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专题05 生物技术与工程模块
1.发酵技术、细胞工程、胚胎工程的命题多以选择题呈现，基因工程的命题多以简答题呈现。
2.试题情境以下列几种居多：(1)以单克隆抗体为情境考查细胞工程。
(2)以胚胎移植为情境考查胚胎工程。
(3)最新的文献资料为情境考查基因工程。
1、（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀
粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问
题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
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(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
2、（2022·辽宁·高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N 蛋白胞外段，制备相应的
单克隆抗体，增加其对N 蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N 蛋白胞外段抗原制备，流程如图1
(1)构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 。用脂质体将重
组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 （填“双分子层中”或“两
层磷脂分子之间”）。
(2)质粒在包装细胞内组装出由 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化
N 蛋白胞外段。
Ⅱ．N 蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2
(3)用N 蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用 酶处理，制成细胞悬液，置
于含有混合气体的 中培养，离心收集小鼠的B 淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
(4)用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96 孔板，进行 培
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养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N 蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂
交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集 ，提取单克隆抗体。
(5)利用N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成 ，实现特异性治疗。
3、（2021·辽宁·高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫
颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小为
0．9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR 反
应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入 和
两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，可选用 （填
“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
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(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞周期
（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是
将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
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1．某科研团队以一种对四环素有抗性的天然大肠杆菌作为受体，通过转基因技术获得了一种大肠杆菌工
程菌，可作为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”。其监测原理如图1 所示。天然大
肠杆菌不具备图1 中所示基因。
回答下列问题：
(1)在上述研究中，必须导入天然大肠杆菌的基因有 （填写编号）。
①四环素合成基因②RNA 聚合酶基因③TetR 基因④GFP 基因
(2)据图1，当环境中含四环素时，成功构建的大肠杆菌工程菌 （填“能发出”或“不发
出”）绿色荧光，该过程的机制为 。
(3)图2 表示2 个DNA 片段、质粒及其上的限制性内切核酸酶的识别序列的分布情况；其中质粒上的Ampr
代表青霉素抗性基因。
下表为相关限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点。
限制酶
EcoRI
XbaI
SpeI
BamHI
识别序列及切割位点
5'-G↓AATTC-3'
3'-CTTAA↑G-5'
5'-T↓CTAGA-3'
3'-AGATC↑T-5'
5'-A↓CTAGT-3'
3'-TGATC↑A-5'
5'-G↓GATCC-3'
3'-CCTAG↑G-5'
若要拼接DNA 片段1 和2，结合图2 和表中信息，应使用 和 分别切割DNA 片段1 和
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2，成功拼接的位点处碱基序列可以表示为 （填编号）。
编号
①
②
③
④
拼接位点处的碱基序列
5'-TCTAGT-3'
3'-AGATCA-5'
'5'-TCTAGA-3'
3'-AGATCT-5'
5'-ACTAGT-3'
3'-TGATCA-5'
5'-ACTAGA-3'
3'-TGATCT-5
(4)下列操作可用于证明重组质粒和大肠杆菌工程菌构建成功的方法及现象有_________。
A．转化后的大肠杆菌可以在含青霉素的培养基上生长
B．通过琼脂糖凝胶电泳证明重组质粒的大小符合预期
C．不同浓度的四环素溶液中大肠杆菌的荧光强度不同
D．显微观察重组质粒上的外源DNA 片段的核苷酸序列
2．为研究干旱胁迫基因LEA 和VOC 对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。
其中基因LEA 与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，基因VOC 和标记基因构建成基因表达载体
乙，相关序列及酶切位点如图所示。箭头表示转录方向。
(1)利用PCR 扩增LEA 基因时，需要在引物的 （填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，
添加序列对应的限制酶是 ，若产物中除了目的基因外有其他DNA 片段存在，从引物角度考
虑，原因可能是 。
(2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR 扩增仪中加入的引物的碱基序列为5'-
-3'和5' -3'。基因表达载体中启动子的作用是 。
(3)常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入Ti 质粒的
上，经过转化作用，进入油菜细胞，并将其插入 ，从而使其得以维持稳定和表达。
(4)乙酰-CoA 羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解
过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞培养成转基因植物A、B，在干旱胁迫的环
境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC 和ATGL 基因的表达水平，结果如下图。
正常植株
转基因A 植株
转基因B 植株
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AC 酶
ATGL 酶
①在分子水平上，用 方法检测AC 酶和ATGL 酶的含量可得到上述表格结果。
②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA 和VOC 在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是 。
3．干扰素（IFN）是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上广泛用于治疗病毒感染性疾病。传统
生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取，每300L 血液只能提取出1mg 干扰素。科学家利用基因
工程的方法从酵母菌中获得干扰素，每1kg 培养物可以获得20-40mg 干扰素。下图表示重组人干扰素相关
的生产过程及相关限制酶识别序列。注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，甲序列可以合成信号肽引导核糖
体附着到内质网上。
限制酶种类
Mun I
Sal I
EcoR I
BamH I
Xho I
切割位点（5＇-3
＇）
C↓AATTG
G↓TCGAC
G↓AATTC
G↓GATCC
C↓TCGAG
(1)从产生干扰素的细胞中提取出总RNA，通过 获得相应的cDNA。
(2)为了能顺利与质粒A 构建基因表达载体，在对干扰素基因进行PCR 扩增时，需在引物 （a 或b）的
5’端添加限制酶 的切割位点，在需在引物 （c 或d）的5’端添加限制酶 的切割位点。
(3)将基因表达载体导入酵母菌前先导入大肠杆菌的目的是 。
(4)⑤用于发酵前，需先对菌种进行筛选，培养基中不需要添加的成分包括___。
A．无机盐
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B．琼脂
C．组氨酸
D．碳源
E．氨苄青霉素
4．草甘膦是一种非选择性除草剂，杀死杂草的同时也杀死农作物。它与植物体内的PEP（磷酸烯醇式丙酮
酸）结构相似，可与PEP 竞争结合EPSP 合酶，阻止PEP 转化，影响植物细胞正常代谢。我国科学家从草
甘膦施用土壤中的微生物体内获取草甘膦抗性基因GR29，并将其导入大豆体细胞中获得抗草甘膦的转基
因大豆。
(1)结合上述信息推测GR29 发挥抗草甘膦作用的途径可能是GR29 表达的产物 （答出1
点即可）。
(2)将GR29 导入大豆细胞前，需将其与酶切后的质粒P 连接获得 。因GR29 基因序列两端无所需的
限制酶切位点，图1 与引物1 互补的为基因的非模板链，据图推测扩增该基因时需向引物1 和引物2 的5′
端分别加上 限制酶的识别序列。
(3)荧光定量PCR 技术可实现对转基因大豆中目的基因的定量检测。在PCR 反应体系中，加入的荧光探针
与模板DNA（目的基因）的某条链互补结合，当合成的子链延伸至探针处，探针被酶切降解，此时荧光监
测系统就会接收到荧光信号，具体原理如图2 所示。
①若样品中不含模板DNA，则实验现象是 。荧光达到某一特定强度所需的循环次数越 ，模
板DNA 含量越高。
②通过上述技术定量检测目的基因，需从设计的多对引物和多种探针中选择特异性最好的组合，为此需进
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行多组实验，每个实验组需向反应体系中加入转基因大豆的DNA 模板外，还需加入 。（填字母）
a、足量的待测引物
b、定量的待测引物
c、定量的待测荧光探针
d、耐高温的DNA 聚合酶
e、解旋酶
h、足量的脱氧核苷酸（dNTP）
③预期随时间变化，荧光强度达到一定值后将不再增加，这是由于 （答出2 点即可）。
5．人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。
下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程（图中Tetr表示四环素抗性基因， Ampr
表示氨苄青霉素抗性基因），五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NotⅠ
识别序列及切割位点
(1)要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是 。基因工程技术
中通常选择 种限制酶进行酶切。
(2)人乳铁蛋白基因可利用PCR 技术进行扩增，扩增需要引物 （在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选
择），连续扩增5 次后至少需要引物 个。
(3)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要再含有 （填“四环素”或“氨苄
青霉素”）的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用 工程技术获
得转基因小牛。
(4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用 技术，若 ，则表明目的基因已翻译形
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成蛋白质。
(5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是 。
6．与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，从而导致可溶性糖含量高，汁多质脆，
研究发现这与甜玉米G 蛋白含量较高有关。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G 蛋白
的转基因甜玉米新品种。在超量表达G 基因载体的构建中，所用DNA 片段和Ti 质粒的酶切位点如图1、2
所示。
(1)图1 中，强启动子是一段在特殊序列结构的DNA 片段。位于基因的 驱动基因持续转录，该转录
过程中模板链的5’端位于 （填“M”或“N”）端。
(2)图2 所示载体为农杆菌的Ti 质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的 转移到被侵染
的细胞，并且将其整合到 。
(3)结合图1 和图2，为使DNA 片段能定向插入Ti 质粒中，可用PCR 技术在DNA 片段的两端添加限制酶识
别序列，M、N 端添加的序列分别是限制酶 的识别序列。
(4)外植体经脱分化过程形成的愈伤组织放入农杆菌液（含重组Ti 质粒）浸泡后，进行植物组织培养时培养
基中需加入 进行筛选，最终获得玉米植株Y1、Y2、Y3.通过对3 个植株的G 蛋白表达量和还原
糖的含量进行测定，发现Y3 植株的G 蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，原因可能是
。
(5)下图为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA 需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后
方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将
吗啉反义寡核苷酸（RNA 剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制
提出一种假说：吗啉反义寡核苷酸可能导致RNA 前体上内含子1 和外显子2 的对应序列同时被剪切，而不
是内含子1 对应序列被单独剪切。（外显子：基因中编码蛋白质氨基酸的片段。内含子：基因中不编码蛋
白质氨基酸的片段。）
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为证明该假说，设置两组实验，一组玉米受精卵中导入吗啉反义寡核苷酸，另一组不导入。提取两组受精
卵中的RNA，逆转录合成DNA（即cDNA）：
①以cDNA 为模板，选择图示引物 进行PCR，产物进行电泳鉴定，根据是否有扩增产物及产物大
小判断该假说是否成立。
②若某次电泳结果发现实验组和对照组均没有出现任何条带，从PCR 反应成分的角度分析，
可能的原因是 （至少写出1 点）。
7．“中天杨”是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8 年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品
种。该品种以八里庄杨为实验材料，经转mtl-D 基因培育获得。如图为培育“中天杨”的操作流程，①～
⑥表示操作过程，该过程中可能用到的限制酶如表所示。回答下列问题。
注：Ti 质粒中的 Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。
限制酶
Bcl I
EcoR I
Xba I
Sau3A I
BamHI
切割位点
T↓GATCA
G↓AATTC
T↓CTAGA
↓GATC
G↓GATCC
(1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有 (填序号)。
①操作方法简便 ②目的性强，能定向改造生物性状 ③育种周期短 ④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂
交不亲和障碍 ⑤安全性高，对生态没有威胁
(2)过程①需要的酶是 ，过程②需要的工具是 。
(3)采用PCR 技术扩增目的基因时，在PCR 反应体系中需加入引物，引物的作用是 ，至
少经过 次循环，可获取与目的基因等长的DNA 单链。PCR 完成以后，常采用 法来鉴
定PCR 的产物。
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(4)培育转基因杨树的核心工作是 ，在进行该工作时，应在mtl-D 基因的两侧添加限制酶
的识别序列。
(5)将目的基因导入受体细胞除图示方法外，我国科学家还独创了一种方法是 。为了确认目的基
因在植物细胞中是否成功表达，从分子水平通常使用 法进行检测。
8．大量研究表明，家畜的肉类产量与肌生长抑制素（MSTN）基因有关，MSTN 蛋白在体内主要调控骨骼
肌的生长发育。多种动物研究已经证实，敲除基因MSTN 可以显著增加动物的肌肉质量。科研人员希望利
用CRISPR/Cas9 基因编辑系统获得敲除了基因MSTN 的家禽。请回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 基因编辑系统原理如图1，Cas9 酶可催化DNA 分子的断裂，实现对目的基因的特异性切
割，在切割过程中破坏的化学键是 。图中向导RNA 的作用是定向引导Cas9 蛋白与靶向基因
结合，其原理是 。
(2)科研人员希望在鸡胚细胞中表达CRISPR/Cas9 基因编辑系统，构建的基因表达载体如图2。
①在对向导RNA 对应的DNA 片段进行PCR 扩增时，需要在其两端分别添加限制酶 、
的识别序列。
②用①中限制酶切割质粒和向导RNA 对应的DNA 片段，选择这种酶切方式的目的是 。
③基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要连接的DNA 片段是 。
(3)将鸡胚分为三组并提取DNA，用图2 中的引物Ⅰ和引物Ⅱ进行PCR 扩增，并对PCR 结果进行电泳检测，
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结果如图3。
1 组电泳的结果小于2 组，其原因是 。3 组电泳无结果，其原因是 。
9．东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。
研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活
性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。
(1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，
配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用 法将酸菜液接种到培养基
中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。
(2)通过上述方法筛选得到6 种乳酸菌，测得它们对霉菌的抑菌率如下表，应选择乳酸菌编号为 的菌
株进行后续操作。
乳酸菌编
号
Ll
L2
L3
L4
L5
L6
抑菌率/%
28．57
19．48
58．44
14．
28
6．49
36．36
(3)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。下面
是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。
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①利用PCR 技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 。PCR 过程中，经过4 轮循环，消耗引物
的个数是 。
②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的5＇端加入
（填“BamH I”或“Nde I”）的识别序列。
③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如
下图。
1：DNA 标准样
2：普通受体菌的DNA
3：转化操作后受体菌的DNA
4：无菌水
设置4 号的目的是 （答出1 点即可），电泳结果表明 。
10．当蚊子叮咬时，它会将唾液中一种叫做anophelins 的蛋白质（一种抗凝血因子）注入宿主体内，让血
液更自由地流动。长期以来，研究人员一直试图利用疟蚊创造人用新型血液稀释剂。回答下列问题：
(1)蚊子产生的anophelins 蛋白对于人体来说是异物，免疫系统会对其进行攻击，发生免疫反应，这体现了
免疫系统的 功能
(2)为获取anophelins 基因，需提取蚊子 的总RNA，再经逆转录过程得到DNA，将其作为PCR
反应的模板。并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
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(3)构建基因表达载体时、若科研人员需将anophelins 基因整合到质粒上， 如上图，应使用限制酶
切割如图中含anophelins 基因的DNA 片段，使用限制酶 切割图中质粒，以获得能正确表达的重
组质粒。
(4)目的基因通过表达载体导入大肠杆菌，提取来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA 并用适当的限制酶
（如BamHI） 切割， 经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 片段长度。这一操作的目的是 。
(5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产anophelins 蛋白更具有优势。其理由是 。
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