多个基因的同步激活与抑制，以提高该菌抗肿瘤化合物
Z 的产量。
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(1)系统Y 中可以含有多种序列不同的sgRNA，sgRNA 依据_________原则与目标序列特异性结合，引
导dCas9 结合到DNA 上。
(2)图2 是sgRNA 构建过程示意图，过程甲对特征序列和重复序列扩增需在不同的PCR 体系中进行，
原因是_________________。最早在经历_________个循环后出现产物A．过程乙可分两个环节，第一
个环节，过程甲的产物A、B 在高温下解旋形成单链，复性后延伸，得到重组DNA 片段，该环节
_________（填“需要”或“不需要”）引物，原因是______。
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(3)研究者检测了系统Y 对基因的激活效果，当sgRNA 靶向结合R 基因的上游区域时，Z 产量提升约
2.9 倍。系统Y 中dCas9 蛋白和转录激活因子P 蛋白相连，sgRNA 可以与dCas9 自动组装到一起。推
测当sgRNA 与R 基因的上游区域结合，P 蛋白可募集_________酶启动R 基因转录，有利于Z 的合成。
(4)研究者检测了系统Y 对基因的抑制效果，设计了能靶向结合F 基因（与细胞分裂相关）不同区域
Q1 和Q2 的sgRNA1、sgRNA2，分别转入不同的大肠杆菌中，细胞数量相对值如图3.
实验表明：____________。
30．（2026·四川内江·二模）全球气候变暖对植物生长发育构成严峻挑战。高温胁迫下，植物细胞中的光
系统Ⅱ（PSⅡ，主要由色素—蛋白复合体组成）对光能的吸收、传递和转化功能受阻，进而影响光合
速率。为培育耐高温的芍药品种，某研究团队以芍药为材料，探究褪黑素（可增强植物的高温抗性）
合成途径中的关键基因PITDC 调控芍药响应高温胁迫的机制。回答下列问题：
(1)PSⅡ位于叶绿体的_____上，其色素主要吸收_____光。
(2)研究人员对PITDC 基因沉默（不表达）及野生型芍药植株进行高温胁迫处理，测得相关指标如图
1。
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注：SOD 为超氧化物歧化酶，可清除活性氧（活性氧会攻击脂质、蛋白质等）；Fv/Fm 反映PSⅡ的光
能转化效率，其数值越大，效率越高；Gs 为气孔导度。
据图推测，高温胁迫下，PITDC 基因沉默植株的光合速率_____（填“低于”、“等于”或“高
于”）野生型植株，理由是_____。
(3)为提高芍药植株中PITDC 基因的表达，研究人员筛选出PITOE3 蛋白。为探究该蛋白能否与PITDC
基因启动子结合，研究人员依据PITDC 基因启动子特异性序列制备了荧光标记的DNA 探针和未标记
的同源探针；同时依据PITDC 基因启动子的突变序列，制备了未标记的突变探针，进行了相关实验，
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结果如图2（仅标记探针可产生可见条带）。
注：“+”表示加入，“-”表示未加入；“10×”、“50×”表示加入量为标记DNA 探针的倍数；“？”处
结果未展示。
①第5 组中加入的物质从上到下依次应为_____（用“+”“-”表示）。
②当第4 组条带1“？”处的结果比第3 组_____（填“更宽”或“更窄”）时，可判断PITOE3 蛋白能
与PITDC 基因启动子特异性结合。
(4)为进一步研究PITOE3 蛋白与PITDC 基因启动子之间的调控关系，研究人员构建了对照组基因表达
载体，结构为
，
则实验组的基因表达载体需在对照组基础上，在CaMV5S 与终止子2 之间添加_____。若实验组的荧
光强度_____（填“高于”、“低于”或“等于”）对照组，表明PITOE3 蛋白能激活PITDC 基因启
动子。
(5)根据上述研究结果，请从基因工程的角度为培育耐高温的芍药品种提出一条可行思路：_____。
31．（2026·四川内江·二模）乙型肝炎病毒（HBV）包膜上存在S 和PreS1 抗原蛋白，HBV 通过PreS1 抗
原蛋白与肝细胞表面受体特异性结合而入侵。病毒入侵肝细胞后产生的cccDNA（共价闭合环状
DNA）可在细胞内长期留存，并持续指导新病毒的合成，这是慢性乙型肝炎难以根治的重要原因。科
研人员研发了一种含PreS1-S 融合基因的DNA 疫苗（结构如图），以期联合药物实现“功能性治愈”。
回答下列问题：
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注：F1、F2、F3 为引物；CMV 启动子是真核细胞的启动子；识别并结合T7 启动子的RNA 聚合酶由
T7 噬菌体基因编码。
(1)人工合成PreS1-S 融合基因时，需先根据_____的氨基酸序列推测脱氧核苷酸序列，再通过化学方法
合成。
(2)构建重组质粒时，为确定PreS1-S 融合基因是否已正确连接到质粒上，应选择图中的一对引物_____
对待测质粒进行PCR 扩增。
(3)构建重组菌时，将正确连接的重组质粒导入大肠杆菌后，需接种在含_____的固体培养基上进行初
步筛选。融合基因不能在重组菌中表达，原因是_____。
(4)为确保DNA 疫苗能在人体细胞内正常表达，在对测序正确的重组菌扩大培养生产疫苗之前，通常
需要在体外检测该基因能否正常表达。此时，需向反应体系中加入能与T7 启动子特异性结合的_____，
以确保转录过程的启动。
(5)对模型动物皮内注射该DNA 疫苗并结合电穿孔处理（增大细胞膜通透性）后，疫苗可进入细胞内
表达出融合抗原。该抗原经加工后呈递在细胞表面，可被B 细胞和T 细胞识别引发_____。与传统仅
含S 抗原的预防型疫苗相比，该DNA 疫苗治疗慢性乙型肝炎的优势是_____。
32．（2026·四川德阳·二模）天然橡胶（NR）是全球重要战略资源，但热带橡胶树供给受限。橡胶草可以
在温带地区生长，其根部能合成NR。但细胞内的蔗糖会同时用于合成NR 和菊粉。基因编辑技术为
NR 的高效供给提供了全新路径：研究人员利用CRISPR/Cas9 技术敲除橡胶草中菊粉合成关键酶基因
Tk1-SST 和Tk1-FFT，使NR 积累量翻倍。
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结合材料及所学知识回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 系统中，负责特异性识别并结合靶基因的向导分子是_________，该向导分子与靶基
因结合区域最多含有_________种核苷酸。
(2)敲除Tk1-SST 和Tk1-FFT 双基因后，橡胶草NR 产量提升的代谢机制为：
敲除Tk1-SST 和
Tk1-FFT 基因
→
______________
→
NR 积累量显
著增加
(3)为验证Tk1-SST 基因敲除效果，科研人员提取橡胶草根部细胞DNA，用位于待敲除区域两侧的引
物进行PCR 扩增，电泳结果如下图所示。已知野生型扩增产物长度为1200bp，敲除成功后产物长度
约为400bp。
据图判断，株系3 最可能为______（填“纯合敲除”“野生型”或“嵌合体”），依据是_________。
若将该株系单独培养几代后，发现400bp 条带逐渐增强而1200bp 条带逐渐减弱，最可能的原因是
_________。
(4)与传统的将外源NR 合成酶基因导入橡胶草基因组的技术相比，利用CRISPR/Cas9 技术敲除内源菊
粉合成基因以增产NR 的优势在于_________（答1 点即可）。
33．（2026·四川成都·二模）植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物
的生长和发育，决定作物的产量和品质。SUT 基因家族中的StSUT2 基因主要在花和老叶中表达，科
学家借助Gateway 克隆技术通过构建StSUT2 植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway 克隆
技术包括TOPO 反应和LR 反应（如图1、图2 所示），ccdB 基因编码毒性蛋白，会导致细胞死亡。
回答下列问题：
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(1)从植物的花或老叶细胞中提取总mRNA，经过______过程获得cDNA，根据______设计引物进行
PCR 扩增，即可获得大量的StSUT2 基因。
(2)利用图1 中的TOPO 反应可以将目的基因PCR 产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被拓扑异
构酶（TOPO）识别并在相应位点断开______，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，并将其
与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的______酶功能相似。为确保
StSUT2 基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2 基因时，可在引物中引入5'-______-3'序列。
(3)图2 中LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和目的载体上的attR 位点，将入门载体中的目的基因
与目的载体中的相应片段实现同源重组，得到含目的基因的目的载体。然后与大肠杆菌混合培养，在
培养基中添加适量______以促进目的基因转化。经上述处理培养后，可判断存活的大肠杆菌中导入的
是含目的基因的目的载体，而不是目的载体，原因是______。
(4)请结合图2 中的LR 反应过程，在图3 的方框中补全含StSUT2 基因的超表达载体的示意图______。
(5)通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2 基因超表达载体的转基因植物细
胞和非转基因植物细胞中的______，从而确定StSUT2 基因是否成功超量表达。
34．（2026·四川泸州·二模）下图1 为某种沉默子调控目的基因表达的示意图。为确定图2 中S 序列是否
具有该种沉默子活性，科学家进行了相关研究。实验所用质粒和可能用到的限制酶如图3 所示。
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请分析回答：
(1)在构建重组质粒时，需使用限制酶和_______酶对图3 中质粒进行处理。为保证S 序列能准确插入
质粒，切割质粒时应选择图3 表中的_______限制酶。
(2)为获得大量的S 序列，需使用_______酶对其进行PCR 扩增。为实现S 序列的精准插入，需要在下
游引物的_______（填“5′端”或“3′端”）添加限制酶识别序列，该序列是5′-_______-3′。
(3)为检验重组质粒是否构建成功，研究人员选取合适的限制酶对重组质粒进行酶切，其产物电泳结果
如图。该结果显示重组质粒的构建_______（填“成功”或“不成功”），依据是_______。
(4)将重组质粒和图3 质粒分别导入小鼠细胞后，在荧光显微镜下进行观察，若_______，则表明S 序
列具有图1 沉默子活性。
35．（2026·四川绵阳·二模）食醋是生活中常用的调味品，其酸度是衡量醋酸菌发酵能力和食醋品质的重
要指标。为获得高产醋酸菌并提高生产效率，研究人员从传统工艺和现代生物技术两个角度开展研究，
回答下列问题：
(1)醋酸菌的新陈代谢类型为______，传统酿醋工艺中，常在发酵初期加入适量陈醋，目的是______。
(2)为探究发酵液中醋酸菌的数量，研究小组采用稀释涂布平板法进行计数，测得的结果通常比实际值
偏_______，原因是______。
(3)巴氏醋酸菌产醋酸能力强，但醋酸积累过多会导致发酵液pH 下降，抑制该菌生长。研究表明，在
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醋酸菌中表达氨基酸解氨酶，能有效缓解pH 的变化。为此，科研小组计划通过基因工程将目的基因
X 导入巴氏醋酸菌，以维持其在产酸过程中pH 的相对稳定。请回答下列问题：
①目的基因的筛选和获取：利用PCR 技术扩增X 基因时，需要在反应体系中添加模板、原料、引物、
_______、缓冲液等。
②构建基因表达载体：为使X 基因正向插入载体，扩增X 基因时应分别在引物1 和引物2 的5'端添加
_______限制酶的识别序列。
③目的基因导入受体细胞：为检测重组质粒是否成功导入巴氏醋酸菌，需要进行筛选，筛选时应在培
养基中添加_______。
36．（2026·四川绵阳·二模）某研究团队利用工程技术对诱导多能干细胞（iPSC）进行基因编辑改造，使
其成为在细胞膜上表达CAR 分子（嵌合了靶细胞的抗原受体的跨膜复合蛋白）的多能干细胞（CAR-
iPSC），进而诱导分化出相应免疫细胞，包括CAR 细胞毒性T 细胞（CAR-T）、CAR 巨噬细胞
（CAR-iMac）、CAR 自然杀伤细胞（CAR-NK），以治疗癌症。其基本流程如下图所示。回答下列
问题。
(1)从供血者采集到的PBMC______（填“需要”或“不需要”）用胰蛋白酶分散成单细胞。细胞扩增
培养过程中需要传代培养，原因是______（答出2 点即可）。
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(2)PBMC 需经①重编程导入特定基因（OCT4，SOX2，KLF4 等），强制改变其基因表达模式，使其
回到类似______的多能状态（iPSC），再经②导入CAR 基因并成功表达，成为具有______功能的
CAR-iPSC。
(3)绝大多数B 细胞恶性肿瘤的标志物之一是CD19（一种膜蛋白）。将CAR 分子中嵌入______的
CAR-iPSC 诱导分化成CAR-T，经扩增后回输病人（自体CAR-T 治疗），可以显著增强______（免疫
类型），清除该类肿瘤细胞。
(4)用健康捐献者的细胞批量制备CAR-T 细胞，进行异体CAR-T 治疗时，因T 细胞表面的受体
（TCR）会识别异己细胞并进行攻击，因此需要预防______（选填编号：①移植物抗宿主病
（GVHD）②宿主抗移植物病（HvGR）），预防的解决方案是______。
37．（2026·四川绵阳·二模）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应
用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。
回答下列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是_______。
(2)生物兴趣小组利用PCR 技术获得足够多的cg（CG 编码基因），欲利用基因工程构建携带cg 的大
肠杆菌表达载体工程菌。
①在PCR 扩增cg 操作时，设置了一组除cg 模板外其他成分均满足的反应体系，其作用是_______。
②基因工程的核心工作是________。
③兴趣小组构建大肠杆菌表达载体过程中，对cg 的PCR 扩增产物和质粒进行双酶切，随后用
E.coliDNA 连接酶连接（E.coliDNA 连接酶连接具有平末端的DNA 片段的效率非常低）。为保证连接
准确性和效率，在cg 转录模板链的5＇端最好含有__________酶切位点（如图）。作为符合条件的基
因表达载体，还应具有的组件_______。
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是________，随后在
含_______的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
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38．（2025·四川德阳·二模）为了培育既抗除草剂（草甘膦），又抗冻的烟草植株，科学家将抗草甘膦基
因（Aro 基因，存在EcoRI 酶切位点）和抗冻基因（Cor 基因，存在Bell 酶切位点）采用融合PCR 技
术（原理如下图所示）连接起来构建为Aro-Cor 融合基因并进行了扩增，再将融合基因导入烟草细胞
培育既抗除草剂又抗冻的转基因烟草，过程如下。请分析回答：
(1)在将Aro 基因和Cor 基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2 和引物3 的碱基序列______（填
“相同”或“不相同”），变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需
要添加引物，其原因是______。为保证构建的Aro-Cor 融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物
1 和引物4 侧连接______的限制酶识别序列。
(2)上述培育转基因烟草过程中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是______，将农杆菌和烟草细胞按
比例充分混匀，3 天后转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因
是______。
(3)植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的______的微量有机物。在培育
转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分
析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的______来观察其对细胞发育的影响。
39．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的
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主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是______。
(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是______。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚
胎体内，应选用______限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其______。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应
选用桑葚胚的原因是______。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是______。
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