文档文本内容
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
专题05 基因工程
北京卷对于基因工程部分的考查主要集中在综合题中的最难题部分内容，考查的难度最高，得分
率较低，综合性较高。近几年的高考题和模拟题中，对于基因工程这部分的考查比较频繁，考生
在本专题的普遍得分率较低，大家在复习的时候需要多做典型题目，进行综合训练。今后高考的
命题趋势：
1.基因工程基本原理的理解：通过对近几年北京高考生物卷上基因工程大题的分析，可以看出试题旨在
引导学生理解基因工程的原理和技术，这些是高中生物教学的重要组成部分，同时也是当前生命科学研究
的热点和前沿。这些内容的考查有助于提升学生的生物学学科核心素养。
2.生命科学的前沿进展：基因工程题目通常基于学科发展的前沿内容，这些内容往往是生物工程试题命
题情境的重要来源。新高考改革后，这一部分内容作为科学前沿，更频繁地出现在高中各级考试试卷中，
这也反映了命题人对于科学前沿的重视和对学生能力提升的期望。
1、（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E 物质）污染会导
致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞
等存在E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且
快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。
(2)为监测E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE 和酵母来源的UAS 是
两种诱导型启动子，分别被E 物质-受体复合物和酵母来源的Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1 相比，方案2 的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。
1
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，
需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将
选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子： 。
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P 生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P 肌）
Ⅱ.基因：
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
(4)SM 不育的原因是：成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM 不育的目的是 。
【答案】(1)显微注射
(2)监测灵敏度更高
(3) ② D
(4)激活ERE 诱导Gal4 表达，Gal4 结合UAS 诱导dg 表达，生殖细胞凋亡
(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞
的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵
的最佳方式是显微注射法。
（2）由图可知，方案1E 物质-受体复合物激活ERE，使GFP 基因表达，方案2 E 物质-受体复合物先激活
2
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
ERE 获得Gal4 蛋白，然后Gal4 蛋白激活UAS 启动子，使GFP 基因表达，方案2GFP 蛋白表达量大，更灵
敏。
（3）MO 和另一亲本（X）杂交获得SM，MO 是方案2 获得，所以亲本X 启动子选择UAS。要获得SM
是不育个体，MO 是可育的所以X 必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。
（4）成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE 诱导Gal4 表达，Gal4 与UAS 启动
子结合诱导dg 表达，使生殖细胞凋亡。
（5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要
SM 不育。
2、（2020·北京·高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草
芽孢杆菌菌株（B 菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体
（HT 质粒）连接，再导入B 菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
（1）纤维素属于 糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是 。
（2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出
的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。
（3）C1酶基因以B 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确
的方向与已被酶切的HT 质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I 和BamH I 的酶切位点。该基
因内部没有这两种酶切位点。图1 中酶切位点1 和2 所对应的酶分别是 。
（4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1 不进行处理，对照组2 进行相应
处理。在相同条件下培养96 小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能
力最强。对照组2 的处理应为 。
（5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用 。（举一例）
【答案】 多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸
3
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种纤维素酶（C1 酶） 降解秸秆，减少秸秆燃烧带
来的空气污染
【分析】基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能
驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质；
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA 片段，位于基因的尾端；
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
图2 中对照组2 也可以将纤维素进行分解，但其分解能力较弱。
【详解】（1）纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。
（2）由于密码子具有简并性，所以即使克隆到的C1 酶基因测序，与数据库中的C1 酶基因编码序列相比
有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。
（3）根据题干信息“以B 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5'→3'”，所以B 链的方向是
从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B 链3'应该用BamH I 进行切割，而其5'端应该用SmaI 进行切
割。
（4）本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1 不作处理，组3 是添加工程菌，组
2 的处理是用直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶（C1 酶）。
（5）该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。
【点睛】本题以基因工程为核心，考查表达载体的构建、工程菌的实验的知识，难点是分析基因表达时
DNA 的方向，mRNA 与DNA 的模板链互补；（4）中结合实验目的找到自变量。
为了更好地准备这一部分的考试内容，考生需要掌握基础知识，系统复习基因工程的基本原理和技术，
确保对相关概念有深入理解。分析历年真题，研究历年考题，了解出题规律和考查重点，进行有针对性的
训练。提升实验设计能力，熟悉实验流程和数据分析方法。了解基因工程的最新进展，培养科学思维和创
新意识提高跨学科知识整合能力，解决实际问题时能够综合运用所学知识。
1．葡萄糖二酸（GA）可作为原料应用于食品、能源和医药等领域，科研人员通过改造工程菌以实现GA
的大量生产。
(1)M 酶和U 酶是GA 合成途径中的两个关键酶，科研人员将图1 所示质粒1 导入 处理的大
4
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
肠杆菌，改造后的大肠杆菌可合成GA．
(2)为实现对工程菌合成GA 的实时监测，科研人员设计了质粒2.并进行下表所示两种检测方案。
方
案
一
质粒1 和2 共同导入大
肠杆菌菌株E 中
在液体培养基
中培养一段时
间
菌液分为5 组
每组上清液加入适量
GA，检测荧光强度。
方
案
二
质粒1 和2 分别导入大
肠杆菌菌株E 和菌株S
中
将E 菌液与S 菌液混合，混合
菌液培养一段时间后分为5 组
①据图1 分析检测方案的原理为 。
②检测结果如图2，据图对比两种方案，并结合两种质粒适用范围，选择其中一种更优方案并说明理由：
。
(3)进一步发现由于产物GA 呈酸性影响了大肠杆菌合成GA 的能力，因而科研人员尝试以酵母菌为受体细
胞导入质粒1，改造后的酵母菌以葡萄糖为原料合成并分泌GA 的途径如图3.但M 酶的活性远小于U 酶，
限制了GA 产量。为改进M 酶的催化效率，将含不同突变的M 酶基因分别导入酵母菌，利用上述所选方案
菌株监测不同酵母菌的GA 产量，操作为 ，取等量培养液，测定其荧光值和吸光度（反应菌体浑
5
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
浊程度），挑选 高的菌株即为GA 高产菌株。
(4)据图3 分析还可以通过 等方法改造酵母菌以提高GA 的产量。
【答案】(1)Ca2+
(2) 菌株E 可产生 GA，GA 与C 蛋白结合激活 GFP 基因转录，通过荧光强度反映 GA 含量 方
案二更优。理由:与方案一相比，方案二单位菌体密度的荧光强度更高，检测 GA 更灵敏，且还可检测真
核生物合成GA 的量 荧光值与吸光度比值
(3) 将不同酵母菌培养液上清分别与A 菌液混合并培养 荧光值与吸光度比值
(4)提高I 酶和N 酶的表达量(合理即可)
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）为了增大细胞膜的通透性，通常用CaCl2 处理大肠杆菌，以增大转化的成功率。
（2）①结合图1 可知，菌株E 可产生 GA，GA 与C 蛋白结合激活 GFP 基因转录，通过荧光强度反映
GA 含量，因此不管是方案1 将质粒1 和2 共同导入大肠杆菌菌株E 中，还是方案2 将质粒1 和2 分别导入
大肠杆菌菌株E 和菌株S 中，都可以通过荧光强度反映 GA 含量。
②与方案一相比，方案二单位菌体密度的荧光强度更高，检测 GA 更灵敏，且还可检测真核生物合成GA
的量 荧光值与吸光度比值，因此方案二更优。
（3）参考方案2，应将不同酵母菌培养液上清分别与A 菌液混合并培养，取等量培养液，测定其荧光值和
吸光度；挑选荧光值（反映GA 的合成）与吸光度（反映菌体密度）比值高的菌株即为GA 高产菌株。
（4）结合图3 可知，I 酶可促进葡萄糖-6-P 转化为肌醇-3-P，M 酶可促进肌醇转化为葡萄糖醛酸，因此提
高I 酶和N 酶的表达量可以提高GA 的产量。
6
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
2．种子成熟过程受脱落酸（ABA）等植物激素调控。为研究种子成熟的调控机制，研究者以拟南芥为材
料进行了实验。
(1)ABA 是对植物生长发育起 作用的微量有机物，在种子成熟过程中起重要作用。
(2)研究发现，种子成熟阶段S 蛋白和J 蛋白均有表达。研究者检测了不同拟南芥种子的成熟程度，结果如
图1.根据图分析，S 蛋白和J 蛋白对种子成熟的调控作用分别是 。
(3)S 蛋白可与J 蛋白结合。为探究两蛋白在植物体中的作用关系，研究者在纯化的J 蛋白溶液中分别加入
野生型及S 蛋白缺失突变体的种子细胞裂解液，使用药剂M 进行相关处理，检测结果如图2.结果说明：S
蛋白可使J 蛋白 。
(4)检测发现，S 蛋白缺失突变体比野生型体内的ABA 含量低。编码S 蛋白基因的启动子区有转录调控因子
T 的结合序列，T 可被ABA 激活。J 蛋白也为一种转录调控因子。为研究T、J 蛋白对S 蛋白基因表达的调
控，研究者构建了图3 所示质粒并转化烟草叶肉原生质体，实验结果如图4.
7
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
图4 结果说明： 。
(5)种子成熟对于种子提高萌发活力等具有重要作用。综合上述研究，分析ABA 对种子成熟的调控机制
。
【答案】(1)调节
(2)促进、抑制
(3)降解
(4)T 蛋白与S 蛋白基因的启动子结合，促进S 基因的表达，而J 基因抑制T 蛋白与S 蛋白基因启动子的结
合
(5)ABA 激活T 蛋白，T 蛋白促进S 蛋白合成，S 蛋白可使抑制种子成熟的J 蛋白降解，从而促进种子成熟
【分析】1、植物的生长发育过程，在根本上是基因组在一定时间和空间上程序性表达的结果。光照、温
度等环境因子的变化，会引起植物体内产生包括植物激素合成在内的多种变化，进而对基因组的表达进行
调节。2、脱落酸的作用：抑制细胞分裂，抑制植物的生长，也能抑制种子的萌发；促进叶和果实的衰老
和脱落。
【详解】（1）ABA 是植物激素，在植物生长发育过程中起调节作用。
（2）S 蛋白缺失，种子成熟程度低，因此S 蛋白促进种子成熟，而J 蛋白过表达植株种子成熟度低，因此
J 蛋白抑制种子成熟。
（3）药剂M 抑制蛋白质的降解，结合图示可知，S 蛋白缺失的裂解液与J 蛋白融合，J 蛋白的含量多于与
野生型的融合，说明J 蛋白会被S 蛋白降解。
（4）质粒1+2 组作为对照，与1+2 组相比，1+3 组中T 基因表达T 蛋白，使得LUC/REN 荧光强度比值明
显增大，且REN、LUC 不受T 蛋白的影响，说明T 蛋白能与S 蛋白基因启动子结合，从而使得LUC 增多，
而1+4 组与1+3+4 组均与1+2 组相同，说明第四组表达的J 蛋白会抑制T 蛋白与S 蛋白基因启动子的结合，
抑制LUC 的合成。
8
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
（5）ABA 激活T 蛋白，T 蛋白可与S 蛋白的启动部位结合，启动S 基因的表达，S 蛋白增多，S 蛋白可使
J 蛋白降解，而J 蛋白抑制种子成熟，因此S 蛋白可促进种子成熟，即ABA 促进种子成熟。
3．乳酸是一种需求量较大的工业原料，科研人员欲对酿酒酵母进行改造以进行乳酸生产。
(1)培养基中的葡萄糖可作为 为酿酒酵母提供营养。如图1，酿酒酵母导入乳酸脱氢酶基因后，
无氧条件下发酵产物为 ，通过敲除丙酮酸脱羧酶基因获取高产乳酸的工程菌。该菌在有氧和无氧
条件下均可产乳酸。
(2)为实现对菌体代谢的动态调控，研究人员设计了光感应系统，并导入绿色荧光蛋白（GFP）基因以检测
光感应系统的调控能力。
①如图2，系统1 在酵母中表达由V、L 和H 组成的融合蛋白。光照下，融合蛋白空间结构改变，
后启动下游基因表达；在黑暗状态下，融合蛋白自发恢复到失活状态。
②分别检测黑暗和光照下系统1 的荧光强度，结果如图3。对照组能持续激活GFP 表达。实验结果显示
，可知系统1 实现了光调控基因表达，但表达量较低。推测可能由于菌体密度高导致透光性差，不利于V-
L-H 对光照的响应。进一步优化设计出系统2（如图2），同等光照强度下，系统2 荧光强度显著高于系统
1，分析原因是 。
9
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
③实验中发现黑暗条件下系统2 的GFP 基因有明显表达，为解决此问题，对系统2 增加如图4 所示组分，
i、ii、ii 依次为 （填字母序号）。
A．持续表达型启动子
B．Pc120
C．PGAL
D．G80 基因（G80 蛋白可结合并抑制GAL4）
E．GAL4 基因（GAL4 蛋白可结合并激活PGAL）
F．PSD 基因（含有PSD 的融合蛋白在光下降解）
(3)将优化后的系统2 中GFP 基因替换为乳酸脱氢酶基因，应用于酵母菌合成乳酸的发酵生产。发现在“先
黑暗-后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式，请推测“先黑暗-后光照”模式下乳酸产量高
的原因 。
【答案】(1) 碳源 乳酸、乙醇
(2) ①结合启动子PC120 系统1 在黑暗中荧光强度极低，光照后荧光强度升高但显著低于对照组
系统2 中光直接调节GAL4 的表达，GAL4 进一步调控GFP 表达，分级调节具有放大效应 ADF（或
AFD）
(3)发酵早期处于黑暗中，酵母菌不合成乳酸，物质和能量主要用于菌体生长繁殖，当菌体达到一定数量后，
照光启动乳酸合成，因此乳酸总产量高。全程光照时，持续合成乳酸，消耗物质和能量较多，影响酵母菌
10
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
生长繁殖，乳酸总产量低。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目
的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）培养基中的葡萄糖可作为碳源为酿酒酵母提供营养；由图1 可知，酿酒酵母导入乳酸脱氢酶
基因后表达出乳酸脱氢酶，在无氧条件下将丙酮酸转化为乳酸，同时丙酮酸在丙酮酸脱羧酶催化作用下转
化为乙醛，进而转化为乙醇，所以酿酒酵母无氧条件下发酵产物为乳酸、乙醇；
（2）①由图2 可以看出，光照下融合蛋白空间结构改变，融合蛋白与PC120 启动子结合后启动下游基因
表达；
②由图3 可以看出，系统1 在黑暗中荧光强度极低，光照后荧光强度升高但显著低于对照组，可知系统1
实现了光调控基因表达，但表达量较低；由图2 可知系统2 在同等光照强度下，系统2 中光直接调节
GAL4 的表达，GAL4 进一步调控GFP 表达，分级调节具有放大效应，所以系统2 荧光强度显著高于系统
1；
③实验中发现黑暗条件下系统2 的GFP 基因有明显表达，为解决此问题，对系统2 增加如图4 所示组分，
i、ii、ii 依次为持续表达型启动子、G80 基因（G80 蛋白可结合并抑制GAL4）、PSD 基因（含有PSD 的融
合蛋白在光下降解）或持续表达型启动子、PSD 基因（含有PSD 的融合蛋白在光下降解）、G80 基因
（G80 蛋白可结合并抑制GAL4），即选ADF 或AFD；
（3）在“先黑暗-后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式，可能的原因是发酵早期处于黑暗
中，酵母菌不合成乳酸，物质和能量主要用于菌体生长繁殖，当菌体达到一定数量后，照光启动乳酸合成，
因此乳酸总产量高。全程光照时，持续合成乳酸，消耗物质和能量较多，影响酵母菌生长繁殖，乳酸总产
量低。
4．科研人员获得了携带两种抗稻瘟病的抗性基因Pib 和Pikm 的水稻品系——川抗30，以及携带螟虫抗性
11
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
基因CrylC 的水稻品系——昌恢。为获得同时携带抗螟虫基因和两种抗稻瘟病基因的改良株系，开展了相
关研究。
(1)水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对 。利用川抗30 品系与野生型稻瘟病敏感水稻杂交，F1表现为稻
瘟病抗性，F1与野生型杂交，子代性状及分离比为 ，证明Pib 和Pikm 位于非同源染色体上。
(2)吕恢品系水稻在品质和产量上明显优于川抗30，科研人员结合分子标记技术筛选目标基因进行杂交育种，
以获得改良优质水稻。请写出制备优质、高产的纯合双抗（抗螟虫和抗稻瘟病）水稻的杂交育种技术路线
（总体思路） 。
(3)研究者利用PCR 技术检测改良优质水稻中是否含有Pib 基因。
①下表为利用PCR 进行检测的反应体系的配方，请将表格补充完整。
PCR 反应体系
组分
总体积/10μL
10 倍浓缩的扩增缓冲液
1μL
i
1.5μL
4 种脱氧核苷酸等量混合液（2.5mmol·L-1）
0.5μL
引物I/II（5.0μmol·L-1）
1/1μL
Taq DNA 聚合酶
0．20μL
H2O
ii
②图为Pib 基因的部分序列。
5'—…AATGCCC…ATGTGGA…—3'
3'—…TTACGGG…TACACCT…—5'
根据图，选择 作为引物对Pib 基因进行扩增。
A．5'—…AATGCCC…—3' B．5'—…TCCACAT…—3'
C．5'—…TTACGGG…—3' D．5'—…ATGTGGA…—3'
研究者最终确定改良优质水稻具备了相关抗性基因，成功培育出优质、高产的双抗水稻。
(4)检测发现本研究获得的优质双抗水稻的部分性状与昌恢品系相比出现株高上升、千粒重下降的现象，但
是利用基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系，其他性状未发生改变，原因可能是 。请从育种
的角度对这两种技术进行评价。
【答案】(1) 相对性状 稻瘟病抗性：敏感=3：1
(2)川抗30 与昌恢杂交获得F1，F1 与昌恢回交获得F2，利用分子标记技术筛选含有Pib 和Pikm2 基因的植
12
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
株继续回交昌恢，重复筛选和回交步骤，将Fn 所得植株自交，筛选Pib 和Pikm2 纯合的植株。
(3) 改良优质水稻的DNA 4.8μL A 和B
(4)与稻瘟病抗性基因在同一条染色体上的基因也被保留下来
杂交育种技术简单，但育种周期长；基因编辑技术育种周期短，可定向改变生物的性状，但是技术难度高，
存在“脱靶”等潜在风险
【分析】基因工程的基本操作程序：
第一步：目的基因的获取；
第二步：基因表达载体的构建（核心）
1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2、常用的转化
方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术，方法的受体细胞多是受精卵。
第四步：目的基因的检测和表达将目的基因导入细菌：感受态细胞法：用Ca2+处理细胞使其成为感受态细
胞，再将重组表达载体DNA 分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收
DNA 分子，完成转化过程。1、首先要检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因。2、其次还
要检测目的基因是否转录出mRNA。3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂
交技术。
【详解】（1）水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对相对性状，同一性状的不同表现形式。假设两种抗性基因
Pib 和Pikm，分别用A，a 和B、b 表示，位于非同源染色体上，符合自由组合定律。利用川抗30 品系与野
生型稻瘟病敏感水稻杂交，F1 表现为稻瘟病抗性，说明抗性基因是由显性基因控制A、B 控制的，F1 的基
因型为AaBb，与野生型的基因型为aabb 杂交，后代的基因型为AaBb，aaBb，Aabb，aabb，性状及分离
比为稻瘟病抗性：敏感=3：1。
（2）制备优质、高产的纯合双抗（抗螟虫和抗稻瘟病），杂交育种的总体思路为：川抗30 与昌恢杂交获
得F1，F1 与昌恢回交获得F2，利用分子标记技术筛选含有Pib 和Pikm2 基因的植株继续回交昌恢，重复
筛选和回交步骤，将Fn 所得植株自交，筛选Pib 和Pikm2 纯合的植株。
（3）①PCR 进行检测的反应体系的配方缺少目的基因，因此i 改良优质水稻的DNA，反应体系总体积
10μL-1-1.5-0.5-1-1-0.2=4.8μL，因此水ii 为4.84.8μL。
②根据已知Pib 基因的部分序列以及双链DNA 分子的结构特点（反向平行），再结合DNA 复制（PCR
13
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
中）的特点，即子链合成的方向是从5′到3′，应选择引A 和B 物进行PCR 扩增，故选A 和B。
（4）基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系与稻瘟病抗性基因在同一条染色体上的基因也被保留下
来,因此其他性状未发生改变。杂交育种和基因编辑技术育种都有优缺点，杂交育种技术简单，但育种周期
长；基因编辑技术育种周期短，可定向改变生物的性状，但是技术难度高，存在“脱靶”等潜在风险。
5．人在衰老过程中某些性状会发生改变，为寻找衰老的原因，科研人员对染色质开展了相关研究。
(1)由图1 可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域 ，某些DNA 。
(2)DNA 甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散会 （促进/抑
制）基因表达。
(3)科研人员推测：核内DNA 断裂后的修复会导致表观遗传信息紊乱或丢失，加速细胞衰老。为验证该推
测，科研人员基于图2 原理，利用以下实验材料构建ICE 模型鼠。
14
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
①Cre 酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于DNA 上的Lx 序列，导致两个Lx 间的DNA
片段丢失；
②I-E 核酸酶基因：编码的I-E 核酸酶位于细胞核，与诱导剂T、Cre 酶形成复合物，切割DNA；
③口服诱导剂T：小分子化合物，可诱导Cre 酶进细胞核。
请完善技术路线 ：
(4)染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE 小鼠的检测，发现已修复的DNA 未发生碱基序
列的改变。通过检测 ，可知获得的ICE 鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结构，可知细胞衰老。
【答案】(1) 松散 低甲基化
(2)促进
(3)口服诱导剂T
(4)（细胞核发出的）绿色荧光
15
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【分析】分析图1，年轻状态时，DNA 甲基化，染色质紧密，衰老状态时，DNA 低甲基化，染色质松散，
有利于基因表达。
【详解】（1）由图1 可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域松散，某些DNA 低甲基化。
（2）DNA 甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散，有利于DNA
解旋并进行转录，会促进基因表达。
（3）根据题图可知，无诱导剂T 时，Cre 酶会被降解，有诱导剂T 时，Cre 酶进入细胞核后作用于DNA 上
的Lx 序列，导致两个Lx 间的DNA 片段丢失，I-E 核酸酶基因会成功表达，并与ICE 识别序列结合导致
DNA 双链断裂。技术路线如下：先分别构建含有基因①Cre 酶基因和基因②I-E 核酸酶基因的小鼠1 和小
鼠2，利用两鼠杂交，筛选目标鼠后，口服诱导剂T，诱导Cre 酶进细胞核，然后在显微镜下观察细胞核是
否出现绿色荧光，有绿色荧光的即为ICE 鼠。
（4）染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE 小鼠的检测，发现已修复的DNA 未发生碱基
序列的改变。通过检测细胞核发出的绿色荧光，可知获得的ICE 鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结
构，可知细胞衰老。
6．东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。
(1)研究发现，东方果蝇中dsx 基因 出的前体RNA 在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用
这一特性研发雌性特异性致死基因系统。
(2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1 所示的融合基因1，进而得到
转基因果蝇。
①根据图1，扩增dsx 内含子应选择的引物是 （选填字母）。
② 由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx 基因前体RNA 保留或剪切内含子和剪切识别序列
情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA 为
（填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 。
16
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)研究发现，RTA 蛋白第212 位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃
时，可抑制RTA 蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。
① 欲得到具有cs 效应的RTAcs 蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2 所
示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的5’端和3’端 。
② 对转入融合基因2 的果蝇进行以下操作：
ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）。
ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比
例，若 ，则说明G1具有cs 效应。
ⅳ：在 ℃继续培养具有cs 效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。
【答案】(1)转录
(2) ad C 在雄性个体中，融合基因1 的成熟mRNA 含有dsx 内含子的对应序列，无法表达完
整的RTA 蛋白，不会导致细胞死亡
(3)
18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生
17
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA 分子水平上
进行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录
终止的位置；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）转录是以DNA 的一条链为模板合成RNA 的过程，东方果蝇中dsx 基因（DNA）通过转录
形成前体RNA。
（2）①用于PCR 扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游
和下游，根据图1，扩增dsx 内含子应选择的引物是ad。
②RTA 基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的
原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA 基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇
中的成熟mRNA 为C。而在雄性个体中，融合基因1 的成熟mRNA 含有dsx 内含子的对应序列，无法表达
完整的RTA 蛋白，不会导致细胞死亡，因此雄性个体不会致死。
（3）①图2 虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的
DNA 聚合酶能够从两条链的3’端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下：
。
②由题意可知：RTA 蛋白第212 位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为
18℃时，可抑制RTA 蛋白对细胞的致死作用。
对转入融合基因2 的果蝇进行以下操作：
ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）（全为转基因雄性果蝇）。
18
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
ⅱ：G0 与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比
例，若G1 具有cs 效应，则18℃组雄性个体所占比例小于29℃组。
ⅳ：在18℃时可抑制RTA 蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培
养具有cs 效应的G1 果蝇。
7．肠道菌群分泌的胆盐水解酶（BSH）与高脂血症密切相关，研究表明高脂饮食后小肠BSH 活性上升，
提高血液中胆汁含量，达到降低血脂的目的。科研人员利用基因工程技术，对小鼠肠道内相关菌株（B
菌）进行改造，以期获得分泌更多BSH 的工程菌BS 菌。
(1)高脂饮食是引起高血脂症的一个主要原因，但脂质也是人体必要的物质，请写出属于脂质的2 种化学物
质 。
(2)工程菌的制备：
①X 菌的筛选：16SrRNA 基因是鉴定微生物的重要依据，其大小约为1500bp，高产BSH 的X 菌株的
16SrRNA 基因有限制酶ApaI 的两个酶切位点，其他菌株中只有一个。通过PCR→ → →观察，
结果如图1，可知 （填图1 中序号）为所选目的菌种。
②表达载体的构建：
科研人员操作如图2，进行同源重组构建表达载体。
19
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
I.将NC 质粒用相关的限制酶进行酶切。
Ⅱ.在X 菌株BSH 基因两侧分别添加一段与上述载体同源（碱基排列次序相同）的序列A、B。
Ⅲ.表达载体同源重组过程如图2 所示。如果BSH 基因N 链B 端同源臂的碱基序列为-A-A-A-G-，则NC 质
粒M’链的碱基序列为 ，两者在5’-3’外切酶的作用下被降解，在DNA 连接酶的作用下，在1、2 处
形成 键，完成基因表达载体的构建。
③科研人员将表达载体用电击法导入B 菌，获得BS 菌株。
(3)关于图2 所示同源重组构建表达载体的方法，其优点有________
A．免去传统方法双酶切的繁杂操作
B．同源重组，保证目的片段插入载体时方向正确
C．如果载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部，该技术可克服传统方法的局
限性
(4)用BS 菌株给小鼠灌胃，同时给小鼠饲喂高脂饮食，对照组1 不做处理，8 周后检测小鼠肠道内容物，进
行体外BSH 活性检测，如图3 所示，结果说明 。
(5)有人认为BS 菌株适合开发为人体降脂的功能性菌剂，请辩证地评价该观点 。
20
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【答案】(1)脂肪、磷脂（胆固醇、性激素）
(2) 酶切 电泳 1/5/10/12 -T-T-T-C- 磷酸二酯
(3)ABC
(4)成功获得分泌更多BSH 的工程菌BS
(5)为人体降脂治疗肥胖提供了一条重要的思路；可能破坏肠道菌群多样性和稳态，缺乏对人体健康的安全
性评估
【分析】利用同源重组构建表达载体的方法优点有：①可以免去传统方法双酶切的繁杂操作，②保证目的
片段插入载体时方向正确，③当载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部时，可克
服传统方法中会破坏目的基因的局限性。
【详解】（1）脂质包括脂肪、磷脂和固醇，其中固醇可分为胆固醇、性激素和维生素D 三种。
（2）①DNA 电泳的基本步骤为PCR 扩增基因、酶切处理适当大小的DNA 片段、电泳分离、观察；根据
题目信息可知，高产BSH 的X 菌株的16SrRNA 基因有限制酶ApaI 的两个酶切位点，16SrRNA 基因经限
制酶ApaI 处理后可获得三种长度的DNA 片段，普通菌株中的16SrRNA 基因上只有一个该酶的切割位点，
经该酶处理后可获得两种长度的DNA 片段，观察图1 发现，2、3、4、6、7、8、9 组中电泳出1000 和500
两种DNA 片段长度，1、5、10 和12 组中电泳出750、500、250 三种DNA 片段长度，11 组电泳结果不明
显，由此可知1、5、10 和12 组为所选目的菌种；
②Ⅲ.据图2 可知，目的基因M 链的3'端与NC 质粒N'链的3'端在第二步时可以通过碱基互补配对将两个黏
性末端拼接在一起，因此如果BSH 基因N 链B 端同源臂的碱基序列为-A-A-A-G-，则NC 质粒M’链的碱基
序列为-T-T-T-C-；在DNA 连接酶的作用下，在1、2 处形成磷酸二酯键，将DNA 链连在一起，完成基因表
达载体的构建。
（3）利用同源重组构建表达载体的方法优点有：①可以免去传统方法双酶切的繁杂操作，②保证目的片
段插入载体时方向正确，③当载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部时，可克服
21
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
传统方法中会破坏目的基因的局限性。
故选ABC。
（4）分析图3 可得，BS 菌灌胃组的胆汁含量明显高于对照组，结合题干信息“肠道菌群分泌BSH，高脂
饮食后小肠BSH 活性上升，提高血液中胆汁含量”可知，该结果说明成功获得分泌更多BSH 的工程菌BS
菌。
（5）根据题干信息“肠道菌群分泌的胆盐水解酶（BSH）与高脂血症密切相关，研究表明高脂饮食后小
肠BSH 活性上升，提高血液中胆汁含量，达到降低血脂的目的”可知，BS 菌株有利于人体降脂，为人体
降脂治疗肥胖提供了一条重要的思路，但作为新开发菌株，还缺少实验数据来确保该菌株的安全性，贸然
摄入可能破坏肠道菌群多样性和稳态，缺乏对人体健康的安全性评估。
8．温度是影响微生物生长的重要因素， 科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。
(1)大肠杆菌是一种常见的微生物， 常被改造为基因工程菌， 其原因包括 （写出2 点）。
(2)为实现温度控制蛋白质合成， 科研人员设计了方案1， 构建表达载体（见图1）， 将其导入大肠杆菌，
获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖， 当培养温度为30°C 时，C 基因编码的C
蛋白形成二聚体， ， 因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。
(3)为更精准调控荧光蛋白表达， 将上述表达载体改造为方案 2 中的载体（见图2）。与方案1 相比， 方
案2 的主要优势是 。
(4)为检测方案2， 科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上， 形成单菌落，培养温度周期
控制见图3.依据方案2， 每个菌落生长2 天后可出现4 个不同的荧光环带，请预测图4 所示菌落每个环带
22
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
的工程菌中荧光蛋白表达情况， 在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色 。
菌落环带
1
2
3
4
所表达荧光蛋白的颜
色
绿、红、绿
(5)聚羟基脂肪酸酯（PHA） 常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA 是一种生物大分子，可由单体分子
3HB 和4HB 随机聚合， 或通过分段聚合形成嵌段共聚物（见图5）， 其中嵌段共聚物性能更优。共聚
物的合成过程如图5.请完善以下表格， 通过改造方案 2 以实现应用工程菌大规模生产优质 PHA（不考
虑各种酶在不同温度下的活性差异）。
操作
目的
对方案 2 表达载体的改造为： 。
将构建好的表达载体导入大肠杆菌， 获得工程菌。
获得可以合成PHA 的工程菌。
以葡萄糖为原料配置培养基， 灭菌后加入上述工程
菌。
配制培养基、接种。
控制发酵条件： 。
发酵48 小时， 获得3HB 比例为25%的嵌段共聚
物。
【答案】(1)遗传背景清晰、转基因操作简单、繁殖速度快、易于培养等
23
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(2) 抑制启动子R，F 蛋白不表达，解除F 蛋白对启动子N 的抑制 绿色
(3)30℃条件下减弱红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且降低对绿色荧光蛋白表达的抑制
(4)
菌落环带
1
2
3
4
所表达荧光蛋白的颜
色
红、绿、红、绿
红、绿
绿
(5) 将GFP 基因替换为A、B 酶基因，RFP 基因替换为D、E 酶基因，加入持续表达启动子连接的X
酶基因 30℃发酵12 小时，随后切换至37℃发酵36 小时
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR
技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、
启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）大肠杆菌是一种常见菌种，其结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调
控机制有了清楚的了解；大肠杆菌质粒又是最常用的质粒，基因克隆表达系统成熟完善，转基因操作简单；
大肠杆菌繁殖速度快，易于大规模培养等。
（2）据图1 分析可知，当培养温度为30°C 时，C 基因编码的C 蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F 基
因无法表达出F 蛋白，进而解除F 蛋白对启动子N 的抑制，使其发生转录促进GFP 基因编码绿色荧光蛋白。
（3）据图2 分析可知，在N 启动子之后增加了L 蛋白基因，使其编码出L 蛋白，进一步抑制启动子R，因
此在30℃条件下，RFP 基因无法表达出红色荧光蛋白，减弱因红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且进一
步抑制启动子R，使F 基因无法表达出F 蛋白，解除F 蛋白对启动子N 的抑制，使其发生转录促进GFP 基
因编码绿色荧光蛋白，降低对绿色荧光蛋白表达的抑制。
（4）据图分析可知，将工程菌稀释涂布在固体培养基上， 形成单菌落，培养温度周期控制为37℃培养10
小时，随后切换至30℃发酵14 小时， 每个菌落生长2 天后可出现4 个不同的荧光环带。培养温度为37℃
时，C 基因编码的C 蛋白没有形成二聚体，启动子R 正常启动转录，F 基因表达出F 蛋白对启动子N 的抑
制，使L 蛋白基因、GFP 基因表达受抑制，同时RFP 基因表达出红色荧光蛋白，培养温度为30℃时，培
养温度为30°C 时，C 基因编码的C 蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F 基因无法表达出F 蛋白，进而解
除F 蛋白对启动子N 的抑制，使其发生转录促进GFP 基因编码绿色荧光蛋白，所以菌落生长2 天后出现4
个不同的荧光环带颜色为：环带1：红、绿、红、绿，环带2：绿、红、绿，环带3：红、绿，环带4：绿。
24
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
（5）据图分析获知，4HB 由D 酶、E 酶催化合成，3HB 由A 酶、B 酶催化合成，再经X 酶催化合成嵌段
共聚物，要想发酵48 小时， 获得3HB 比例为25%的嵌段共聚物。对方案2 表达载体的改造为：将GFP 基
因替换为A、B 酶基因，RFP 基因替换为D、E 酶基因，加入持续表达启动子连接的X 酶基因构建表达载
体并导入大肠杆菌， 获得工程菌，以葡萄糖为原料配置培养基，灭菌后加入获得的工程菌，将接种后的
培养基在30℃发酵12 小时，随后切换至37℃发酵36 小时，最后分离获取代谢产物。
9．贝氏不动杆菌（A 菌）是一种非致病性细菌，可从环境中吸收DNA 并整合到自身基因组中，此过程被
称为基因水平转移（HGT）。科学家试图利用A 菌的HGT 能力检测结肠癌。
(1)通常用含蛋白胨的培养基培养A 菌，蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成 等物质
（答出2 个即可）。
(2)结肠癌常由KRAS 基因中G12 位点突变导致，科学家以其作为结肠癌检测点。
①如图1 所示，将针对KRAS 基因设计的表达载体导入结肠癌细胞，某种酶能从相同序列特定位点切断
键，修复过程中切口被重新连接，从而实现特定基因片段的替换，获得转基因癌细胞。
②为验证A 菌具有吸收特定DNA 片段的能力，依据①中的原理，构建图2 所示的表达载体，导入A 菌中
获得传感器A。将传感器A 与转基因癌细胞裂解液混合，一段时间后，观察传感器A 在不同培养基中的生
长情况。请从a～e 中选择Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列 。
a．KRAS 片段1
b．KRAS 片段2
c．kanR
d．specR（壮观霉素抗性基因）
e．G12 位点
能证明传感器A 发生特异性HGT 的实验结果是 。
(3)肿瘤细胞可将DNA 释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪
便中的细菌进行培养，观察生长情况。为实现上述目的，需改造A 菌使其仅能降解正常的KRAS 序列，并
对图2 所示表达载体进行进一步改造（如图3）。请分析其能检测出结肠癌的机理 。
25
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【答案】(1)蛋白质、核酸（或ATP 等）
(2) 磷酸二酯 bda 能在含卡那霉素的培养基中形成菌落，不能在含壮观霉素的培养基中形成
菌落
(3)若患有结肠癌，肠腔中存在含突变基因的DNA 片段，会将传感器中的抑制基因替换，从而解除对卡那
霉素抗性基因表达的抑制，使传感器可在同时添加诱导物与卡那霉素培养基中形成菌落
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成蛋白质（元素组成是C、H、O、N
等）、核酸（或ATP 等）（元素组成是C、H、O、N、P）。
（2）①分析题意，该过程的酶能够切断DNA，DNA 的基本单位是脱氧核苷酸，脱氧核苷酸之间通过磷酸
二酯键连接，故该酶作用的位点是磷酸二酯键。
②本次设计的目的是验证A 菌具有吸收特定DNA 片段的能力，需要将G12 位点突变切除，然后再重新连
接，结合图2 启动子方向与图1 的箭头方向可知，该过程中III 对应的应是KRAS 片段1，I 是KRAS 片段
2，两者之间需要插入标记基因，可选择dspecR（壮观霉素抗性基因），故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列是
bda；由于卡那霉素抗性基因被替换，而specR（壮观霉素抗性基因）导入，且A 菌具有吸收特定DNA 片
段的能力，故能证明传感器A 发生特异性HGT 的实验结果是：能在含卡那霉素的培养基中形成菌落，不
能在含壮观霉素的培养基中形成菌落。
（3）肿瘤细胞可将DNA 释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对
粪便中的细菌进行培养，为实现上述目的，需改造A 菌使其仅能降解正常的KRAS 序列，结合图示可知，
26
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
若患有结肠癌，肠腔中存在含突变基因的DNA 片段，会将传感器中的抑制基因替换，从而解除对卡那霉
素抗性基因表达的抑制，使传感器可在同时添加诱导物与卡那霉素培养基中形成菌落。
10．大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工
程菌，期望用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。
(1)科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，如下图。
①利用来自λ 噬菌体的温度敏感型转录抑制因子Tcl42 作为“开关”构建温控抑制元件，在 （选填
“λ 噬菌体”、“大肠杆菌”或“人”）中具强活性的启动子pLac 可以使Tcl42 持续性表达，抑制启动子
pRL；当控温至42℃时才开启特定基因的表达。
②Tcl42 开关仅在加热时瞬时激活特定基因，而免疫疗法需要数周才能见效，所以设计了“基因电路”
——一次短暂的温度激活后可维持长期的基因表达。其核心基因包括重组酶Bxb1 基因、分泌型αPD-L1 蛋
白基因（该蛋白可用免疫治疗）等。
请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线： 及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白
Tcl42 抑制启动子pRL → → 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） → → 解除蛋白Tcl42 对启动子
pRL 的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。
A、重组酶Bxb1 基因不表达 B、菌体升温至42℃时
C、用不同的限制酶、DNA 连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件
D、启动子p7 启动荧光蛋白GFP 基因、αPD-L1 基因的转录
E、重组酶Bxb1 基因表达，进而引起启动子p7 两侧发生重组
(2)科研人员用 处理大肠杆菌，使其处于感受态，从而将“基因电路”质粒导入菌体内，经过培养、
涂布后，筛选 （选项），由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌（EcT）。
A、含有四环素的培养基上形成的菌落 B、具有绿色荧光的菌落
C、同时具有A 和B 特征的菌落 D、具有A 或B 特征的菌落均可
27
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的
温度控制。为验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，选取若干组生理状态相近的小鼠，经过7 天的成瘤建
模后，分别进行如下处理，并检测记录小鼠体内肿瘤体积。
第1 组：注射生理盐水，2 天后FUS 处理；
第2 组：注射温控工程菌，2 天后FUS 处理。请评价并完善实验方案 。
最终证明温控工程菌可被FUS 处理局部激活，并具有持续性肿瘤免疫治疗效果。
(4)若期望将上述温控工程菌用于临床实验，还需利用小鼠开展 方面的研究。
【答案】(1) 大肠杆菌 C A B E D
(2) Ca2+ A
(3)该实验方案无法排除改造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响，应增设温控工程菌在未热
激活状态的对照组
(4)温控工程菌或温控工程菌 +FUS 对哺乳动物重要脏器（肝、肾、神经系统等）的影响；与现行临床药物
相比，效果是否具有优势；温控工程菌在非FUS 处理部位是否有非特异性激活
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因——DNA 分子杂交技术；②检测
目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技
术。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）①“基因电路”的技术路线实验的目的是利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的大
肠杆菌质粒系统，因此，使Tcl42 持续性表达的具强活性的启动子pLac 应该来自大肠杆菌。
②“基因电路”的技术路线要起作用，第一步要构建“基因电路”，因此要先用不同的限制酶、DNA 连接
酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，使这些元件能够连接成“基因电路”；依题意，
当温度不到42℃时具强活性的启动子pLac 可以使Tcl42 持续性表达，抑制启动子pRL，则与其构成一个表
28
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
达单位的重组酶Bxb1 基因不表达 。重组酶的作用位点在免疫元件中，重组酶Bxb1 基因不表达，则αPD-
L1 不表达，免疫元件无功能；当控温至42℃时解除蛋白Tcl42 对启动子pRL 的抑制，重组酶Bxb1 基因表
达，进而引起启动子p7 两侧发生重组，启动子p7 启动荧光蛋白GFP 基因、αPD-L1 基因的转录。从而使
细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。综合以上分析，“基因电路”的技术路线是：C、用不同的限制酶、
DNA 连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白
Tcl42 抑制启动子pRL →A、重组酶Bxb1 基因不表达→ 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） →B、菌体升
温至42℃时→ 解除蛋白Tcl42 对启动子pRL 的抑制→E、重组酶Bxb1 基因表达，进而引起启动子p7 两侧
发生重组→D、启动子p7 启动荧光蛋白GFP 基因、αPD-L1 基因的转录→细菌合成GFP，并分泌大量αPD-
L1。
（2）在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先
用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后将“基因电
路”质粒导入菌体内。依题意，重组的质粒中带有抗四环素的抗性基因，因此，可含有四环素的培养基来
筛选含重组质粒的受体细胞，能在该培养基上形成的菌落就是成功构建用于免疫治疗的温控工程菌菌落，
A 符合题意，BCD 不符合题意。
故选A。
（3）依题意，该实验的目的是验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，但若按照题意实验，则无法排除改
造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响，因此，应增设一组温控工程菌在未热激活状态的对
照组。
（4）若期望将上述温控工程菌用于临床实验，则还要检验工程菌的优势、作用效果、安全性等方面的影
响实验。因此，还需利用小鼠开展温控工程菌或温控工程菌 +FUS 对哺乳动物重要脏器（肝、肾、神经系
统等）的影响；与现行临床药物相比，效果是否具有优势；温控工程菌在非FUS 处理部位是否有非特异性
激活方面的研究。
29
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
30
